III.

ISOLASI DNA DAUN DENGAN MEMAKAI GENOMIK DNA MINIKIT

Nama Mahasiswa : Mutia Musdalifah Tuasalamony

NIM : 2017 76 048

Kelompok : IV

Hari/Tgl/Bln/Thn : Kamis, 18 Oktober 2018

Tujuan Praktikum :

o Mahasiswa terampil dalam mengekstrak/mengisolasi DNA dari

daun dengan menggunakan genomik dna minikit.

Alat dan Bahan :

Alat :

o Mikropipet P100, P5000 + tip

o Gunting
o Timbangan
o Alu
o Lumpang
o Pinset
o Spatula
o Tube Ependrof 1,5 ml
o Stopwatch
o Waterbath
o Sentrifuge
o Sentrifuge Tube
o Refrigerator
o Alat tulis
o Genomik DNA Minikit, yang alatnya terdiri atas :
 Filter Column
 GD Column
 2 ml Collection Tube

Bahan :

o Isopropanol Dingin
o Ethanol
o Es kristal
 o Kertas Label
o Genomik DNA Minikit, yang bahannya terdiri atas :
 GP1 Buffer
 GP2 Buffer
 GP3 Buffer (+ Isopropanol)
 W1 Buffer
 Wash Buffer
 Elution Buffer
 Rnase A (10 mg/ml)

Prosedur Kerja :

Langkah 1

Diasosiasi Jaringan

 Timbang 100 mg daun cili yang telah dibekukan semalam.

 Potong kecil-kecil daun tersebut dan masukkan ke dalam lumpang.
 Giling daun cili tersebut sampai halus dan pindahkan ke dalam 1,5 ml dengan
menggunakan spatula yang sudah disterilisasi , kemudian masukkan ke dalam
mikrosentrifuge tube dengan memakai pinset.
 Tambahkan 400 µl GP1 buffer dan 5 µl Rnase A ke dalam tube sampel dan
campurkan dengan cara memvortex.
 Inkubasi tabung tersebut dalam water bath pada 60° selama 10 menit. Selama
inkubasi, tube tersebut dibolak balik setiap 5 menit.

Langkah 2

Lisis

 Panaskan elution buffer yang diperlukan (200 µl per sampel) di dalam water
bath yang bersuhu 60 °C. Tinggalkan buffer ini untuk nantinya digunakan
pada langkah ke –lima (Elusi DNA).
 Pada tube sampel (Hasil langkah 1), tambahkan 100 µl GP2 buffer dan
campurkan dengan cara memvortex tabung tersebut, kemudia tabung tersebut
diinkubasi pada es kristal selama 3 menit.
 Letakkan sebuah ‘filter column’ di dalam sebuah ‘2 ml collection tube’.
Ambil tube sampel yang sedang diinkubasi pada es kristal, kemudian
pindahkan cairan di dalam tube tersebut ke dalam ‘filter column’ dengan
menggunakan pinset.
 Sentrifuge ‘2 ml collection tube’ yang berisi ‘filter column’ selama 1 menit
pada 1000 xg, kemudian ‘fiter column’ tersebut diambil dan dibuang.
 Dengan hati-hati supernatan yang berda pa ‘collection tube’ dipindahkan ke
1,5 ml micro centrifuge tube or tube ependrof yang baru.
 Tambahkan 1,5 volume dari GP3 buffer dan kemudian segera vortex tube
tersebut selama 5 detik. Kelompok IV, jumlah supernatan yaitu 400 µl maka
GP3 buffer yang ditambahkan 600 µl.
 Catat tiap hasil praktikum pada kertas HVS.

Langkah 3

Peengikatan DNA

 Letakkan sebuah GD Column di dalam sebuah ‘2 ml collection tube’.

 Transfer 700 µl dari campuran (hasil lisis pada langkah 2), termasuk di
dalamnya semua endapan, ke dalam GD column.
 Sentrifuge pada 16000 xg slama 2 menit.
 Angkat GD column dan buang supernatan yang berada di dalam ‘2 ml
collection tube’, kemudian letakkan kembali GD column di dala ‘2 ml
collection tube’ seperti semula.
 Tambahkan sisa campuran hasil lisis ke dalam GD column kemudian
sentrifuge pada 16000 xg selama 2 menit.
 Angkat GD column, buang supernatan yang terdapat pada ‘2 ml collection
tube’, kemudian letakkan kembali GD column ke dalam ‘2 ml collection tube’
tersebut.
 Tambahkan 400 µl W1 buffer pada GD column, kemudian sentrifuge pada
16000 xg selama 30 detik.
 Angkat GD column, buang supernatan yang terdapat pada ‘2 ml collection
tube’, kemudian letakkan kembali GD column ke dalam ‘2 ml collection tube’
tersebut.

Langkah 4

Pencucian
 Tambahkan 600 µl Wash buffer ke dalam GD column, kemudian sentrifuge
pada 16000 xg selama 30 detik.
 Angkat GD column, buang supernatan yang terdapat pada ‘2 ml collection
tube’, kemudian letakkan kembali GD column ke dalam ‘2 ml collection tube’
tersebut.
 Sentrifuge selama 3 menit pada 16000 xg untuk mengeringkan matriks
kolom.
 Amati apakah masih ada pigmen yang terdapat pada GD column atau tidak.
 Jika masih ada pigmen yang terdapat pada GD column, maka lakukan langkah
berikut :
- Tambahkan 400 µl absolut ethanol di dalam GD column, dan
sentrifuge pada 16000 xg selama 30 detik.
- Angkat GD column, buang supernatan yang terdapat pada ‘2 ml
collection tube’, kemudian letakkan kembali GD column ke dalam ‘2
ml collection tube’ tersebut.
- Sentrifuge selama 3 menit pada 16000 xg untuk mengeringkan matriks
kolom.

Langkah 5

Elusi DNA

 Transfer GD column yang telahh kering ke dalam sebuah 1,5 micro

centrifuge tube’ atau ‘tube ependrof’ yang baru.
 Tambahkan 100 µl elution buffer yang telah dipanaskan pada langkah ke-2
(Lisis) pada bagian tengah matriks kolom.
 Biarkan selama 5 menit untuk menjamin bahwa elution buffer telah
diabsorp dengan sempurna.
 Sentrifuge pada 16000 xg selama 30 detik.
 Cairan yang terdapat pada ‘1,5 ml micro centrifuge tube’ adalah DNA daun
cili yang telah dipurifikasi. Tutup tube tersebut dan beri nama dengan kertas
label.
 Dokumentasikan hasil praktikum termasuk foto tube yang berisi DNA
tersebut untuk dimuat dalam laporan praktikum.
Pertanyaan dan Jawaban Pertanyaan :

1. Pertanyaan : Mengapa DNA harus diisolasi sebelum digunakan?

Jawab : Karena tujuan dari isolasi DNA adalah untuk memisahkan
DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat sehingga DNA mudah
untuk dilihat karena telah terjadi p r o s e s p e r u s a k a n a t a u p e n g h a n c u r a n
membran dan dinding terlebih dulu. Sederhananya DNA difilter sehingga
dapat mengeluarkan bagian – bagian sel atau garam yang mengendap. Prinsip utama
dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA
dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA ada beberapa hal
yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan
DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan
bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah
struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

2. Pertanyaan : Apa kelebihan isolasi DNA yang menggunakan KIT dari

isolasi DNA yang tidak menggunakan KIT?

Jawab : Berdasarkan praktikum isolasi DNA daun menggunakan

metode KIT kelebihan yang didapatkan yaitu sangat memudahkan praktikan saat
 praktikum isolasi DNA karena semua alat dan bahan yang digunakan tidak rumit.
Dalam praktikum ini, berdasarkan hasil dari isolasi DNA yang diperoleh, pellet DNA
yang dihasilkan lebih banyak , waktu isolasi yang dibutuhkan pun tidak lama, bahan-
bahan yang digunakan hanya sedikit dan mudah dalam penanganannya tanpa
dilakukan penggocokan manual namun hanya butuh diinkubasi dan disentrifuse
beberapa kali saja dimana fungsi dari inkubasi adalah untuk mengoptimalisasi kerja
enzim pada saat penambahan Wash Buffer untuk menghilangkan kontaminasi serta
penambahanElution buffer, etc kemudian disentrifugasi untuk mendapatkan pellet
murni.

Metode ini tidak membutuhkan waktu yang lama untuk menghasilkan pellet
DNA dalam waktu yang cepat karena setiap prosesnya hanya ditambahkan bahan-
bahan yang kualitasnya bagus sehingga kegagalan saat isolasi DNA sangat kecil
karena DNA yang diharapkan dapat dihasilkan dalam bentuk pellet DNA yang dilihat.

Sederhananya Penggunaan KIT dalam isolasi DNA sel tumbuhan seperti

yang dilakukan pada raktikum ini, yaitu, Genomik DNA Minikit pada DNA daun Cili
terbukti lebih praktis dan menghasilkan molekul DNA dalam jumlah yang banyak dan
dalam waktu yang lebih singkat

3. Pertanyaan : Apa fungsi semua buffer yang dipakai dalam isolasi DNA
yang anda kerjakan?

Jawab : Fungsi buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama

proses penghancuran dan purifkasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan
protein dan DNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah
perubahan pada molekul DNA. konsentrasi dan pH dari buffer yang digunakan harus
berada dalam rentang pH 2 sampai 10.

Tabel 1. Fungsi Larutan Buffer

Larutan
No Langkah Kerja Fungsi
buffer
1. Diasosiasi Jaringan untuk melisiskan sampel tanaman yang
GP1 buffer
mengandung banyak polisakarida.
RNAse Untuk mengikat RNA yang termasuk
 dalam pengotor
GP2 buffer sebagai buffer penetral,
2. Lisis
GP3 buffer mengikat DNA ke buffer
Untuk menghilangkan sisa-sisa protein
3. Pengikatan DNA W1 buffer
yang menempel pada DNA
Mnghilangkan kontaminasi atau untuk
4. Pencucian Wash buffer mencuci garam-garam buffer
sebelumnya
5 Elusi DNA Elution buffer Untuk melepaskan DNA dari membran

LAPORAN PRAKTIKUM
BIOLOGI MOLEKULER SEL

Tentang
“ ISOLASI DNA DAUN DENGAN MEMAKAI GENOMIK DNA MINIKIT ”

Oleh :

Nama : Mutia Musdalifah Tuasalamony

NIM : 2017-76-048
Kelompok : IV
 Nama Asisten : Jecklyn Shindy Temartenan,S.Si

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PATTIMURA
AMBON
2018

Dokumentasi :

N
Prosedur Kerja Gambar Keterangan
o
1. Diasosiasi
Jaringan