Membran Luar Leptospiral David A. Haake dan Wolfram R.

Zückert Abstrak
Membran luar (OM) adalah garis depan interaksi leptospiral dengan
lingkungannya dan inang mamalia. Tidak seperti kebanyakan spirochetes
invasif, leptospira patogen harus mampu bertahan hidup di negara yang
hidup bebas dan beradaptasi dengan host. Ketika organisme berpindah
dari satu set kondisi lingkungan ke kondisi lain, OM harus menghadapi
serangkaian tantangan yang saling bertentangan. Misalnya, OM harus
cukup berpori untuk memungkinkan serapan hara, namun cukup kuat
untuk mempertahankan sel terhadap zat berbahaya. Pada inang, OM
menyajikan permukaan yang dihiasi dengan adhesin dan reseptor untuk
melekatkan, dan memperoleh, molekul inang yang diinginkan seperti
pengatur pelengkap, Faktor H. Di sisi lain, OM harus memungkinkan
leptospira untuk menghindari deteksi oleh kekebalan inang. sistem dalam
perjalanan mereka dari situs invasi melalui aliran darah ke ceruk yang
dilindungi dari tubulus proksimal. Gambaran yang muncul dari OM
leptospiral adalah bahwa, sementara itu berbagi banyak karakteristik OMs
dari spirochetes dan bakteri Gram-negatif, itu juga unik dan berbeda dalam
cara yang membuatnya menarik umum untuk ahli mikrobiologi. Sebagai
contoh, tidak seperti kebanyakan spirochetes patogen lainnya, OM lep-
tospiral kaya akan lipopolisakarida (LPS). Leptospiral LPS mirip dengan
bakteri Gram-negatif tetapi memiliki sejumlah fitur struktural yang unik yang
dapat menjelaskan mengapa hal itu tidak diakui oleh reseptor Toll-like 4
LPS yang khusus untuk manusia. Seperti pada spirochetes lainnya,
lipoprotein adalah komponen utama OM leptospiral, meskipun perannya
kurang dipahami. Fungsi protein membran luar transmembran (OMPs)
dalam banyak kasus lebih baik dipahami, berkat homologi dengan rekan-
rekan Gram-negatif mereka dan munculnya teknik genetik yang lebih baik.
Bab ini akan meninjau penemuan-penemuan terbaru yang melibatkan OM
lep-tospiral dan perannya dalam fisiologi leptospiral dan patogenesis.
1 Lipopolisakarida (LPS)

LPS merupakan komponen utama dari OM leptospiral dan polisakarida

mendominasi permukaan leptospiral. Sejauh mana LPS terkena pada permukaan
leptospiral tercermin dalam kelimpahan partikel padat elektron pada permukaan L.
interrogans setelah inkubasi dengan antibodi anti-LPS monoklonal berlabel emas
(Gambar 1). Agglutinasi terjadi dalam beberapa menit di hadapan konsentrasi kecil
antibodi spesifik LPS. Antibodi monoklonal untuk LPS memediasi opsonisasi fag-
makro (Farrelly et al. 1987) dan melindungi hewan terhadap tantangan dengan
leptospira patogenik (Jost et al. 1989). Respon imun spesifik LPS adalah dasar
untuk imunitas sterilisasi yang ditimbulkan oleh vaksin sel utuh (Midwinter et al.
1994). Mengingat sensitivitas leptospira terhadap antibodi spesifik LPS,
tidak mengejutkan bahwa ada tekanan selektif yang luar biasa untuk
mengalami perubahan genetik yang menyebabkan variasi O-antigen.
Ratusan serovar leptospiral telah ditentukan, berdasarkan reaktivitas
diferensial dengan antibodi atau antisera dalam uji aglutinasi mikroskopik
(MAT). Penambahan sederhana dari LPS-antiserum ke kultur leptospiral
dapat menghasilkan pertumbuhan mutan melarikan diri dengan LPS yang
diubah.

Meskipun aksesibilitasnya, LPS tidak berarti pertanggungjawaban untuk

organisme ini. Ekspresi LPS yang utuh tampaknya penting untuk
kelangsungan hidup leptospiral baik di dalam maupun di luar inang
mamalia. Kesimpulan ini sebagian didasarkan pada temuan bahwa rfb
locus yang mengkodekan enzim yang bertanggung jawab untuk biosintesis
LPS relatif terhindar dari insersi dalam studi mutagenesis transposon acak
(Murray et al. 2009a), menunjukkan bahwa mutan LPS yang paling
nonviable untuk pertumbuhan di budaya. Mutan langka yang bertahan dari
penyisipan transposon ke lokus LPS dilemahkan untuk virulensi dan
dengan cepat dibersihkan setelah tantangan (Murray et al. 2010).
Menariknya, LPS yang diungkapkan oleh salah satu mutan LPS ini, M1352,
memiliki sedikit atau tidak ada perubahan dalam massa molekulernya,
menunjukkan bahwa perubahan halus pada LPS dapat menyebabkan
hilangnya virulensi. M1352 Mutan efektif sebagai vaksin hidup yang
dilemahkan, menstimulasi kekebalan homolog dan heterolog dalam model
hamster leptospirosis (Srikram et al. 2011). Deteksi organisme di hati dan
ginjal dengan menggunakan antibodi monoklonal spesifik serovar
menunjukkan bahwa rantai samping O-antigen Leptospiral LPS tidak statis
dan mungkin mengalami perubahan antigenik selama infeksi (Nally et al.
2005a).
1.1 Struktur dan Biosintesis LPS Seperti pada bakteri Gram-negatif,
Leptospiral LPS terdiri dari tiga komponen: lipid A, inti, dan polisakarida.
Genom L. interrogans mengandung homolog dari semua gen yang
diperlukan untuk biosintesis lipid A (Ren et al. 2003). Struktur lipid A
leptospiral sekarang telah sepenuhnya dijelaskan dan ditemukan
mengandung kedua kemiripan dengan, dan perbedaan mencolok dari,
bentuk khas lipid A (Que-Gewirth et al. 2004). Perbedaan utama pertama
adalah bahwa L. interrogans mengubah GlcNAc biasa (N-
acetylglucosamine) tulang punggung disaccharide dari lipid A ke GlcNAc3
N, sehingga masing-masing dari dua gula memiliki dua gugus amino,
bukan satu. Akibatnya, ada empat asam lemak terikat-amida di L.
interrogans lipid A, bukan dua. Ini tidak biasa, tetapi telah diamati pada
beberapa bakteri lingkungan. Selain itu, asam lemak leptospiral pada lipid
Leptospiral A berbeda panjangnya dari yang biasanya ditemukan pada lipid
A Gram-negatif dan beberapa tidak jenuh. Aspek yang lebih tidak biasa
dari L. interrogans lipid A melibatkan residu fosfat. E. coli lipid A memiliki
dua fosfat, satu pada setiap ujung disakarida, sedangkan lipid Leptospiral
A memiliki fosfat tunggal, dan bahwa fosfat tunggal adalah termetilasi.
Fosfat terestilasi sangat luar biasa dalam biologi dan belum pernah diamati
sebelumnya pada lipid A. 1.2 Kekebalan bawaan: TLR4 dan TLR2
Perbedaan struktural antara LPS E. coli dan Leptospira sangat menarik
karena pengakuan diferensial mereka oleh TLR4, reseptor Toll-like yang
terlibat dalam respon imun bawaan untuk LPS. Sementara manusia TLR 4
bereaksi dengan E. coli LPS pada konsentrasi yang sangat rendah, itu
tidak dapat berinteraksi dengan Leptospiral LPS (Werts et al. 2001).
Kegagalan TLR4 manusia untuk mengenali Leptospiral LPS mungkin
menjadi salah satu alasan mengapa manusia adalah tuan rumah yang
kebetulan di mana leptospirosis kadang-kadang menyebabkan over-
whelming, infeksi yang mematikan. Sebaliknya, murine TLR4 mampu
mengenali Leptospiral LPS (Nahori et al. 2005) dan tikus bersifat alami,
reservoir host untuk leptospira patogenik. Ide ini konsisten dengan
pengamatan bahwa sementara tikus dengan reseptor Toll-like yang utuh
resisten terhadap infeksi leptospiral, tikus muda (tetapi tidak dewasa) C3H /
HeJ yang kekurangan TLR4 rentan terhadap infeksi mematikan dengan L.
interrogans (Viriyakosol et al. 2006) . Anehnya, Leptospiral LPS diakui oleh
manusia dan murine TLR2, reseptor Toll-like terutama yang terlibat dalam
recog-nition lipoprotein. Pentingnya kedua reseptor TLR2 dan TLR4 pada
tikus disorot oleh temuan bahwa hanya ketika kedua reseptor ini tersingkir
dewasa C57BL / 6 J tikus mengembangkan infeksi yang mematikan
setelah tantangan leptospiral (Nahori et al. 2005). Murine TLR4 dan TLR2
muncul untuk mengenali berbagai komponen LPS leptospiral: TLR4
mengenali lipid Leptospiral A sementara TLR2 mengenali bagian
polisakarida atau 2-keto-3-deoxyoctonoic acid (KDO) dari Leptospiral LPS
(Nahori et al. 2005; Werts 2010). 1.3 Perakitan LPS dan Transportasi
Banyak gen yang terlibat dalam ekspor LPS ke OM hadir dalam genom
leptospiral, menunjukkan bahwa prosesnya mirip dengan gen-gen pada
bakteri Gram-nega-tive. Sejumlah ulasan yang sangat baik tentang
masalah perakitan dan transportasi LPS baru-baru ini telah diterbitkan
(Ruiz dkk. 2009; Sperandeo dkk. 2009). Lipid A dan komponen inti LPS
dirakit pada permukaan sitoplasma membran bagian dalam. Molekul LPS
yang kasar ini (kekurangan antigen-O) diangkut ke selaput periplasma
membran dalam oleh trans-porter ABC, MsbA. Belum ditentukan mana dari
banyak pengangkut ABC yang merupakan interogans ABC adalah MsbA.
O-antigen dirakit melalui jalur jalan yang tergantung pada WY di mana
polisakarida disintesis pada permukaan sitoplasma membran dalam, diikuti
dengan transpor melintasi membran dalam oleh flekase Wzx (LIC12135),
di mana mereka diikat ke LPS kasar oleh Wzy O-antigen ligase
(LIC11753). Setelah polisakarida telah ditambahkan ke inti LPS, LPS
panjang penuh (halus) diangkut melintasi periplasma oleh LptA ke situs
perakitan LPS pada OM yang dibentuk oleh LptD (alias OstA, LIC11458)
dan LptE (11007). LptD adalah molekul mirip-porin dan tampaknya terlibat
dalam mentranslokasi LPS ke permukaan OM. CT-elektron tomografi telah
menunjukkan bahwa ketebalan lapisan LPS antar-rogan, dan mungkin
panjang polisakaridanya, 50% lebih besar daripada L. biflexa (Gambar 2),
yang lagi-lagi menggambarkan pentingnya LPS. untuk virulensi (Raddi et
al. 2012).

2 Outer Membrane Proteins (OMPs) 2.1 Pertimbangan Umum Dalam

beberapa tahun terakhir, banyak yang telah dipelajari tentang identitas,
ekspresi, dan fungsi OMP. Gambaran OM yang muncul (Gbr. 3) adalah
hasil dari metode yang ditingkatkan untuk menentukan apakah protein
terletak di OM dan di permukaannya. Sejumlah metode fraksinasi sel telah
dikembangkan, termasuk fraksionasi Triton X-114 (Haake et al. 1991;
Zuerner et al. 1991), isolasi OM ves-icles oleh fraksinasi gradien densitas
sukrosa (Haake dan Matsunaga 2002; Nally et al 2005b), dan fraksinasi
membran (Matsunaga et al. 2002). Yang paling penting adalah metode
untuk mengidentifikasi OMP yang terpapar di permukaan. Beberapa tes
harus diterapkan, termasuk kontrol permukaan dan bawah permukaan,
sebelum menyimpulkan apakah suatu protein tertentu terekspos
permukaan. Metode yang paling akurat meliputi imunopresipitasi
permukaan (Haake et al. 1991), biotinilasi permukaan (Cullen et al. 2003),
proteolisis permukaan (Pinne dan Haake 2009), dan imunofluoresensi
permukaan (Pinne dan Haake 2011). Khususnya yang berguna adalah
aplikasi dari laser dibantu matriks desorpsi / ionisasi waktu penerbangan
(MALDI-TOF) untuk identifikasi terpapar permukaan (Cullen et al. 2005)
dan protein yang terkait OM (Cullen et al. 2002; Nally et al 2005b). Lebih
banyak yang diketahui tentang tingkat absolut dari ekspresi protein
leptospiral dibandingkan dengan hampir semua spesies bakteri lainnya,
berkat aplikasi proteome-wide dari MALDI-TOF untuk mengidentifikasi dan
mengukur protein leptospiral (Malmström et al. 2009). Kuantifikasi absolut
dicapai dengan memasukkan peptida ref-erence berlabel isotop dalam
sampel leptospiral. DNA microarray telah digunakan untuk memeriksa
respon tingkat transkripsi leptospiral terhadap sinyal lingkungan termasuk
peningkatan suhu (Lo et al. 2006), osmolaritas (Matsunaga et al. 2007a),
kadar besi (Lo et al. 2010), serum (Patarakul et. al. 2010), dan makrofag
yang diturunkan