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[ESTUDO DA CINÉTICA DA ENZIMA INVERTASE] Bioquímica I

Índice

1. Objectivo ........................................................................................................................................... 3

2. Introdução ......................................................................................................................................... 3

3. Material e Reagentes ......................................................................................................................... 5


3.1. Reagentes ............................................................................................................................................... 5
3.2. Material ................................................................................................................................................. 6

4. Procedimento Experimental ............................................................................................................. 6


4.1 Recta de calibração de DNS para o açúcar invertido ............................................................................ 6
4.2 Estudo da variação da actividade da enzima com a concentração do substrato ................................... 7

5. Apresentação e tratamento de resultados ......................................................................................... 8


5.1. Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido ........................................................................... 8
5.2. Traçar o gráfico da actividade da enzima (μmol de “açúcar invertido” formado por minuto, por ml
de extracto de enzima, i.e., velocidade da reacção), em função da concentração de substrato (mol.dm-3) e
calcular KM e vmax (Curva de Michaelis-Menten). ...................................................................................... 10
5.3. Traçar o gráfico de Lineweaver-Burk e determinar os valores de KM e Vmax. ................................. 15

6. Discussão /Conclusão ...................................................................................................................... 17

7. Bibliografia...................................................................................................................................... 19

8. Anexos ............................................................................................................................................. 21
8.1. Anexo 1- Segurança e riscos ................................................................................................................ 21
8.2. Anexo 2- Dedução da equação de Lineweaver-Burk ........................................................................... 22
8.3. Anexo 3- Preparação de soluções ....................................................................................................... 23

Grupo V; PL4 2
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1. Objectivo
O objectivo da actividade experimental é estudar a cinética enzimática invertase num
substrato de sacarose, ou seja, determinar o valor da velocidade máxima e a respectiva
afinidade enzimática para o substrato.

2. Introdução
Com o desenvolvimento da bioquímica fortaleceu-se a ideia de que dentro dos seres vivos,
existiam substâncias capazes de catalisar de modo muito específico determinadas reacções
químicas.3 Uma enzima é um catalisador biológico, que mesmo em baixas concentrações
aumenta a velocidade da reacção.4 As enzimas diminuírem a energia de activação, mas não
afectam o equilíbrio da reacção.4

A invertase (β-fructofuranosidade) é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose em


“açúcar convertido”, isto é, nos seus dois monómeros constituintes: glicose e frutose
(figura 1). 2,5 O seu substrato preferencial é a sacarose porém, também, pode hidrolisar
ramonose e estaquiose.7

Figura 1 - Hidrolise da sacarose catalisada pela invertase. A glicose e a frutose são açúcares redutores.

A invertase encontra-se presente nos animais, mas também em plantas superiores, fungos e
bactérias.5 É possível obter o extracto não purificado da enzima, destruindo as células de
fermento por autólise e removendo os detritos celulares por centrifugação, após a qual a
invertase ficará no líquido sobrenadante.5 Existem actualmente várias aplicações desta
enzima, principalmente na indústria alimentar, onde a enzima usada tem origem na
levedura.2

A cinética enzimática estuda a acção das enzimas, a sua actividade catalítica e seu estudo
é feito in vitro.3 Para esses estudos podem ser usados, como fonte de enzima, preparações
que a contenham em estado mais ou menos purificado, no entanto, quanto mais purificada
estiver a preparação enzimática mais fácil será o seu estudo cinético.3

O mecanismo mais simples para explicar a acção enzimática é o modelo de Michaelis-


Menten:

Neste modelo a enzima (E) liga-se ao substrato (S) para formar um complexo enzima-
substrato (E-S). A quantidade de produto (P) formada, assim como a velocidade da reacção

Grupo V; PL4 3
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vão depender directamente da concentração em complexo E-S, isto é, da concentração de


enzima que se liga ao substrato.4,8

O modelo de Michaelis-Menten parte da hipótese que o passo limitante da velocidade é a


quebra do complexo E-S para formar o produto e a enzima livre.9

(1)

A equação de Michaelis-Menten (equação 1) permite, após a determinação experimental


das variações de V em função da concentração de substrato ([S]), obter o valor de
velocidade inicial máxima (Vmáx), e calcular a constante de Michaelis (Km).4,8 De forma
geral, os valores de Km, estão compreendidos entre 10-2M e 10-8.4,8

A representação gráfica da velocidade da reacção em função da concentração de substrato


(gráfico 1) é uma hipérbole. A assímptota horizontal
corresponde à Vmáx. O valor de Km também pode ser
obtido através do gráfico, uma vez que quando a [S]= Km ,
a equação de Michaelis-Menten prevê que velocidade de
reacção é metade de Vmáx.4,8

Km é uma medida de afinidade da enzima para o substrato


e essa afinidade é igual a 1/ Km.4,8 Para um Km elevado,
Gráfico 1. Variação da velocidade de
existe uma baixa afinidade (é necessária uma elevada [S] reacção em função da concentração de
para se atingir a V igual na 1/2Vmáx, para um Km baixo substrato
existe uma elevada afinidade.4,8

O gráfico de velocidade vs [S] mostrado anteriormente não é linear, pelo que se torna
difícil estimar os valores de Km e Vmáx , sendo assim necessário desenvolver métodos de
linearização da equação de Michaelis-Menten. . Podemos transformar a equação de
Michaelis-Menten, invertendo-a:
(2)

O gráfico de Lineweaver-Burk (gráfico 2) é a forma mais comum, e simples, de mostrar


os dados cinéticos, apesar de não ser o mais fiável.

Como se pode observar pelo gráfico 2, não se podem tomar


valores negativos para 1/[S], sendo o mínimo valor possível é
1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentração infinita de
substrato, e daí 1/v = 1/Vmax. O valor do ponto de intersecção
entre a recta e o eixo x é uma extrapolação de dados
experimentais. Assim sendo, os gráficos de Lineweaver-Burke
distorcem as medidas realizadas a baixas concentrações de
substrato e isto pode dar lugar a estimativas não muito exactas de Gráfico 2. Gráfico de
Lineweaver-Burk.
Vmax e de Km.10

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3. Material e Reagentes
3.1. Reagentes

Tabela 1- Características gerais dos reagentes utilizados


Massa
Fórmula Grau de Densidade Riscos e
Reagentes Molar
Química Pureza (%) (g/cm3) Segurança1
(g/mol)
Solução
Hidrogeno-
aquosa de
carbonato de NaHCO3 84,01 99,5 2,159 -
invertase
sódio
diluída 1:400

Hidróxido de
NaOH 39,997 98,6 2,13 Corrosivo
Sódio
R: 35
S: 2-26-37/39
Ácido 3,5-
dinitrosalicílic Ácido 3,5-
C7H4N2O
o (DNS) dinitrosalicílico 228,12 99 -
7 Nocivo
(DNS) R: 22
S: 22-24/25
Tartarato de sódio
C4H4KNa
e potássio 282,23 99-102 - -
O6.4H2O
tetrahidratado

Irritante

CH3COO
Acetato de sódio 82,03 99 1,52
Na

Tampão Corrosivo
acetato R: 36/37/38
S: 16-29/56

Ácido Clorídrico
HCl 36,46 37 1,19 Corrosivo
(37%)
R: 34-37
S: 26-45
Solução de C12H22O
Sacarose 342, 30 - 1,587 -
sacarose 11
Solução Frutose C6H12O6 180,16 - 1,54 -
equimolar de
glucose/frutose Glucose C6H12O6. 180,16 99,5 -

Água Destilada - H20 18,02 - 1 -

1
Anexo 1
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3.2. Material

 Tubos de ensaio  Banho com água 100°C


 Suporte para tubos de ensaio  Banho com água fria
 Micropipetas  Espectrofotómetro
 Pipetas graduadas  Cronómetro
 Pipetador  Placa de aquecimento
 Vórtex  Pompete

4. Procedimento Experimental
4.1 Recta de calibração de DNS para o açúcar invertido
Para a construção da recta de calibração preparar 5 tubos de ensaio de acordo com a
tabela 1.
Tabela 2- Preparação de soluções
Tubo1
Vsol (mL) Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
(branco)
Gluc/frut 1,00
0,00 0,10 0,40 0,70 Perfazer com
0,0025M
água destilada
H2O dest. 2,00 1,90 1,60 1,30 1,00 o volume total
de 2 ml
Tampão
1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
acetato
Sacarose
1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
0,25M

DNS 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00

Agitar no vórtex.

Aquecer os tubos num banho com água a 100°C durante 5 minutos exactos.

Arrefecer num banho com água fria.

Adicionar 4mL de água destilada a cada tubo e agitar no vórtex.

Vsol (mL) Tubo1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5


(branco)
H2O dest. 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

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Ler absorvância a 540 nm (Calibrar com tubo 1).

4.2 Estudo da variação da actividade da enzima com a concentração do substrato

Para o estudo da actividade enzimática preparar 7 tubos de ensaio de acordo com a


tabela 2.

Tabela 3- Preparação de soluções

Vsol (mL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7

Sacarose 1,60
0,00 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80
0,25M Perfazer com
água destilada
H2O dest. 2,00 1,95 1,90 1,80 1,60 1,20 0,40
o volume total
Tampão de 2 ml
1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
acetato

Incubar a 25°C durante 5 minutos.

Em intervalos de 60s adicionar.

Vsol (mL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7

Enzima
1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
1:400

Agitar no vórtex.

Incubar a 25°C durante 10 minutos exactos.

Em intervalos de 60s adicionar.

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Vsol (mL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7

DNS 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00

Agitar no vórtex.

Aquecer em banho com água a 100°C durante 5 minutos exactos.

Arrefecer em banho de água fria.

Adicionar 4mL de água destilada e agitar no vórtex.

Tubo1
Vsol (mL) Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
(branco)

H2O dest. 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

Ler absorvância a 540 nm (usar tubo 1 como branco).

5. Apresentação e tratamento de resultados

5.1. Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido

 [solução equimolar de glicose/frutose] (M)

[solução]conc. = 0,0025M
Vfinal = 10mL

 Tubo 2
Vinicial 2 = 0,10mL
[solução]tubo 2 = ?

𝑛𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 = 𝑛𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 ⇔
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑐𝑜𝑛𝑐. × 𝑉𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 2 = [𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜2 × 𝑉𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 ⇔

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0,0025𝑀 × 0,1𝑚𝐿
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜2 = ⇔
10𝑚𝐿
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜2 = 2,5 × 10−5 𝑀 ⇔ [𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜2 = 0,025 × 10−3 𝑀

 Tubo 3
Vinicial 3 = 0,40mL
[solução]tubo 3 = ?

𝑛𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 = 𝑛𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 ⇔
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑐𝑜𝑛𝑐. × 𝑉𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 3 = [𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜3 × 𝑉𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 ⇔
0,0025 𝑀 × 0,40 𝑚𝐿
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜3 = ⇔
10 𝑚𝐿
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜3 = 2,5 × 10−5 𝑀 ⇔ [𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜3 = 1,0 × 10−4 𝑀

 Tubo 4
Vinicial 4 = 0,70mL
[solução]tubo 4 = ?

𝑛𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 = 𝑛𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 ⇔
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑐𝑜𝑛𝑐. × 𝑉𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 4 = [𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜4 × 𝑉𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 ⇔
0,0025 𝑀 × 0,70 𝑚𝐿
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜4 = ⇔
10 𝑚𝐿
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜4 = 2,5 × 10−5 𝑀 ⇔ [𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜4 = 1,75 × 10−4 𝑀

 Tubo 5
Vinicial 5 = 1,0mL
[solução]tubo5 = ?

𝑛𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 = 𝑛𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 ⇔
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑐𝑜𝑛𝑐. × 𝑉𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 5 = [𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜5 × 𝑉𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 ⇔
0,0025 𝑀 × 1,0 𝑚𝐿
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜5 = ⇔
10 𝑚𝐿
[𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜5 = 2,5 × 10−5 𝑀 ⇔ [𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜]𝑡𝑢𝑏𝑜5 = 2,5 × 10−4 𝑀

Grupo V; PL4 9
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Tabela 4 – Registo de resultados com os dados necessários á construção da recta de calibração do DNS
para o açúcar invertido

[solução equimolar de
Tubo Vsolução equimolar de glicose/frutose Absorvância
glicose/frutose]
1 - Branco 0 0 0
2 0,1 0,000025 0,005
3 0,4 0,0001 0,134
4 0,7 0,000175 0,293
5 1 0,00025 0,433

Recta de calibração do DNS para o açucar


invertido
0.500
Absorvância (nm)

0.400
0.300
0.200
y = 1801.2x - 0.0251
0.100 R² = 0.9904
0.000
0.0000 0.0001 0.0002 0.0003
concentração equimolar de glicose /frutose (M)

Gráfico 3 – Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido

5.2. Traçar o gráfico da actividade da enzima (μmol de “açúcar invertido”


formado por minuto, por ml de extracto de enzima, i.e., velocidade da reacção),
em função da concentração de substrato (mol.dm-3) e calcular KM e vmax (Curva
de Michaelis-Menten).

5.2.1. Cálculos necessários à construção da curva Michaelis-Menten

 Cálculo da concentração de açúcar invertido após os 10 minutos de incubação


com a enzima

Pela lei Lambert-Beer, a absorvância em função da concentração deve ser uma linha
recta, logo existe uma relação entre a lei e a equação da recta.

y=m.x+b

A= Ɛ.l.c
Grupo V; PL4 10
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Este cálculo é feito com base na recta de calibração do gráfico 3 e com as absorvâncias
medidas experimentalmente substituindo-as na equação obtida:

𝒚 = 𝟏𝟖𝟎𝟏, 𝟐𝒙 − 𝟎, 𝟎𝟐𝟓𝟏
 Tubo 2
0,003 + 0,0251
[𝑔𝑙𝑢𝑐/𝑓𝑟𝑢𝑡] = = 1,560 × 10−5 𝑀
1801,2

 Tubo 3
0,022 + 0,0251
[𝑔𝑙𝑢𝑐/𝑓𝑟𝑢𝑡] = = 2,615 × 10−5 𝑀
1801,2

 Tubo 4
0,213 + 0,0251
[𝑔𝑙𝑢𝑐/𝑓𝑟𝑢𝑡] = = 1,322 × 10−4 𝑀
1801,2

 Tubo 5
0,381 + 0,0251
[𝑔𝑙𝑢𝑐/𝑓𝑟𝑢𝑡] = = 2,255 × 10−4 𝑀
1801,2

 Tubo 6
0,528 + 0,0251
[𝑔𝑙𝑢𝑐/𝑓𝑟𝑢𝑡] = = 3,071 × 10−4 𝑀
1801,2

 Tubo 7
𝑔𝑙𝑢𝑐 0,616 + 0,0251
[ ]= = 3,559 × 10−4 𝑀
𝑓𝑟𝑢𝑡 1801,2

 Cálculo do número de moles de açúcar invertido presentes em solução após os


10 minutos de encubação com a enzima.

 Tubo 2
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 𝑐𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. × 𝑉𝑠𝑜𝑙. ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 1,560 × 10−5 𝑀 × 0,010𝑑𝑚3 ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 1,560 × 10−7 𝑚𝑜𝑙

 Tubo 3
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 𝑐𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. × 𝑉𝑠𝑜𝑙. ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 2,615 × 10−5 𝑀 × 0,010𝑑𝑚3 ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 2,615 × 10−7 𝑚𝑜𝑙

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 Tubo 4
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 𝑐𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. × 𝑉𝑠𝑜𝑙. ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 1,322 × 10−4 𝑀 × 0,010𝑑𝑚3 ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 1,322 × 10−6 𝑚𝑜𝑙

 Tubo 5
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 𝑐𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. × 𝑉𝑠𝑜𝑙. ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 3,071 × 10−4 𝑀 × 0,010𝑑𝑚3 ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 3,071 × 10−6 𝑚𝑜𝑙

 Tubo 6
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 𝑐𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. × 𝑉𝑠𝑜𝑙. ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 2,931 × 10−4 𝑀 × 0,010𝑑𝑚3 ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 2,931 × 10−6 𝑚𝑜𝑙

 Tubo 7
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 𝑐𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. × 𝑉𝑠𝑜𝑙. ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 3,559 × 10−4 𝑀 × 0,010𝑑𝑚3 ⇔
𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 3,559 × 10−4 × 10−6 𝑚𝑜𝑙

 Cálculo da actividade enzimática durante o tempo de encubação (10 minutos)


𝑛𝑎ç𝑢𝑐.𝑖𝑛𝑣. (𝜇𝑚𝑜𝑙)
𝑣=
∆𝑡(𝑚𝑖𝑛. ) × 𝑉𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎(𝑚𝐿)

A enzima encontrava-se diluída 1:400, pelo que para a realização do cálculo da


actividade enzimática tem de entrar em linha de conta esse factor de diluição. Assim:

𝑛𝑎ç𝑢𝑐.𝑖𝑛𝑣.
𝑣=
𝑉
∆𝑡 × 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
400
 Tubo 2
1,560 × 10−7 × 106 𝜇𝑚𝑜𝑙
𝑣= ⇔ 𝑣 = 6,240 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 . 𝑚𝐿−1
1𝑚𝐿
10𝑚𝑖𝑛 × 400

 Tubo 3
2,615 × 10−7 × 106 𝜇𝑚𝑜𝑙
𝑣= ⇔ 𝑣 = 10,460 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 . 𝑚𝐿−1
1𝑚𝐿
10𝑚𝑖𝑛 × 400
Grupo V; PL4 12
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 Tubo 4
1,322 × 10−6 × 106 𝜇𝑚𝑜𝑙
𝑣= ⇔ 𝑣 = 52,876 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 . 𝑚𝐿−1
1𝑚𝐿
10𝑚𝑖𝑛 ×
400

 Tubo 5
2,255 × 10−6 × 106 𝜇𝑚𝑜𝑙
𝑣= ⇔ 𝑣 = 90,184 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 . 𝑚𝐿−1
1𝑚𝐿
10𝑚𝑖𝑛 × 400

 Tubo 6
3,071 × 10−6 × 106 𝜇𝑚𝑜𝑙
𝑣= ⇔ 𝑣 = 122,829 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 . 𝑚𝐿−1
1𝑚𝐿
10𝑚𝑖𝑛 × 400

 Tubo 7
3,559 × 10−6 × 106 𝜇𝑚𝑜𝑙
𝑣= ⇔ 𝑣 = 142,372 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 . 𝑚𝐿−1
1𝑚𝐿
10𝑚𝑖𝑛 ×
400

Tabela 5 – Dados utilizados para construção da curva de Michaelis-Menten

[Açúcar n açúcar Activ. Enz


Tubo V Sac (mL) [Sac] (M) Absorvância
Invertido] invertido (μmol.min-1mL-1)
Branco 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2 0,05 1,25E-03 0,003 1,560E-05 1,560E-07 6,240
3 0,10 2,50E-03 0,022 2,615E-05 2,615E-07 10,460
4 0,20 5,00E-03 0,213 1,322E-04 1,322E-06 52,876
5 0,40 1,00E-02 0,381 2,255E-04 2,255E-06 90,184
6 0,80 2,00E-02 0,528 3,071E-04 3,071E-06 122,829
7 1,60 4,00E-02 0,616 3,559E-04 3,559E-06 142,372

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5.2.2. Construção do gráfico da curva de Michaelis-Menten

Activ. Enz (μmol.min-1mL-1)

Velocidade da reação (μmol.min-1mL-1)


160.0
140.0
120.0
100.0
80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050
Concentração de sacarose (M)

Gráfico 4 – Curva de Michaelis-Menten

5.2.3. Determinação dos valores de KM e Vmax (pela representação


Michaelis-Menten)

A equação de Michaelis-Menten permite uma visualização rápida e directa, mas não


muito precisa dos valores de Vmáx e de Km, uma vez que esta depende do observador.

A velocidade atingirá o ponto máximo quando a enzima estiver saturada, ou seja,


quando todos os locais de ligação do centro activo estiverem ocupados com os ligandos
e quando a concentração de substrato não influenciar a velocidade. Como a curva
relativa ao gráfico de Michaelis-Menten tende para o infinito, não existe um valor
preciso para Vmáx mas sim uma estimativa deste. Neste caso, o valor foi de
aproximadamente 145 μmol.min-1mL-1

O Km corresponde ao valor da concentração de substrato (eixo xx) lido a partir de V0


(eixo dos yy) que equivale à metade de Vmáx. Assim:
𝑉𝑚á𝑥 145
𝑘𝑚 = = = 72,5 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 . 𝑚𝐿−1
2 2

Observando o gráfico, extrapolou-se que o Km será de aproximadamente 0,0075 M

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5.3. Traçar o gráfico de Lineweaver-Burk e determinar os valores de KM e Vmax.

 Cálculos necessários à construção do gráfico de Lineweaver-Burk

A dedução da equação de Lineweaver-Burk a partir da equação de Michaelis-Menten é


dada por:

Y = m x + b

Assim, esta é a equação de uma recta onde 1/v representa a ordenada, 1/[S] a abcissa, o
declive é dado por KM/vmax e a ordenada na origem 1/ vmax.

Tabela 6 - Dados usados para a construção da recta de Lineweaver-Burk

1/[sacarose] 800 400 200 100 50 25

1/V 1,602E-01 9,561E-02 1,891E-02 1,109E-02 8,141E-03 7,024E-03

Recta de Lineweaver- Burk


0.180
0.160 y = 0.0002x - 0.0053
R² = 0.9662
0.140
1/V (mol-1min.mL)

0.120
0.100
0.080
0.060
0.040
0.020
0.000
0 200 400 600 800 1000

1/[sacarose] (M-1)

Gráfico 5 - Representação gráfica da equação Lineweaver-Burk

Visto que o valor de b obtido é negativo, não é possível calcular o valor de Vmáx e
consequentemente o valor de Km, uma vez que o valor da velocidade calculado daria
negativo, o que é impossível.

Grupo V; PL4 15
[ESTUDO DA CINÉTICA DA ENZIMA INVERTASE] Bioquímica I

Tabela 7 - Dados usados para a construção da recta de Lineweaver-Burk desprezando 2 pontos

1/[sacarose] 800 400 50 25

1/V 1,602E-01 9,561E-02 8,141E-03 7,024E-03

Recta de Lineweaver-Burk
0.180
1/V (mol-1min.mL)

y = 0.0002x + 0.003
0.160
R² = 0.989
0.140
0.120
0.100
0.080
0.060
0.040
0.020
0.000
0 200 400 600 800 1000
1/[sacarose] (M-1)

Gráfico 6 - Representação gráfica da equação Leneweaver-Burk desprezando 2 pontos

De forma a obter um valor de velocidade máxima aceitável, foi desprezado o ponto 3 e


4, obtendo a recta: 𝒀 = 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟐𝒙 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟑

1 1
𝑏= ⇔ 𝑉𝑚 = ≈ 333,33 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑖𝑛−1 𝑚𝑙−1
𝑉𝑚á𝑥 0,003

𝐾𝑚
𝑚= ⇔ 𝐾𝑚 = 𝑚 × 𝑉𝑚 ⇔ 𝐾𝑚 = 333,33 × 0,0002 = 0,0667𝑀
𝑉𝑚
Tabela 8 – Resultados obtidos pela curva de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk

Michaelis-Menten Lineweaver-Burk
Vmáx 145 333,33
KM 0,0075 0,0667

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[ESTUDO DA CINÉTICA DA ENZIMA INVERTASE] Bioquímica I

6. Discussão /Conclusão
Com o intuito de realizar esta experiência laboratorial e para efectuar o cálculo dos
parâmetros cinéticos relativos à enzima invertase, onde se relaciona a velocidade
reaccional com a concentração do substrato presente, procedeu-se à realização de uma
recta de calibração. Esta recta relaciona a concentração de glucose/frutose com as
absorvâncias lidas para cada uma das concentrações padrão. Na segunda parte do
trabalho e com recurso a esta recta, foi possível calcular efectivamente a concentração
do produto da reacção (concentração de glucose/frutose derivado da degradação da
sacarose pela invertase) e efectuar de novo a leitura das absorvâncias para as amostras
com diferentes concentrações de substrato. Dependendo da concentração de substrato
presente na amostra, a concentração dos produtos foi variando no decurso da reacção
enzimática, o que nos permitiu estudar a actividade da enzima invertase para com o
substrato, ou seja, a sua afinidade para com este.

O estudo desta mesma actividade enzimática foi feito com recurso a duas representações
gráficas: a curva de Michaelis-Menten e a recta de Lineweaver-Burk.

O gráfico 4 mostra a variação da [Sacarose] quando a [Invertase] é constante. Como se


pode observar, para concentrações relativamente baixas de sacarose, V0 aumenta quase
linearmente com o aumento da [Sacarose], fruto da grande quantidade de enzima livre
que se pode ligar ao substrato. Para concentrações elevadas deste mesmo substrato, V0
aumenta cada vez menos em resposta ao aumento da concentração de sacarose,
atingindo um patamar que representa o valor de Vmáx. Esta tendência para o infinito
representa o momento em que os centros activos da invertase se encontram todos
ligados à sacarose (saturação da enzima), em que a velocidade reaccional não aumenta
mais independentemente dos aumentos da concentração da sacarose.

Este gráfico permitiu então uma determinação empírica das constantes cinéticas
enzimática: Km e Vmáx. No nosso caso, os valores foram ≈0,0075 M e ≈145 µmol.min-
1.mL-1, respectivamente. Contudo, estes parâmetros não são muito precisos dado que
Vmáx não é um valor preciso mas sim assimptótico (tende para o infinito) e por
consequência, Km também não é rigoroso porque depende de Vmáx.

De forma a colmatar as falhas relativas a esta observação empírica, recorreu-se a uma


das formas linearizadas da equação de Michaelis-Menten – Equação de Lineweaver-

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Burk (inverso de Michaelis-Menten). Esta equação permite uma leitura mais correcta
dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx (cálculos matemáticos).

Não obstante, no nosso trabalho prático, os valores acima referidos não puderam ser
calculados uma vez que a equação que representa a recta de Lineweaver-Burk tinha o
parâmetro b negativo (-0,0053) (gráfico 5). Se assim fosse, Vmáx daria negativo (Vmáx
=1/b) bem como Km (Km = m xVmáx). Uma possível explicação para este facto ocorrido
é de que este método provoca uma distorção do erro experimental – para baixos valores
de V0, um pequeno erro em V0 corresponde a um enorme erro em 1/V0; pelo contrário,
para valores elevados de V0, o mesmo pequeno erro em V0 corresponderá a erros
desprezáveis em 1/V0.

Se pelo contrário desprezássemos dois pontos da recta de Lineweaver-Burk


(nomeadamente o 3º e 4º pontos), obteríamos um b positivo (0,003) (gráfico 6), o que
nos permitiria obter valores de Vmáx ≈ 333,33 µmol.min-1.mL-1 e Km = 0,0667 M. Este
valor calculado esta dentro do limite teórico previsto (10−8 a 10−2 M). No entanto,
como não existem valores de referência para actividade enzimática da invertase não se
pode inferir quanto aos erros analíticos cometidos, nem à exactidão dos resultados
experimentais. Tendo em conta o valor obtido para Km (6,67 × 10−2, tem-se uma má
actividade enzimática visto que este se aproxima do limite superior teórico previsto
(𝟏𝟎−𝟖 < 6,67 × 10−2 M < 𝟏𝟎−𝟐 ). Todavia, este resultado não pode ser considerado
estatisticamente significativo, uma vez que foram desprezados 2 pontos e o r2 é inferior
a 0,999 (correlação fiável).

Outro motivo para os resultados não serem considerados fiáveis é que segundo o
descrito na literatura, a enzima invertase não tem uma actividade significativa (24%),
mesmo na capacidade máxima de actuação (actividade óptima). De referir ainda que
apesar da baixa actividade, o pH óptimo (4,5) foi proporcionado pelo tampão acetato de
sódio.

Outra ilação que podemos retirar da realização deste trabalho prático foi que a sacarose
não foi precisa para a preparação da recta de calibração (gráfico 3), uma vez que só os
açúcares glucose e frutose têm a capacidade de reduzir o DNS devido à presença de
carbonos anoméricos (carbonos capazes de participar na formação de ligações
glicosídicas). Pelo contrário, como a sacarose já apresenta uma ligação glicosídica, não
apresenta o carbono livre necessário à redução do DNS. No entanto, utilizou-se a
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sacarose nesta primeira parte da experiência para que na medição das absorvâncias
houvesse os mesmos constituintes em ambas as partes do trabalho, pois na segunda
parte a enzima invertase não é capaz de degradar a sacarose na sua totalidade.

De referir ainda que os valores não foram de encontro ao esperado, possivelmente por
terem ocorrido erros sistemáticos e experimentais, tais como: má preparação das
soluções-padrão, desfasamento temporal entre a primeira parte e a segunda da
experiência, más leituras no espectrofotómetro devido a células danificadas e mau
funcionamento do aparelho.

Em suma, podemos então afirmar que os parâmetros cinéticos podem ser calculados
tanto pela curva de Michaelis-Menten como pela recta de Lineweaver-Burk. Pela curva
de Michaelis-Menten o calculo de Km não é rigoroso, pois depende da determinação do
Vmáx que é calculada por aproximação, sendo que também exige um numero elevado de
determinações. Contudo, o segundo método é mais expedito, rigoroso e rápido e são
necessárias menos leituras experimentais, pois o traçado da recta exige um menor
número de pontos da curva. Para além disto, a recta de Lineweaver-Burk não implica
aproximações, mas sim cálculos matemáticos.

7. Bibliografia

1. Adão, M. H. et al. (1997). Bioquímica. LIDEL- Edições Técnicas. ISBN: 972-


757-042-9;
2. http://legion.geleia.net/Guia_Laboratorios.pdf;
3. http://users.med.up.pt/ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados_anos_anteriores/2006-
2007/enzimas_e_cinetica_enzimica.pdf;
4. Nelson, D.L., Cox, M.M. (2001). “Lehninger, Principles of Biochemistry”, 3a
edição, Worth Publishers,;
5. Protocolo da actividade prática fornecido pelos docentes da cadeira;
6. Fiedurek, J.; Pielecki, J.; Skowronek, M. (2000). Direct methods for selecting
mutants with increased production of invertase from mutagenised cultures of
Aspergillus fumigatus. Journal of Basic Microbiology, v. 40, p. 111-118;
7. http://www2.ufp.pt/~pedros/bq/Enzimas.htm;
8. Campos L. (1999). “Entender a Bioquímica”Escolar Ed, 2ª edição,. Capítulo 2,
Cinética das Reacções Bioquímicas;

Grupo V; PL4 19
[ESTUDO DA CINÉTICA DA ENZIMA INVERTASE] Bioquímica I

9. http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/Apostila_cinetica_e
nzimatica_ju.pdf;
10. Tseng SJ, Hsu JP. (1990). A comparison of the parameter estimating procedures
for the Michaelis–Menten model. J Theor Biol. Aug 23;145(4):457–64. PMID
2246896;
11. http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S010466322000000400051&script=sci_artt
ext

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[ESTUDO DA CINÉTICA DA ENZIMA INVERTASE] Bioquímica I

8. Anexos

8.1. Anexo 1- Segurança e riscos

 NaOH:
R 35: Provoca queimaduras graves.
S 2: Manter fora do alcance das crianças.
S 26: Em caso de contacto com os olhos lavar imediata e abundantemente em água e
chamar um especialista.
S 37/39: Usar luvas adequadas e protecção para os olhos/cara

 Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS):


R 22: Nocivo por ingestão.
S 22: Não respirar o pó
S24/25: Evitar o contacto com os olhos e com a pele

 Ácido Cloridrico:
R34: Provoca queimaduras
R37: Irritante para as vias respiratórias.
S26: Em caso de contacto com os olhos lavar imediata e abundantemente em água e
chamar um especialista
S45: Em caso de acidente ou indisposição consultar imediatamente um médico (se
possível mostrar-lhe o rótulo do produto)

 Acetato de sódio:

R 36/37/38: Irritante para os olhos, vias respiratórias e pele.

S 16: Conservar longe de fontes de ignição - Não fumar.

S 29: Não deitar os resíduos no esgoto

S56: Não despejar na rede de esgotos nem no meio aquático. Utilizar para o efeito um
local apropriado para o tratamento dos resíduos

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8.2. Anexo 2- Dedução da equação de Lineweaver-Burk


Dedução da equação de Lineweaver-Burk por linearização da equação de Michaelis-
Menten.

𝑣 [𝑆]
= ⇔
𝑣𝑚𝑎𝑥 𝐾𝑀 + [𝑆]

𝑣𝑚𝑎𝑥 𝐾𝑀 + [𝑆]
= ⇔
𝑣 [𝑆]

1 𝐾𝑀 + [𝑆]
= ⇔
𝑣 𝑣𝑚𝑎𝑥 . [𝑆]

1 𝐾𝑀 [𝑆]
= + ⇔
𝑣 𝑣𝑚𝑎𝑥 . [𝑆] 𝑣𝑚𝑎𝑥 . [𝑆]

1 𝐾𝑀 1
= + ⇔
𝑣 𝑣𝑚𝑎𝑥 . [𝑆] 𝑣𝑚𝑎𝑥

1 𝐾𝑀 1 1
= × +
𝑣 𝑣𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑣𝑚𝑎𝑥

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8.3. Anexo 3- Preparação de soluções

 Extracto não purificado de enzima


Homogeneizar muito bem 50 g de fermento de padeiro em 100 ml de solução NaHCO3
0,1 M, durante 1 ou 2 minutos. Transferir a mistura para um erlenmeyer de 250 ml,
vedar com um pouco de algodão e incubar num banho termostatizado a 40ºC, durante
24 h.

Após a autólise da células de fermento, centrifugar a mistura durante 15 min. Transferir


o líquido sobrenadante, límpido, para uma proveta e registar o volume, guardando este
extracto de enzima no frigorífico.

 Reagente de DNS
Dissolver 1 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico em 200 ml de NaOH 2 N, aquecendo e
agitando vigorosamente (solução A). Dissolver 300 g de tartarato de sódio e potássio
em 500 ml de água destilada (solução B). Misturar 30 ml da solução A com 75 ml da
solução B e perfazer o volume para 150 ml com água destilada.
 Tampão acetato 20 mM, pH 4.5
Pesar a quantidade de acetato de sódio necessária para preparar 500 ml de solução 20
mM, colocar num copo de 500 ml, adicionar cerca de 400 ml de água e homogeneizar.
Verificar o pH da solução resultante com o medidor de pH. Se necessário, acertar o pH
no valor pretendido (4.5), adicionando pouco a pouco, com um conta gotas, ácido
clorídrico concentrado, agitando continuamente a solução através de um agitador
magnético. Transferir a solução para um balão de 500 ml e aferir com água destilada.
Homogeneizar.

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