Los hidrolizados de proteína de salvado de arroz exhiben fuerte α-amilasa in vitro, β-glucosidasa y

Actividades de inhibición de la ECA

ANTECEDENTES: El objetivo de este estudio fue examinar sistemáticamente las actividades de promoción de
la salud in vitro del salvado de arroz hidrolizados de proteínas Las proteínas de salvado de arroz se fraccionaron
en albúmina, globulina, prolamina y glutelina, que se sometieron a hidrólisis por cuatro preparaciones de
proteasas, a saber Alcalase, Neutrase, Flavourzyme y Protamax, y las actividades inhibidoras de los
hidrolizados contra α-amilasa, α-glucosidasa y enzima convertidora de angiotensina (ECA), se monitorizaron a
través de una hidrólisis período de 240 min. Los péptidos activos en los hidrolizados se aislaron por ultrafiltración
y cromatografía de intercambio iónico y las secuencias peptídicas de las fracciones activas se identificaron
mediante LC-MS / MS.

RESULTADOS: La hidrólisis de las proteínas dio como resultado un aumento significativo de estas
bioactividades, que generalmente se correlacionaron con el grado de hidrólisis de proteínas. En general, las
bioactividades más altas se encontraron con albúmina e hidrolizados de glutelina, seguidos por los hidrolizados
de globulina, mientras que los hidrolizados de prolamina mostraron las actividades más bajas. De las cuatro
enzimas utilizadas, Alcalaseand. Los hidrolizados catalizados por Protamax generalmente tenían las actividades
más elevadas, mientras que los hidrolizados producidos por Flavourzyme tenían la actividad más baja La
fracción MW <3 kDa de los hidrolizados de glutelina catalizados por Alcalasa tuvo la mayor inhibición de β-
glucosidasa actividad, que se identificó que contenía 13 péptidos con seis a 32 residuos de aminoácidos.

CONCLUSIÓN: Las actividades inhibidoras de α-amilasa y α-glucosidasa de albúmina e hidrolizados de

glutelina producidas por Alcalase y Protamax eran comparables en magnitud a los del fármaco acarbosa
estándar contra la diabetes, y tenían el potencial de ser desarrollado en un suplemento dietético o nutracéutico
para el manejo de la diabetes.

INTRODUCCIÓN

El arroz es la segunda cosecha de cereales más grande producida en todo el mundo, con una producción
mundial de 696 millones de toneladas métricas de arroz con cáscara en 2010.El salvado de arroz, que constituye
aproximadamente el 11% del grano, es una de los principales subproductos de la molienda de arroz.
Actualmente, el salvado de arroz se utiliza principalmente como stockfeed, con una pequeña cantidad también
se utiliza para otros fines tales como suplementos nutricionales, ingredientes de medios microbiológicos y
extracción para aceite de cocina. Al igual que otros granos de cereales, salvado de arroz es rico en proteínas,
con un 12-16% de materia seca de salvado como proteína. Sin embargo, a pesar de la abundancia de salvado
de arroz, poca investigación ha tenido llevado a cabo para desarrollar productos a base de proteínas de salvado
de arroz y, en consecuencia, esta rica fuente de proteínas sigue siendo subutilizada. En los últimos años, el
potencial de péptidos producidos por enzimas hidrólisis de proteínas de cereales para exhibir beneficios para la
salud las bioactividades han recibido considerable atención de investigación. Crudos hidrolizados de proteínas
de cereales y péptidos aislados de ellos se ha demostrado que poseen muchas funciones fisiológicas que
incluyen enzima antihipertensiva o convertidora de angiotensina-I (ECA) actividades inhibidoras, antioxidantes,
antimicrobianas y opiáceas. Posibles propiedades de prevención de enfermedades significan que los
hidrolizados de las proteínas de cereales tienen el potencial de convertirse en valiosos ingredientes para
alimentos funcionales y nutracéuticos. Varios estudios han examinado las actividades biológicas del arroz
hidrolizados de proteínas Ya en 1994, Saito et al. aislaron péptidos antihipertensivos de sake y sake. El corto
los péptidos estaban compuestos de cinco o menos residuos de aminoácidos y exhibió actividades inhibidoras
de ACE. Un hidrolizado tríptico de la proteína de arroz mostró actividad inmunomoduladora. Teschemacher
informó que la digestión tríptica de semilla de arroz producida un péptido con la capacidad de unirse al receptor
opioide, que exhibe propiedades agonistas opioides y antagonistas. Un arroz hidrolizado de proteína producido
por la preparación de proteasa comercial Se informó que Alcalase mostró una fuerte inhibición de la ECA in
vitro actividades y causa una disminución significativa en la presión arterial sistólica en ratas espontáneamente
hipertensas. Zhang et al. digeridos proteína de endospermo de arroz desgrasada con cinco proteasas diferentes
preparaciones (Alcalase, Quimotripsina, Neutrasa, Papaína y Flavorasa) para producir hidrolizados con fuertes
actividades antioxidantes. Si bien estos estudios se centran en las proteínas del endosperma de arroz, las
proteínas de salvado de arroz han recibido muy poca atención. Adebiyi et al. proteína hidrolizada de salvado de
arroz libre de fitato con pepsin y produjo hidrolizados con actividades antioxidantes.

Encontró que la albúmina de salvado de arroz y los hidrolizados de globulina tenían mayor actividad antioxidante
que las de proteína cruda. Chanput et al. también estudiaron la actividad antioxidante de la proteína de salvado
de arroz hidrolizados producidos con tripsina. Estos estudios, sin embargo, solo exploró un número limitado de
enzimas proteolíticas y no lo hizo examinar otras actividades biológicas de la proteína de salvado de arroz.
Amilasa actividad inhibidora, por ejemplo, es una de las bioactividades que tiene sido descuidado en esos
estudios. Amilasas como α-amilasa y la α-glucosidasa son enzimas clave en la digestión del almidón. Inhibición
de estas enzimas en el proceso digestivo puede significativamente retrasar la digestión y la absorción de
carbohidratos y, por lo tanto, es un enfoque principal en el manejo de la diabetes, con acarbosa, voglibosa y
miglitol son las principales drogas terapéuticas para este propósito. Con el aumento continuo en la incidencia
del tipo 2 diabetes en todo el mundo, es importante explorar los componentes de los alimentos, tales como
hidrolizados de proteínas, con actividad inhibidora de amilasa como potenciales alternativos nutracéuticas.

El objetivo de este estudio fue examinar el comportamiento biológico in vitro actividades de hidrolizados de
proteína de salvado de arroz. Las proteínas de salvado de arroz eran fraccionado en albúmina, globulina,
prolamina y glutelina, que fueron sometidos a hidrólisis por cuatro preparaciones de proteasa, y las actividades
inhibidoras de los hidrolizados contra α-amilasa, α-glucosidasa y la enzima convertidora de angiotensina (ECA),
monitoreado durante un período de hidrólisis de 240 min.

MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales

El salvado de arroz (cultivar Reiziq) utilizado en este estudio fue amablemente donado por Sunrice Limited,
Leeton, NSW, Australia. Alcalase 2.4 L, Neutrase 0.8 L, Flavourzyme 1000 L y Protamax fueron donado por
Novozymes (Sydney, Australia). 2,2 ' -Azino-bis (3- Ácido etilbenzotiazolin-6-sulfónico (ABTS), 2,2-difenil-1-
(2,4,6- trinitrofenil) hidrazil (DPPH), 2,4,6-tri (2-piridil) -s-triazina (TPTZ), ácido picrylsulfónico (TNBS), captopril,
N- [3- (2-furil) acriloilo] - Phe-Gly-Gly (FAPGG), α-amilasa de Bacillus subtilis (380 U mg-1), enzima convertidora
de angiotensina de pulmón de conejo (0,25 U mL-1), p-nitrofenil-2-glucopiranósido (p-NPG), acarbosa y α-
glucosidasa de Saccharomyces cerevisiae (100 U mg-1) fueron comprado de Sigma-Aldrich (Sydney, Australia).
Bicinchoninic el kit de análisis de proteínas ácido (BCA) se adquirió de ThermoScientific (Sydney, Australia).
Kits de SDS-PAGE que incluyen geles prefabricados (8-16%) Mini-Protein TGX Gel), Coomassie azul brillante
R-250 y precisión más proteína Dual Xtra Standard (5000-250 000 Da) fueron comprado de Bio-Rad (Sydney,
Australia). Todos los demás productos químicos eran de grado analítico.

Extracción secuencial de proteína del salvado de arroz

El salvado de arroz se molió en una licuadora y se pasó a través de un 0.5 tamiz mm El salvado de arroz molido
se desgrasa dos veces con hexano cada vez en una relación de salvado: hexano de 1: 4 (p / v) en un mezclador
de paletas durante 60 minutos, seguido de centrifugación a 10 000 × g durante 15 minutos a 4 ° C. El salvado
de arroz desgrasado se secó al aire durante la noche bajo una campana, suelo en una licuadora, envasados al
vacío en bolsas de polietileno y almacenado a 4 ° C temporalmente (menos de 2 días) antes del uso. Los
extracción de proteína de acuerdo con el método de Osborne seguido el procedimiento de Agboola et al.. Sin
embargo, para eliminar el potencial contaminantes fenólicos presentes en el salvado de arroz, que pueden
interferir con antioxidantes y otros ensayos de bioactividad, la secuencia de la extracción fue modificado. La
extracción secuencial comenzó por mezcla de muestras (100 g) de salvado con cinco volúmenes de 70% (v / v)
etanol durante 60 min, seguido de centrifugación a 10 000 × g durante 15 min a 4 °C para obtener la fracción
de prolamina. Aparte de prolamina, este paso también extrajo compuestos fenólicos libres en el Salvado de
arroz. La prolamina en el extracto se purificó por precipitación con volúmenes dobles de acetona a -18 ° C
durante 24 h, seguido de centrifugación a 10 000 × g durante 15 minutos a 4 ° C y lavado dos veces con acetona
El sobrenadante, que contenía los fenólicos, fue descartado El residuo de la extracción inicial de etanol al 70%
de prolamina se extrajo con cinco volúmenes de agua destilada para 60 minutos para recuperar la fracción de
albúmina (sobrenadante). El residuo después de este paso se extrajo con cinco volúmenes de 5% (p / v) NaCl
durante 60 minutos para obtener la fracción de globulina (sobrenadante), y finalmente el residuo se extrajo con
cinco volúmenes de 0.1 mol L-1 NaOH durante 60 minutos para producir la fracción de glutelina. Mejorar la
recuperación de proteína, cada paso de extracción se repitió dos veces.
Las fracciones de albúmina, globulina y glutelina se purificaron por precipitación isoeléctrica a pH 4.1, 4.3 y 4.8,
respectivamente, seguido de lavado del precipitado con agua destilada. Las fracciones de proteína se liofilizaron
y se mantuvieron a -20ºC hasta su uso.
Las fracciones de proteína también fueron extraídas por el convencional procedimiento en el que se extrajo
albúmina primero, seguido de la extracción de globulina, prolamina y glutelina usando los mismos solventes
como se describió anteriormente y con todas las demás condiciones de extracción permanecido sin cambios.
Proteínas obtenidas por los dos diferentes los procedimientos de extracción se compararon mediante
electroforesis en gel utilizando el kit Bio-rad SDS-PAGE (Bio-rad). Los geles se corrieron en una Tampón Tris /
glicina / SDS (pH 8,3) en condiciones reductoras. Después que fueron fijados y teñidos con Coomassie brillante
al 0,1% (p / v) azul en una mezcla de 10% de ácido acético (v / v) y 40% de metanol (v / v), luego se destiñen
con una mezcla de ácido acético al 10% y 40% Metanol.

Hidrólisis enzimática de la proteína de salvado de arroz

Las cuatro fracciones de proteína de salvado de arroz (RBP), obtenidas como se describe anteriormente, se
hidrolizaron con cuatro proteasas comerciales, concretamente Alcalase, Neutrase, Flavourzyme y Protamax, en
sus respectivas condiciones óptimas (Alcalase, 60∘C, pH 8.0; Neutrase, 45∘C, pH 7.0; Flavourzyme, 50ºC, pH
6,0; Protamax, 50∘C, pH 7.0) para 240 min. Alícuotas (2 g) de la proteína en polvo liofilizada, obtenida como
descrito anteriormente, fueron redisueltos o suspendidos en 40 mL de 10 mmol L-1 de tampón de fosfato y el
pH se ajustó por 0.1 mol L NaOH o 0.1 mol L HCl. La proporción de enzima a sustrato (E / S), basado en el
contenido de proteína, se fijó en 1: 100 (p / p) para todos enzimas. Las mezclas de reacción se mantuvieron en
suspensión usando baños de agua con agitación establecidos a sus temperaturas óptimas respectivas, y los
valores de pH se mantuvieron constantemente durante todo el proceso hidrolítico mediante la adición de 1 mol
de NaOH L-1 o 1 mol L HCl. Las muestras de los hidrolizados se tomaron periódicamente y calentar
inmediatamente en un baño de agua a 95∘C durante 10 minutos para inactivar la enzima. Las muestras se
enfriaron en un baño de agua helada durante 10 min, centrifugar a 10 000 × g durante 15 min y los
sobrenadantes se tomaron como hidrolizados RBP. Los hidrolizados fueron utilizado directamente para
determinar el grado de hidrólisis de proteínas y concentración soluble de péptidos y proteínas, o liofilizado y
almacenado a -20 ° C hasta que se use para el análisis de sus bioactividades.

Determinación de la concentración de péptido soluble y proteína en hidrolizados de proteínas

La concentración soluble de péptido y proteína en los hidrolizados de RBP se cuantificó utilizando el kit de
ensayo de proteínas BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con albúmina de suero bovino (BSA)
como el estándar. El reactivo de trabajo BCA se preparó mezclando 50 partes del reactivo A con 1 parte de
reactivo B. Muestras de RBP hidrolizados o estándar BSA (25 μL) se mezclaron con los 200 mL. Reactivo BCA
en micro placas, que se cubrieron e incubaron durante 30 minutos a 37 ° C antes de la medición de la
absorbancia en 562 nm, que luego se comparó con la curva estándar BSA (20-2000 μg mL).

Determinación del grado de hidrólisis

El grado de hidrólisis (DH) en cada etapa de la digestión fue determinado midiendo la cantidad de grupos amino
libres en la muestra utilizando el método colorimétrico TNBS descrito por Adler-Nissen. En resumen, se
mezclaron muestras de hidrolizado (0,5 ml) con 0.25 mL de 0.01% (p / v) de solución de TNBS seguida de
incubación a 37ºC durante 120 minutos y la reacción se detuvo mediante la adición de 0,125 mL de 1 mol de L
HCl. La absorbancia se midió a 335 nm y en comparación con una curva estándar de leucina (0.25-2 amino
meq g-1 en tampón de fosfato de sodio 10 mmol L-1, pH 7.9) para obtener la concentración de grupos amino
libres. El total número de grupos amino en la muestra (htot) fue determinado por hidrolizando completamente
los enlaces peptídicos en la muestra primero con 6 mol L-1 HCl a 120 ° C durante 24 h, seguido del mismo
colorimétrico procedimiento descrito anteriormente. El DH, definido como la relación% del número de enlaces
peptídicos rotos (h) con respecto al número total de enlaces por unidad de peso (htot), se calculó como: DH =
(h / htot) × 100%.

Determinación de la actividad inhibidora de la α-amilasa

La actividad inhibidora de la α-amilasa se ensayó siguiendo el método descrito por Yu et al. con ligeras
modificaciones. Brevemente, Los hidrolizados de RBP liofilizados se redisolvieron en 75 mmol L-1 tampón de
fosfato (pH 7,2) a 10 mg mL-1. Cincuenta microlitros de α-amilasa (0,5 unidades mL-1) se premezcló con 500
μL de muestras de hidrolizado en tampón de fosfato de sodio 20 mmol L-1, pH 6.9. Después de la incubación
durante 10 minutos, 500 μL de almidón al 1% solución (en 20 mmol de tampón de fosfato de sodio L-1, pH 6,9)
fue agregado para comenzar la reacción. La reacción se llevó a cabo a 25 ° C durante 5 minutos y terminado
por la adición de 1 ml de dinitrosalicílico Reactivo de color ácido (DNS) (40 mmol L-1 DNS, 1.0 mol L-1 tartrato
de potasio y sodio tetrahidrato y 0,4 mol de NaOH L-1) e incubación a 100 ° C durante 5 min. Después de que
las muestras se hayan enfriado a temperatura ambiente, se eliminaron 100 μL de cada tubo y transferido a una
microplaca de 96 pocillos, diluido mediante la adición de 100 μL de agua a cada pozo y la absorbancia se midió
a 540 nm. Se resta una lectura en blanco (sin enzima) de cada pocillo. Los farmacológica α-amilasa inhibidor
acarbosa se ensayó el De la misma manera y usado como control positivo. El inhibidor de α-amilasa la actividad
(%) se calculó usando la ecuación:
Donde Acb es la absorbancia del testigo en blanco, Ac es absorbancia del control, Asb es la absorbancia del
blanco de muestra y Como la absorbancia de la muestra.

Determinación de la actividad inhibidora de la α-glucosidasa

La actividad inhibidora de la α-glucosidasa se analizó utilizando el método descrito por Nampoothiri et al.23
hidrolizados de RBP liofilizados se redisolvieron en tampón de fosfato de sodio 100 mmol L-1 (Ph 6.9) a 10 mg
mL-1. Alícuotas (50 μL) de los hidrolizados y 50 μL de solución 5 mmol L-1 p-nitrofenil-α-D glucopiranósido (en
el mismo tampón de fosfato) se mezcló en una microplaca de 96 pozos, que se incubó a 37 ° C durante 5 min.
Tampón de fosfato (100 μL) que contenía 0.1 U mL-1 α-glucosidasa luego fue agregado a cada bien y la
absorbancia a 405 nm se registró continuamente cada 30 s durante 30 min con un lector de microplacas a 37 °
C. los inhibidores farmacológicos acarbosa se incluyó como un positivo controlar. La actividad inhibidora de la
α-glucosidasa (%) se calculó usando la ecuación:

Donde Acb es el área bajo la curva del testigo en blanco, Ac es área bajo curva del control, Asb el área bajo curva
de muestra en blanco y como es el área bajo la curva de la muestra.

Determinación de la actividad inhibidora de la ECA

La actividad inhibidora de la ECA se analizó de acuerdo con el método descrito por Adjonu et al.24 En resumen,
10 μL de solución de ACE (0.25 unidades mL-1 en agua MilliQ) y 30 μL de hidrolizados de RBP (10 mg mL-1
en 50 mmol de tampón Tris HCl L-1 que contiene 300 mmol L-1 NaCl, pH 7,5) en una microplaca de 96 pocillos.
El plato fue incubado a 37 ° C durante 5 min y 150 μL de FAPGG (0.88 mmol L-1 en el mismo tampón) a cada
pocillo dentro de 30 s. La descomposición en la absorbancia a 340 nm debido a la degradación de FAPGG por
ACE se controló durante 50 min. La actividad de ACE era expresado como la pendiente de la disminución de la
absorbancia en 340 nm (ΔA) sobre el intervalo lineal desde el 10º hasta el 35º minuto. El inhibidor farmacológico
captopril se incluyó como positivo controlar. La actividad inhibidora de la ECA se calculó usando los siguientes
ecuación:% de inhibición de ACE = [1- (ΔAinhibitor / ΔAcontrol)] × 100, donde ΔAinhibitor y ΔAcontrol son las
pendientes de las muestras y el control, respectivamente.

Aislamiento y purificación de péptidos activos

- Ultrafiltración

Se recogieron los hidrolizados de glutelina catalizados por Alcalase a los 240 min. y fraccionado por
ultrafiltración usando Amicon Ultra-15 unidades de filtro centrífugo (Merck Millipore, Melbourne, Australia). Los
hidrolizado (10 ml) se cargó primero en una unidad Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-10 (corte MW, 10
kDa), que se centrifugó a 4000 × gy 4 ° C durante 10 minutos para obtener la fracción con MW> 10 kDa como
retenido. El permeado fue cargado en otra unidad Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-3 (MW límite de 3
kDa) y, después de la centrifugación a 4000 × gy 4 ° C para 30 minutos, se separó en una fracción MW de 3-10
kDa (retenido) y MW <fracción de 3 kDa (permeato). El volumen de cada fracción se midió y la concentración
de proteína, así como la actividad β-glucosidasa de las fracciones fue determinada por los mismos métodos
como se describió anteriormente.

- Cromatografía de intercambio de iones

La fracción con las actividades más altas de inhibición de enzimas después la ultrafiltración se separó por
cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna BioRad Mini Macro-Prep High Q (BioRad, Sydney,
Australia). Dos mililitros del hidrolizado fueron cargados en la columna. Se usó tampón Tris (20 mmol L-1, pH
8,0) como el tampón de columna (A) y el tampón de elución (B) fueron 1 mol de NaCl L-1 a un flujo de 1 ml min-
1. Se utilizó un programa de elución en gradiente: 0-15 min 100% de A, 15-30 min 10% B, 30-45 min 20% B,
45-60 min 30% B, 60-75 min 50% B y 75-90 min 100% B. Eluente se controló a 280nm y se recogieron picos,
se combinaron y dessalado utilizando columnas PD midiTrap G-10 (GE Healthcare, Sydney, Australia). La
desalación se realizó mediante la adición de 16.0 mL de agua milliQ para equilibrar la columna PD midiTrap G-
10, seguido de la carga 1 mL de muestra. Después de que la muestra ingresó completamente en la cama
compacta, Se agregaron 0.7 mL de agua milliQ y el flujo continuo descartado. Finalmente, se agregaron 1,2 mL
de agua milliQ y el eluyente fue coleccionado. El hidrolizado desalado se concentró usando un concentrador de
vacío de mesa CentriVap (Labconco, Kansas) City, MO, EE. UU.) Operaron en la oscuridad a 4 ° C bajo un
vacío de 206 mbar durante 24 h antes de analizar la actividad de la inhibición de la α-glucosidasa.

- Análisis de espectrometría de masas en tándem cromatografía líquida de secuencias peptídicas

La fracción de intercambio iónico recogida con la mayor de las actividades de inhibición de la α-glucosidasa
fueron analizadas por Liquid cromatografía- espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS) para determinar
las secuencias peptídicas. El sistema LC-MS / MS consistió de un sistema de cromatografía nano-líquido
Ultimate 300 (Dionex, Amsterdam, Países Bajos) acoplado a una masa LTQ-FT Ultra espectrómetro equipado
con una fuente de electrospray (Thermo Electron, Bremen, Alemania). La columna analítica era un nano
Columna Magic C18 LC (75 μm × 10 cm, 3 μm, 200 Å; Michrome Bioresources, Auburn, CA, EE. UU.). Las fases
móviles fueron (A) 0.1% ácido fórmico en agua y (B) acetonitrilo: agua (8: 2) que contiene 0.1% de ácido fórmico.
La separación se realizó de la siguiente manera: 0-4 min 2% a 10% B, 4-40 min 10% a 45% B, 40-41 min 45%
a 85% B, 41-41,5 min isocrático con 85% B, 41,5-42 min 85% a 2% B, 42-50 min isocrático con 2% B. Se
registraron los espectros de masa para m / z 350-1750 y los iones más abundantes fueron seleccionados para
MS / MS escaneos. Las muestras se analizaron por duplicado y los datos se procesaron usando MASCOT
Distiller (Matrix Science, Inc., Boston, MA, ESTADOS UNIDOS). Los péptidos se identificaron por comparación
con la proteína base de datos para Oryza sativa del Centro Nacional de Biotecnología Información (NCBI). La
base de datos BIOPEP de la Universidad de Warmia y Mazury en Olsztyn, Polonia, se utilizaron para determinar
los posibles fragmentos bioactivos dentro de una secuencia peptídica.

Cinética de la inhibición de la α-glucosidasa

Para determinar el modo de inhibición del RBP aislado fracciones hidrolizadas contra α-glucosidasa, inhibición
enzimática las pruebas se realizaron con sustrato creciente (p-NPG) concentraciones (1, 2, 3.5 y 5 mmol L-1)
en ausencia y presencia de hidrolizado de RBP a 0.5 y 1.0 mg mL-1. Los datos se utilizaron para construir un
diagrama Lineweaver-Burk siguiendo la cinética de Michaelis-Menten de acuerdo con el procedimiento descrito
por Thu Phan et al.

Análisis estadístico

El experimento completo, a partir de la digestión de cada proteína fracción, se realizó dos veces y cada análisis
se realizó al menos en duplicado (n≥4). Los resultados se presentaron como media ± estándar desviación. El
ANOVA de una vía se realizó con SPSS 21.0 (SPSS) Inc., Chicago, IL, EE. UU.) Para determinar si existen
diferencias significativas existen entre los tratamientos y la prueba de Duncan se utilizó para separar diferencias
significativas entre los medios en el nivel del 5%.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Extracción de fracciones de proteína para salvado de arroz

En experimentos preliminares, se encontró que la albúmina, la globulina y fracciones de prolamina obtenidas

por la extracción convencional procedimiento se contaminaron con pequeñas cantidades de fenólica ácidos,
que interferían con el análisis de sus actividades antioxidantes. Para superar este problema, se modificó el
procedimiento de extracción donde la prolamina se extrajo primero con etanol al 70% (v / v). Esto permitió la
eliminación de ácidos fenólicos libres del salvado muestra mientras que los ácidos fenólicos coextraídos con
prolamina se removido precipitando repetidamente la proteína con acetona. Para asegurarse de que el
procedimiento modificado efectivamente estaba extrayendo las proteínas objetivo, proteínas de salvado de arroz
también se extrajeron con el procedimiento convencional de Osborne, y los perfiles SDS-PAGE de las proteínas
obtenidas por los dos procedimientos se compararon (Fig. 1).
Figura 1. Patrones de SDS-PAGE de proteínas de salvado de arroz extraídas por el método convencional de
Osborne (1) y el procedimiento modificado utilizado en este estudio (2).

Figura 2. Hidrólisis de las proteínas de salvado de arroz por cuatro enzimas diferentes. Alcalase 2.4 L (círculos),
Protamax (cuadrados), Flavourzyme 1000 L (triángulos) y Neutrase 0.8 L (diamantes). Todos los resultados son
medios de cuadruplicados con la barra de error representando una desviación estándar.

Los resultados muestran que los perfiles de SDS-PAGE de las proteínas se extrajeron por los dos
procedimientos fueron muy similares, lo que demuestra que el el procedimiento modificado no alteró las
proteínas que se extraían. Los tamaños moleculares de las proteínas generalmente están de acuerdo con
aquellos informado en la literatura, aunque algunas bandas más grandes que Apareció 75 kDa en la fracción
de glutelina en el presente estudio que no han sido reportados previamente Estos podrían estar entrecruzados
proteínas formadas por enlaces disulfuro entre diferentes polipéptidos como lo señalan Agboola et al. En cuanto
a los rendimientos de extracción, el procedimiento modificado extrajo aproximadamente un 27% menos de
albúmina, 40% menos de globulina, 18% más de glutelina y la misma cantidad de prolamina Parece que algunas
de las bandas de prolamina (p. la banda de 16 kDa) probablemente fueron contaminados por la glutelina
fracciones según lo observado por otros investigadores.

Grado de hidrólisis de proteínas y concentración de péptidos en hidrolizados de proteína de salvado de

arroz.

La hidrólisis de RBP avanzó rápidamente para todas las fracciones de proteína durante los primeros 60 minutos,
pero se ralentizó significativamente a partir de entonces (Figura 2). Con la exención para la hidrólisis catalizada
por Protamax, un tiempo de incubación de más de 60 minutos causó muy poco más aumento en el DH de las
proteínas. Tendencias similares de hidrólisis tienen se informó sobre la proteína dreg de arroz. La hidrólisis más
extensa ocurrido con albúmina y glutelina donde alcanzó el DH alrededor del 28% después de 240 min con
Protamax. La menor hidrólisis ocurrió con la prolamina, para la cual el DH generalmente estaba debajo 10%,
excepto la hidrólisis catalizada por Protamax, que alcanzó un valor de aproximadamente 16%. Para globulina,
el DH fue generalmente mayor más del 10% después de 60 minutos de reacción, excepto la hidrólisis catalizada
por Flavourzyme, cuyos valores fueron menores al 5%. Los DH más alta de albúmina y glutelina fueron
probablemente atribuibles a su mayor solubilidad en sistemas acuosos siendo el primero soluble en agua
mientras que el último soluble en soluciones alcalinas, lo que los haría más accesibles al ataque enzimático.
Estos valores de DH son ampliamente comparables con los resultados informados en la literatura. Hamada, por
ejemplo, informó un DH de 8.8% para proteína de salvado de arroz hidrolizada por Flavourzyme mientras que
Zhao et al. informó un DH 3.0% y 16.9% para proteína hidregistrada de arroz dreg por Flavourzyme y Protamax,
respectivamente. Debe ser apuntado fuera, sin embargo, que estos autores usaron proteínas crudas en sus
estudios mientras que las fracciones proteicas purificadas se usaron en la presente investigación.

De las cuatro preparaciones de proteasa utilizadas en el estudio, Protamax se encontró que era el más eficiente
de lejos para la hidrólisis de las cuatro fracciones de proteína. Alcalase fue el segundo más eficiente enzima
para la digestión de albúmina, glutelina y prolamina, seguido por Neutrase, mientras que Flavourzyme fue el
menos eficiente para todas las fracciones de proteína. Como se mencionó anteriormente, la baja eficiencia de
Flavourzyme para hidrolizar proteínas de arroz también fue informado por Zhao et al. mientras que Alcalase se
encontró de manera similar como más eficiente para hidrolizar gluten de trigo en comparación con proteasas
ácidas tales como tripsina y pancreatina.
Actividades inhibidoras de la α-amilasa de la proteína de salvado de arroz hidrolizados

La α-amilasa es una de las enzimas clave involucradas en la digestión del almidón de la dieta, liberando
oligosacáridos que pueden ser digerido aún más a la glucosa que se absorbe rápidamente por el cuerpo.

Tabla 1. Actividad de α-amilasa y actividad de β-glucosidasa (medida como microgramos de equivalente de

acarbosa por peso seco de proteína de miligramo) del hidrolizados de diferentes proteínas de salvado de arroz
(albúmina, globulina, glutelina y prolamina) hidrolizados por diferentes preparaciones enzimáticas durante 240
min.

Los resultados se dan como medias ± SD. a-dData en la misma columna con diferentes letras de superíndice
son significativamente diferentes (P ≤0.05, n = 4).
ND, no detectable.

Tabla 2. Actividad de inhibición de la ECA (IC50, mg de proteína mL-1) de los hidrolizados de diferentes
proteínas de salvado de arroz hidrolizadas por diferentes enzimas
preparaciones para 240 minutos

Los datos son medios ± SD. a-dData en la misma columna con diferentes letras de superíndice son
significativamente diferentes (P ≤0.05, n = 4). El valor IC50 para el fármaco farmacológico estándar captopril es
de 25,4 nmol L-1.

Por lo tanto, la inhibición de la α-amilasa se considera una de los enfoques más efectivos para la atención
diabética. La Tabla 1 presenta las actividades inhibidoras de a-amilasa de diversos hidrolizados de RBP
producido por las cuatro enzimas diferentes. Hidrolizados de RBP mostró actividades inhibidoras significativas
de a-amilasa, que variaron de 6.9 a 56.1 μg de acarbosa equivalente a la proteína mg-1. Esto esencialmente
significa que el consumo de alrededor de 18 a 145 mg de la Los hidrolizados de RBP serían equivalentes a la
administración oral de 1 mg de acarbosa, uno de los medicamentos estándar utilizados para el manejo de la
diabetes. Los hidrolizados de Glutelin mostraron mayor actividad inhibidora de α-amilasa en la mayoría de los
casos, seguido por albúmina y globulina hidrolizados, mientras que las actividades de los hidrolizados de
prolamina fueron mucho más bajos, siendo más de cinco ocho veces más bajos que los de los hidrolizados de
glutelina. De cuatro enzimas, Alcalase produjo hidrolizados con la mayor actividad inhibidora de la α-amilasa
para todas las fracciones proteicas excepto la globulina, donde el hidrolizado catalizado por Protamax exhibió
la mayor actividad. Además, los hidrolizados generados por Protamax para el otras tres fracciones de proteína
dieron las segundas actividades más altas, seguidas por hidrolizados catalizados por Neutrase, mientras se
producen hidrolizados por Flavourzyme mostró la menor inhibición de α-amilasa actividad. Las tendencias
coinciden ampliamente con las del grado de hidrólisis de proteínas, que demuestra que son los péptidos
presente en los hidrolizados que son más probablemente responsables de la inhibición de la actividad de α-
amilasa. Hay un informe escaso en la literatura sobre la actividad inhibidora de α-amilasa de cereales o plantas
hidrolizados de proteínas Un estudio reciente ha encontrado que los hidrolizados de las proteínas de la cebada
podrían inhibir la α-amilasa.31 α-amilasa nativa inhibidores en arroz y trigo con pesos moleculares de 14-20
kDa han sido reportados.32,33 Sin embargo, los inhibidores nativos de α-amilasa, si presente, era poco
probable que fueran responsables de las actividades de α-amilasa encontrado en el presente estudio, ya que
las actividades se correlacionaron con el grado de hidrólisis de proteínas. Por lo tanto, parece que el presente
estudio es el primero en informar sobre la capacidad de los hidrolizados de RBP para inhibir la actividad de α-
amilasa.

Figura 3. Actividad inhibidora de la α-glucosidasa de fracciones de ultrafiltración de arroz salvado de glutelin

hidrolizados. GA, hidrolizado de glutelina catalizado por Alcalasa; GAU1 a GAU3, fracciones de ultrafiltración
de 1 a 3. Todos los resultados son cuadruplicados de media ± SD. a-c Las letras diferentes sobre las barras
indican que los valores fueron significativamente diferentes (P <0.05).

Actividades inhibidoras de la α-glucosidasa de la proteína de salvado de arroz hidrolizados.

La α-glucosidasa es otra enzima clave involucrada en la digestión del almidón escisión de residuos de glucosa
enlazados α-1 → 4 desde el extremo no reductor de dextrinas para liberar una sola molécula de glucosa que el
cuerpo puede absorber fácilmente, Por lo tanto, la inhibición de esta enzima es otra estrategia efectiva para
controlar la diabetes. La Tabla 1 también muestra las actividades inhibidoras de a-glucosidasa de RBP
hidrolizados producidos por las cuatro proteasas diferentes. Similar a sus actividades de inhibición de α-amilasa,
estos hidrolizados también exhibió una actividad inhibidora considerable contra α-glucosidasa, que van desde
7,0 a 53,2 μg de acarbosa equivalente mg-1 proteína.

Figura 4. Separación cromatográfica de intercambio iónico del permeato de ultrafiltración MW <3 kDa del
hidrolizado de glutelina catalizado por Alcalase (A) y la actividad inhibidora de α-glucosidasa de los picos
recogidos (B). GA, hidrolizado de glutelina catalizado por Alcalasa; GAIE1 a GAIE7, intercambio iónico recogido
fracciones 1 a 7 de GA. Todos los resultados son cuadruplicados de la media con las barras de error que
representan una desviación estándar. letras a-dDifferent encima de las barras indican que los valores fueron
significativamente diferentes (P <0.05).

Los hidrolizados de albúmina y glutelina generalmente mostraron mayores actividades que las de la globulina y
la prolamina, aunque el hidrolizado de globulina catalizado por Protamax también exhibió una alta actividad de
51,7 μg de acarbosa equivalente a la proteína mg-1. Por el contrario, las actividades de los hidrolizados de
prolamina fueron considerablemente más bajo, independientemente de qué enzima se utilizó para hidrolizar la
proteína. De las cuatro enzimas, Alcalase produjo hidrolizados con las más altas actividades inhibidoras de α-
glucosidasa para la mayoría de sustratos excepto globulina, donde catalizado por Protamax los hidrolizados
dieron la mayor actividad. Además, hidrolizados generado por Protamax con las otras tres proteínas tenían la
segunda actividad más alta, seguida de catalizada por Neutrase hidrolizados mientras que los hidrolizados
producidos por Flavourzyme tenían las actividades más bajas Estas tendencias coinciden ampliamente con las
observado para actividades inhibidoras de a-amilasa. Hidrolizados de las proteínas de granos gastados por
Alcalase inhibieron la actividad de la enzima en un 56%, 18 un resultado ampliamente comparable a la nuestra
y que sugiere que los hidrolizados de proteína de cereales tienen el potencial para ser desarrollado en
ingredientes funcionales para cuidado dietético.

Actividades inhibidoras de ACE de hidrolizados de proteína de salvado de arroz

Las actividades inhibidoras de ACE de los hidrolizados de RBP se controlaron durante el período de hidrólisis
de 240 minutos, pero con el propósito de la brevedad, los datos no se muestran Los hidrolizados de RBP
mostraron una significativa Actividades inhibidoras de ACE, que aumentaron con el tiempo de hidrólisis durante
hasta 120 minutos cuando las actividades comenzaron a estabilizarse o declive. Estos datos se usaron para
calcular los valores de IC50 para la inhibición de ACE por RBP hidrolizados y los resultados se presentan en la
Tabla 2.
El hidrolizado de albúmina catalizada por Protamax mostró la mayor actividad inhibidora de la ECA con un valor
IC50 de 5,2 mg de proteína mL-1. Los hidrolizados de glutelina producidos por Protamax y Alcalase y los
hidrolizados de albúmina catalizada por Alcalase también exhibieron relativamente altas actividades inhibidoras
de la ECA con valores de IC50 de 6.2, 8.4 y 9.2 mg proteína mL-1, respectivamente. De las cuatro fracciones
de proteínas, albúmina y los hidrolizados de glutelin mostraron actividades más altas que la globulina y prolamin
hidrolizados y el último exhibió actividades más bajas.
En cuanto a las cuatro proteasas diferentes utilizadas, Protamax y Alcalase dieron hidrolizados de actividades
comparativamente más altas mientras que aquellos generado por Flavourzyme mostró las actividades más
bajas. Estas las tendencias son similares a la inhibición de la α-amilasa y la α-glucosidasa resultados descritos
arriba. Li et al.34 informaron valores de IC50 de 0.14 y 0,62 mg de proteína mL-1 para arroz y mung tratados
con Alcalasa hidrolizados de proteína de frijol, respectivamente. Barbana y Boye35 también informó un valor
IC50 mayor (228 μg de proteína mL-1) para el garbanzo proteína hidrolizada por una combinación de Alcalase
y Flavourzyme, mientras que los valores de IC50 de 18.1-36.0 μg de proteína mL-1 se informaron para
hidrolizados de pepsina de la proteína de la comida de canola.36 Estos valores son considerablemente más
alto que nuestros resultados, lo que indica la proteína de salvado de arroz puede no ser el mejor sustrato para
producir hidrolizados con Actividad de inhibición de la ECA de valor práctico.

Aislamiento, purificación e identificación de péptidos activos

Para identificar péptidos con fuertes actividades inhibidoras de la α-glucosidasa en los hidrolizados de RBP,
hidrolizados de glutelin catalizados por Alcalase a los 240 min se sometieron a ultrafiltración e intercambio iónico
cromatografía y las fracciones con mayor inhibición enzimática actividad se analizaron por LC-MS / MS para
determinar las secuencias peptídicas. El hidrolizado de glutelina catalizado por Alcalasa era seleccionado
porque tenía la mayor actividad inhibitoria contra tanto α-amilasa como α-glucosidasa. actividad inhibidora de la
α-glucosidasa fue utilizado como la prueba para detectar las fracciones recolectadas durante el proceso de
aislamiento ya que esta actividad se pensaba que era más crítico que la actividad de inhibición de α-amilasa
para el manejo de diabetes.
La ultrafiltración separó los hidrolizados en tres fracciones:
MW> 10 kDa (42.1 ± 1.6% del hidrolizado total), MW 3-10 kDa (25.5 ± 1.1%) y MW <3 kDa (11.4 ± 0.7%). La
última fracción (MW <3 kDa) mostró la mayor inhibición de α-glucosidasa actividad, que era comparable a la del
extracto crudo, seguido por la fracción MW 3-10 kDa, mientras que la fracción con las masas moleculares más
grandes (PM> 10 kDa) mostraron la actividad más baja (Fig. 3). Estos resultados demostraron que es
extensamente péptidos hidrolizados con masas moleculares relativamente pequeñas que son en gran parte
responsables de la actividad inhibidora de la α-glucosidasa de los hidrolizados Esto concuerda con los
resultados descritos anteriormente que las actividades de inhibición de la α-glucosidasa de los hidrolizados
fueron en general correlacionado con el DH, y es consistente con los informes de otros hidrolizados de proteínas.
La fracción MW <3 kDa se sometió a un fraccionamiento adicional mediante cromatografía de intercambio
iónico, que produjo siete principales fracciones con diversas actividades inhibidoras de \ alpha - glucosidasa
(Fig. 4). La fracción con la actividad más alta fue GAIE1 (glutelin Alcalase fracción de intercambio iónico 1) que
se eluyó con tampón Tris (20 mmol L-1, pH 8), mientras que las siguientes fracciones fueron eluídas por NaCl
(1 mol L-1). Dado que la columna utilizada fue un intercambio de aniones columna, los resultados indican que
GAIE1 consistió en péptidos básicos mientras que las siguientes fracciones fueron péptidos ácidos neutros o
débiles fracciones. Esto sugiere que los péptidos básicos de los hidrolizados de RBP fueron inhibidores de α-
glucosidasa más efectivos que neutral o débil péptidos ácidos.
GAIE1 fue analizado posteriormente por LC-MS / MS para identificar las secuencias peptídicas en la fracción,
lo que dio como resultado la identificación catión de 13 secuencias peptídicas únicas con seis a 32 aminoácidos
residuos (Tabla 3). Dentro de estos péptidos, ocho secuencias peptídicas con dos a cuatro residuos de
aminoácidos combinados con aquellos Base de datos BIOPEP con actividades inhibitorias de α-glucosidasa
informadas. Los sistemas LC-MS / MS utilizados en el presente estudio no permitieron
identificación de péptidos de menos de seis aminoácidos. Sin embargo, es probable que dichos péptidos más
pequeños estuvieran presentes en el permeato de 3 kDa.

Cinética de inhibición

El diagrama de Lineweaver-Burk se usó para determinar el modo de inhibición de α-glucosidasa por GAIE1
(figura 5). Como puede verse, interceptaciones de las parcelas a diferentes concentraciones de inhibidor difieren
en los ejes xey, lo que indica que la inhibición era de modo mixto Estos resultados sugieren que la fracción
GAIE1 puede unirse tanto a la enzima como a la enzima-sustrato complejo pero con diferentes afinidades El
modo de acción de GAIE1 era esencialmente el mismo que el de la acarbosa, que también exhibe un modo de
acción mixto no competitivo contra α-glucosidasa.

CONCLUSIÓN

Los resultados obtenidos en el presente estudio mostraron que los hidrolizados de proteína de salvado de arroz
poseen α-amilasa significativa, β-glucosidasa y las actividades de inhibición de la ECA, que generalmente se
correlacionan con el grado de hidrólisis de proteínas. Las bioactividades de la albúmina y los hidrolizados de
glutina producidos por Protamax y Alcalase son especialmente fuerte En particular, la α-amilasa y β glucosidasa

Figura 5. Gráfico de Lineweaver-Burk de la actividad inhibidora de la α-glucosidasa en la presencia del

hidrolizado de glutelina catalizada por Alcalasa a diferentes concentraciones. GA, hidrolizado de glutelina
catalizado por Alcalasa; GAIE1, fracción de intercambio iónico recogida 1 de GA. Todos los resultados son
cuadruplicados de la media con las barras de error que representan una desviación estándar.

actividades inhibidoras de la albúmina y los hidrolizados de glutelina producidas por Alcalase y Protamax son
comparables en magnitud a esa del medicamento antidiabético estándar acarbosa. La β-glucosidasa la actividad
inhibidora de los hidrolizados de glutelin catalizados por Alcalasa fue más alto en la fracción MW <3 kDa, que
se eluyó en condiciones alcalinas condiciones y se identificó que contienen 13 péptidos únicas secuencias con
seis a 32 residuos de aminoácidos. Cuando la cantidad de hidrolizado de proteína que se puede consumir de
forma segura se toma en consideración, parece que estos hidrolizados tienen el potencial de ser desarrollado
en una alternativa a la acarbosa en forma de dieta o suplementos nutracéuticos.