UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

Ing. Agroindustrial Bioquímica Grupo B

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA DE LA ALFA AMILASA
VEGETAL

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica cuya función es ascelerar las
reacciones químicas llevándolas más rápidamente a su posición de equilibrio.
Pertenecen al grupo de las proteínas globulares cuyos pesos moleculares oscilan entre
104 𝑦 106 daltons; pueden consistir de una sola o de varias cadenas polipeptídicas, y
contener también partes no proteicas.

En la práctica se estudiará la actividad de una amilasa de origen vegetal , midiendo el

sustrato residual. Asimismo se medirá su actividad específica que viene a constituir un
criterio de pureza, y se define como “el número de unidades de enzima por mg de
proteína”

AMILASA: Cataliza la hidrólisis al azar los enlaces α-1,4 glucosidicos de la región central
de la cadena de amilosa y amilopeptina, exceptuando las moléculas cercanas a la
ramificación, obteniendo como resultado maltosa y oligosacáridos de varios tamaños. La
actividad de la enzima se determina cualitativamente mediante la disminución de la
capacidad de la solución de almidón para formar el color azul característicos con el yodo
o midiendo la disminución de la viscosidad de la suspensión de almidón.
La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada
(amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar
una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinogénica (mezcla de
amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca producción de
maltosa.

I. OBJETIVOS:
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- Determinar l actividad enzimática de una amilasa extraída de trigo germinado,

usando almidón residual.
- Determinar la actividad específica de la amilasa vegetal.

II. MATERIALES:

Equipos:
- Estufa
- Espectrofotómetro

Materiales y reactivo:

- Semillas germinados: trigo y cebada

- Solución de almidón 0.1%
- Ácido clorhídrico 0.5N
- Lugol
- Reactivo de Biuret
- Tubos de ensayo
- Embudos
- Mortero
- Pipetas de 1,5,10 ml

III. PROCEDIMIENTO:
- Extracción de la amilasa:
 Germinamos 50 semillas de trigo y cebada por 3 dias.
 Trituramos las semillas, adicionando 10 ml de buffer + cloruro de calcio.
 Filtramos en gasa o algodón.

- Demostración de la actividad enzimática: armar el siguiente sistema.

TUBOS (ml) ALMIDON ALMIDON RESIDUAL

INICIAL
I II III IV
SUSTRATO 1.0 1.0 1.0 1.0
Incubar: 30°C – 5 min.
EXTRACTO DE ENZIMA --- 0.1 0.2 0.3
Incubar: 30°C – 15 min.
ACIDO CLORHIDRICO 0.5N 1.0 1.0 1.0 1.0
Reposar: T. ambiente – 5 min.
AGUA DESTILADA 9.9 9.8 9.7 9.6
LUGOL 0.5 0.5 0.5 0.5

 Mesclamos, y Medimos las absorbancias después de 5 min a 6.20nm

 Anotamos los datos obtenidos

- Determinación de la actividad específica:

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 Determinamos el contenido proteico del extracto crudo de la enzima con el

reactivo de Biuret de acuerdo al siguiente esquema:

TUBO (ml) I II III IV

Preparado enzimático --- 0.2 0.1 0.05
Agua destilada 1.0 0.8 0.9 0.95
Reactivo de Biuret 4.0 4.0 4.0 4.0

 Mezclamos y lo llevamos a incubar por 30 min a 37°C.

 Realizamos las lecturas de absorbancia a 540 nm calibrando a cero con el
tubo N° 1
IV. RESULTADOS
 ACTIVIDAD ENZIMATICA

N° TUBO ABSORBANCIA (nm)

I 0,309
II 0,186
III 0,189
IV 0,226

 ACTIVIDAD ESPECÍFICA

N° TUBO ABSORBANCIA (nm)

I 0,128
II 0,181
III 0,172
IV 0,131

CALCULOS

- Determine la concentración del almidon (mg/ml), multiplicando, absorbancia por

factor de calibración. obtener el promedio de los tubos II, III Y IV.

FC = 0,698

C1 = (0,186) (0,698) = 0,129

C2 = (0,189) (0,698) = 0,132

C3 = (0,226) (0,698) = 0,158

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 Promedio o mg de almidon hidrolizado:

(0,129+0,132+0,158)
=
3

= 0,42

- Calcular las unidades de enzima (u) de la siguiente forma:

𝒎𝒈 𝒅𝒆 𝒂𝒍𝒎𝒊𝒅𝒐𝒏 𝒉𝒊𝒅𝒓𝒐𝒍𝒊𝒛𝒂𝒅𝒐
𝑼=
𝟏𝟓 𝒎𝒊𝒏𝒖𝒕𝒐𝒔

0,42
𝑈=
15
U = 0,028

- Determinar mg de proteina/ ml = absorbancia x factor

FC = 0,698

C1 = (0,181) (0,698) = 0,126

C2 = (0,172) (0,698) = 0,120

C3 = (0,131) (0,698) = 0,091

 Promedio o mg de proteina:

(0,126+0,120+0,091)
=
3

= 0,11

- Obtener el promedio de los tubos ii, iii, iv, y determinar la actividad específica (ae)
de la siguiente manera:

𝒖𝒏𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆𝒔 𝒅𝒆 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂
𝑨𝑬 =
𝒎𝒈 𝒅𝒆 𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆𝒊𝒏𝒂
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0,028
𝑈=
0,11

U= 0,25

CUESTIONARIO

1.- En la síntesis de arginina a partir de acido glutámico se observaron las siguientes

reacciones

1 2 3 4
Glu ------ N ac. Glu ------ Orn ------ Cit ------ Arg

Siendo 1, 2, 3,4 enzimas

Indica cuales son los sustratos y productos correspondientes para estas enzimas
mediante un cuadro.

2.-Por que se sometieron las raicillas del cereal a un proceso físico y químico en el
proceso de extracción?

El proceso de extracción se basa en la obtención de amilasa, por lo que es necesario

que las raicillas de los cereales sufran un proceso físico donde se van a fragmentar en
pedazos más pequeños con la ayuda de un mortero pero aun así siguen conservando
su naturaleza, luego se da el proceso químico donde se va a filtrar la parte liquida que
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seria la amilasa de las semillas con la ayuda de una gasa ,luego a este extracto se le
van agregando una seria de reactivos lo cual permitirán transformarla en un preparado
enzimático para posteriormente utilizarla en diferentes pruebas.

3.- Si se te da una solución que supuestamente contiene una enzima, ¿Cómo

determinarías en la solución la presencia de una enzima que cataliza la hidrolisis de
almidón?

Para determinar la presencia de una enzima en una solución y a la vez observar que
cataliza la hidrolisis de almidón solo se podría lograr a través de una vía ,la cual consiste
en agregar reactivos que permitan evidenciar tal presencia como es el caso del lugol ,
además porque mientras el color de la mezcla sea mas intenso significa que la actividad
enzimática que ejerce la amilasa sobre el almidón será un poco mas baja , además
también la podemos notar ya que en la solución se va a observar la formación de anillos
en la parte superior de dicho liquido o sustancia.

4.- Represente mediante un flujograma el proceso de extracción de una amilasa de

una fuente diferente a la utilizada en práctica.

5.- ¿Cómo se puede incrementar la actividad específica de una enzima?

La actividad específica de las enzimas se calcula dividiendo la actividad enzimática (por

ejemplo; U/mL) entre la concentración de proteínas (mg/mL). El resultado final indica la
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cantidad de enzima por milígramos de proteínas presente. Se supone que si purificas la

enzima normalmente la actividad específica de la misma debe aumentar, ya que la
proporción de enzima del total de las proteínas presentes debe también irse
incrementando. A veces esto no ocurre. En ese caso debe revisar el procedimiento otra
vez ya que algo puede estar saliendo mal. Por ejemplo que se desnaturalice la enzima
en el proceso de purificación por empleo de algún solvente o pH o fuerza iónica
inadecuada. También debe tener en cuenta si la proteína en milimétrica, ya que la
pérdida de una subunidad puede reducir significativamente su actividad.

BIBLIOGRAFIA:

 Foster, N; Burchett, L and Paulsen, Bioquimica,Editorial Reverte, Espana,G. 1998.

 Benech-Arnold, R. and Sanchez,Biologia de las Plantas,Primera Edicion,Editorial
Bermejo . 2004.
 Almonte.Carlos,Manual de Quimica Organica,Quinta Edicion, 2010.
 Barabado.Oscar,Microbiologia Alimentaria,Tercera Edicion,2001.