Anda di halaman 1dari 10

BIOKIMIA LANJUT 2016

Pemurnian cepat protein kinase C dari


otak tikus
Sebuah metode baru menggunakan protamine-agarosa
kromatografi kolom afinitas

Marie W. Wooten Michel Vanden Plas 'dan Andre E. NEL


1. Departemen Kedokteran, Divisi Hematologi / Onkologi,
University of Alabama, Birmingham
2. Departemen Biokimia, Stellenbosch Medical School,
Tygerberg
3. Departemen Internal Medicine, Stellenbosch Medical School,
Tygerberg(Diterima September 22/11 Desember 1986) - EJB
86 1008

Kami menjelaskan pemurnian cepat protein kinase C dari sitosol otak tikus menggunakan substrat
tertentu, protamine-digabungkan dengan agarosa. kromatografi berurutan pada DEAE-sephacel, fenil-
Sepharose CL-4B, dan kolom protamine-agarose menghasilkan pemurnian 1500 kali lipat dari protein
kinase analisis C. SDS-PAGE dari enzim murni dibuat protein doublet dari 77-80 kDa. doublet ini
diakui oleh anti serum poliklonal terhadap protein kinase C. proteolitik pencernaan masing-masing
mempunyai ikatan protein yang dihasilkan polipetida yang sama.
Prinsip yang mendasari metode pemurnian protamine sulfat juga diklarifikasi. Protamine dapat
bertindak sebagai Ca2+/ fosfolipid-independen substrat. Kami menunjukkan fosforilasi protamine pada
kolom; protamine terfosforilasi tidak mengikat enzim dengan afinitas yang sama dan modifikasi
kovalen ini paling mungkin bertanggung jawab untuk melepaskan enzim yang terikat dari kolom
setelah penambahan Mg2+ dan ATP. C kinase inhibitor, H7, menghambat protamine fosforilasi dan
tergantung pada dosis tetapi tidak mencegah pengikatan enzim ke kolom protamine-agarosa. Oleh
karena itu kami menyimpulkan bahwa protamine berinteraksi dengan pusat aktif enzim
memungkinkan untuk terfosforilasi, di mana kemampuan protamamine menjadi kehilangan afinitas
mengikat C kinase.

Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Page 1


BIOKIMIA LANJUT 2016

TEORI DASAR

Protein kinase C adalah protein yang sangat besar peranannya untuk kerja hormon dalam
tubuh hormon, neurotransmiter, dan faktor pertumbuhan [l – 3]. Enzim ini telah menerima cukup
perhatian sejak aktivasi digabungkan untuk ligand-reseptor dimediasi omset fosfolipid [l]. Protein-
kinase C didominasi oleh sitosol dalam berbagai jenis sel [l, 2] dan memiliki jaringan distribusi di
mana-mana, dengan otak menjadi salah satu sumber terkaya [4]. Peningkatan ion kalsium intraseluler
sebagian mengaktifkan enzim dan memberitahukan sinyal translokasi ke membran plasma [5, 6].
diasilgliserol, dan transiently dihasilkan dari hidrolisis inositol 4,5-bifosfat, sepenuhnya mengaktifkan
enzim dan bersama-sama dengan phosphatidylserine memberikan tanda untuk membran [l, 7]. Sejak
awal pemurnian protein kinase C dari otak tikus [8] dan hati sapi [9], beberapa skema telah digunakan
untuk mendapatkan enzim homogen [10 – 14], yang paling umum digunakan Metode adalah berasal
dari Uchida [11] memanfaatkan phosphatidylserine kromatografi kolom. Namun, karena baik
degradasi enzim atau aktivasi oleh copurifying Ca2+ , tergantung protease, prosedur yang panjang
telah menghasilkan rendah jumlah enzim. Meskipun protamine sulfat memiliki (sebelumnya
digambarkan sebagai C) substrat protein kinase, yang terfosforilasi dalam Ca2+ / cara fosfolipid-
independen [15], mekanisme khusus untuk acara ini tetap merupakan teka-teki. Kami secara khusus
tertarik untuk melihat apakah protamine dapat digunakan sebagai langkah dalam mengembangkan
afinitas penjernihan

Korespondensi M. W. Wooten, Divisi Hematologi / Onkologi, Departemen Kedokteran, Universitas


Alabama di Birmingham,Stasiun University, Birmingham, Alabama, Amerika Serikat 35.294

Singkatan. H7, 1- (5-isoquinolinylsuIfonyl) -2-methylpiperazine dihidroklorida; PtdSer,


phosphatidylserine; PhMeS 02F, phenylmethylsulfonyl fluoride. Enzim. Protein kinase C (EC
2.7.1.37); V8 protease (EC3.4.21.19). Skema kation dan, jika demikian, memberikan penjelasan
molekuler untuk acara tersebut. Kami menunjukkan hal berikut:
a) protamine digabungkan ke agarosa dapat digunakan sebagai langkah adjuvant selama
pemurnian;
b) protamine fosforilasi adalah Ca2+ /fosfolipid-independen namun penambahan Ca2+/ fosfolipid
lebih lanjut bisa meningkatkan fosforilasi;
c) interaksi dengan substrat mungkin terlibat pusat aktif dalam seperti
dengan cara yang protamine telah terfosforilasi, yang di atasnya enzim dirilis;
d) Ca2+ / fosfolipid independen fosforilasi protamine dapat dihambat oleh H7, mengkonfirmasi
efek penghambatan pada tingkat pusat aktif;
e) dijelaskan sebelumnya aktivitas kinase protamine adalah homolog
untuk protein aktivitas kinase C.

Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Page 2


BIOKIMIA LANJUT 2016

PROSEDUR PENELITIAN

Bahan
Histon (tipe 111-S), phosphatidylserine, diolein, protamine sulfat dan protamin-agarosa yang
diperoleh dari Sigma. [Y-32P] ATP dibeli dari Amersham. Phenyl-Sepharose CL-4B diperoleh dari
Pharmacia. DEAE sephaceldan kertas Whatman 3mm diperoleh dariOrang apa. Gel poliakrilamid
elektroforesis, penentuan proteinreagen dan spidol massa molekul standar yang dari Bio-Rad. H7
diperoleh dari Seikagaku Kogyo Co.dan reagen perak-noda berasal dari Akurat Kimia dan Ilmiah Co
Semua reagen lain dari kemurnian tertinggi tersedia.

Persiapan ekstrak kasar


25 tikus laki-laki Sprague Dawley (200-250 g) dipotong kepalanya dan cairan otak cepat
ditampung. Jaringan (40g, basah Berat) dihomogenisasi dalam blender Waring selama 10 s dengan 8
volume buffer A (20 mM Tris / Cl, pH 7,4; 2 mM EDTA; 10 mM EGTA; 250 mM sukrosa; 1 mg / ml
PhMeS02F; 50 mM 2-mercaptoethanol; 250 U / ml aprotinin). Homogenat disentrifugasi selama 60
menit pada 100.000 xg, setelah itu supernatan dikumpulkan, disaring melalui glass wool, dan pH
disesuaikan dengan 7,6 dengan 1 M Tris / CI, pH 8,0.

DEAE-sephacel fraksinasi
Ekstrak kasar (320 ml) diaplikasikan pada laju alir dari 60 ml / jam untuk kolom DEAE-
sephacel (2,5 cm x 20 cm) diseimbangkan dengan penyangga B (20 mM Tris / Cl, pH 7,4; 5 mM
EGTA; 2 mM EDTA; 50 mM 2-mercaptoethanol). Itu Kolom dicuci dengan 200 ml buffer yang sama
dan kemudian dengan 500 ml buffer C (20 mM Tris / Cl, pH 7,4; 1 mM EGTA; 1 mM EDTA; 50 mM
2-mercaptoethanol) pada tingkat aliran 125 ml / jam. Enzim dielusi dari kolom dengan linear gradien
0-0,3 M NaCl dalam buffer C (600 ml) dengan laju alir dari 60 ml / jam. Fraksi masing-masing 6 ml
dikumpulkan. setiap kelima fraksi diuji aktivitas protein kinase C, konduktivitas dan absorbansi pada
280 nm. profil protein dielusi dianalisis dengan SDS-PAGE. Fraksi yang mengandung protein C
aktivitas kinase (Ca2 + / PtdSer dirangsang atas basal) yang dikumpulkan dengan cara ini.

kromatografi kolom fenil-Sepharose CL-4B


fraksi DEAE-sephacel yang dikumpulkan disesuaikan dengan konduktivitas buffer D (20 mM
Tris / Cl, pH 7,4; 0,5 mM EDTA; 0,5 mM EGTA; 10 mM 2-mercaptoethanol (mengandung 1,5 M
NaCl dan diterapkan langsung ke dicuci 5-ml dan dikemas fenil-Sepharose CL-4B kolom pada laju
alir 60 ml / jam. Kolom dicuci dengan 50 ml penyangga D + 1,5 M NaCl pada laju alir dari 125 ml / h
diikuti oleh sapuan 50-ml penyangga D + 0,6 M NaCl pada laju alir 50 ml / jam. Kolom
dikembangkan dengan gradien linier 30-ml 600-0 mM NaCl dalam buffer D pada laju alir 25 ml /
jam, diikuti oleh tambahan 30-ml sapuan buffer D saja. fraksi
1 ml setiap dikumpulkan dan diuji untuk protein kinase C aktivitas dan protein dielusi dari resin
dianalisis dengan SDS-PAGE.

kromatografi kolom Protamine-agarosa


Protamine-agarosa (1 ml) pra-disetimbangkan dalam buffer E (20 mM Tris / CI, pH 7,4; 0,5
mM EDTA; 10 mM 2-mercaptoethanol) mengandung 0,6 M NaCl. Fraksi yang mengandung aktivitas
kinase dikumpulkan, disesuaikan dengan konduktivitas buffer E + 0,6 M NaCl dengan penyangga E +
4,5 M NaCl dan diaplikasikan langsung ke kolom protamine-agarosa di aliran tingkat 25 mlih. Kolom
dicuci dengan 30 ml penyangga

Table 1. Purification ofprotein kinase C


Enzyme activity was determined with histone type 111-S as substrate under reaction conditions as described under Materials
and Methods.Activity was calculated as the difference between activities obtained in the presence of Ca2 +/PtdSer/diolein or
basal (with EGTA present).
All other conditions are as described in the text
Fraction Volume Protein Specific activity Activity Purification Yield

Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Page 3


BIOKIMIA LANJUT 2016

Ml mg nmol min-1 mg-1 nmol min-1 -fold %


Crude pool 250 1500 3.3 5000 1 100
DEAE- 150 256 11.87 3038 4 61
Sephacel pool
Phenyl- 30 18 127.78 2300 40 46
Sepharose
pool
Protamine- 6 0.2 4950 990 1500 20
agarose pool

Ara. 1. Chromatographic purifications TEP bersama-sama dengan SDS-PAGE. (A) DEAE-sephacel


kromatografi kolom protein larut otak tikus. 100000 x g supernatan ekstrak otak tikus diaplikasikan
pada kolom DEAE-cellulose diseimbangkan dengan penyangga B. Kolom washcd ekstensif dengan
buffer B dan C. protein dielusi dengan 0-0,3 M gradien NaCl dalam buffer C (meningkat gradien dari
kiri ke kanan). Sebuah aliquot dari setiap fraksi kelima diuji di hadapan (0--0) atau tidak adanya (0-0)
dari Ca2 + / PtdSer / diolein. Sebuah puncak Ca2 + / PtdSer / diolein-menstimulasi aktivitas
ditemukan dalam pecahan 24 - 45. (B) SDS-PAGE dari DEAE-sephacel kromatografi kolom. setiap
kelima fraksi (30 pl) dari kolom DEAE-sephacel dianalisis pada 12,5% SDS / gel poliakrilamid. The
Coomassie gel biru bernoda ditampilkan dengan spidol massa molekul di sebelah kiri. Pecahan 25 -45
sesuai dengan mereka dengan puncak utama aktivitas kinase C. (C) Phenyl-Sepharose
CL-4B kromatografi kolom protein kinase C. DEAE-sephacel fraksi (25 -45) dikumpulkan dan
diterapkan untuk fenil-Sepharose Cl- Kolom 4B diequilibrasi dalam buffer D + 1,5 M NaCl. Enzim
terikat dielusi dari matriks dengan gradien linier dari 600-0 mM NaCl dalam buffer D, diikuti oleh
tambahan 30 ml penyangga D. Setiap fraksi kelima diuji untuk aktivitas C kinase di hadapan (0-0)
atau tidak adanya (0-0) dari CaZf / PtdSer / diolein. Sebuah puncak yang tajam aktivitas dielusi dari
fraksi 35 - 65. Catatan: wash tambahan efektif dihapus semua aktivitas enzimatik terikat. (D) SDS-
PAGE dari fenil-Sepharose CL-4B kromatografi kolom. Setiap fraksi kelima (30 pl) dari kolom fenil-
Sepharose CL4B dianalisis pada gel poliakrilamid 12,5%. gel Coomassie biru bernoda ditunjukkan
dengan molekul spidol massa di sebelah kiri. Pecahan 35 -65 sesuai dengan mereka dengan puncak
utama aktivitas kinase C (PKC). Sebuah protein doublet dari perkiraan massa molekul 77-80 kDa
adalah mudah terlihat pada saat ini. (E) Protamine-agarose kromatografi kolom protein kinase C.
Phenyl- Sepharose CL-4B fraksi 35-65 dikumpulkan dan diterapkan untuk kolom protamine-agarosa
I-ml pra-disetimbangkan dalam buffer E. Setiap ketiga fraksi diuji aktivitas kinase C di hadapan (0-0)
atau tidak adanya (0-0) dari Caz + / PtdSer. Panah 1: mengalir melalui; panah 2: penyangga E + 600
mM NaCl; panah 3: penyangga E + 500 mM NaCl, Mg2 + / ATP; Selengkapnya 4: penyangga E +
600 mM NaCl, Mgz + / ATP; Selengkapnya 5: penyangga E + 700 mM NaCl, Mg2 + / ATP;
Selengkapnya 6: penyangga E + 1.5 mM NaCl, Mgz + / ATP. Sebuah puncak tajam dari Ca 'aktivitas
+ / phosphoIipid-dependent dielusi segera setelah penambahan 600 mM NaCl yang mengandung Mgz
+ / ATP. (F) SDS-PAGE dari fenil-Sephdrose CL-4B kromatografi kolom. Setiap fraksi ketiga (30 pl)
dari kolom protamine-agarosa dianalisis pada gel poliakrilamid 12,5%. The Coomassie-bluestained
gel ditunjukkan dengan spidol massa molekul di sebelah kiri. Sebuah doublet 77/80-kDa protein
divisualisasikan dalam pecahan containig aktivitas C kinase (Fraksi 31 -42)

464
E + 0.6 M NaCl. Elution from the protamine-agarose resin was accomplished by four successive step-
washes consisting of 5 ml each of buffer E + 10 mM MgC12, 1 mM ATP and (a) 500 mM NaCl; (b)
600 mM NaCl; (c) 700 mM NaCl; and (d) 1.5 M NaCl. Fractions of 0.5 ml were collected at the
beginning of the Mg2+/ATP salt elutions. Both protein kinase C activity and SDS-PAGE profiles
were determined across the column.

Protein kinase C assay


Kegiatan protein kinase C secara rutin diuji dengan mengukur penggabungan 32Pf rom [y-
32P] ATPi nto lisin kaya betis timus histone [8 - 141. Campuran reaksi (100 1-11> terkandung 20

Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Page 4


BIOKIMIA LANJUT 2016

mM Pipa, pH 6,5, 20 pg histone, 10mm MgC12, 250 pM EGTA dan / atau 500 pM CaC12, 5 pg
PtdSer dan 1 pg diolein di tidaknya H7. dalam beberapa . Reaksi histone digantikan oleh 20 pg
protamine sulfat. Reaksi dimulai dengan penambahan 1 nmol [Y ~~ PIATP mengandung (0.5- 1.0) x
lo6 cpm, dan botol plastik yang diinkubasi pada 30 ° C selama 5 menit. Reaksi dihentikan oleh bercak
pada kertas Whatman 3mm dan cuci secara ekstensif di 20% asam trikloroasetat, diikuti oleh dua
mencuci berturut di 10% asam trikloroasetat dan radioaktivitas ditentukan dengan menghitung radiasi
Cerenkov. Penggabungan [y 32P] ATP adalah linear selama reaksi, dan Kegiatan itu sebanding
dengan jumlah enzim yang digunakan. Protein aktivitas kinase C dinyatakan sebagai dirangsang
Kegiatan (pmol 32P ditransfer min 'mg protein diKehadiran Ca2 + / PtdSer / diolein atas basal (EGTA
mengandung vial).
Fosforilasi protamine in situ pada agarose yang Kolom dicoba dengan penambahan enzim
yang diperoleh dari fenil-Sepharose kolam renang untuk volume kecil manik-manik di penyangga E +
0,6 M NaCl. Setelah 30 menit manik-manik dicuci dan diresuspensi dalam buffer E yang mengandung
0,5 M NaCl, 10 mM MgClz dan 1 mM ATP dengan 100 Ci / mol [Y ~~ PIATIPn-. cubations
dilakukan untuk periode waktu yang berbeda dan Reaksi dihentikan dengan merebus di Laemmli SDS
buffer sampel.

Penentuan jumlah marker enzim untuk agarosa protamine memanfaatkan probe [3H] phorbol 12,13-
dibutyrate
Aliquot dari 3 - 4 pg sempurified C kinase dari phenyl- yang Sepharose kolam renang yang
dicampur dengan 0-100 pM H7 sebelum Selain dari 50 ~ 1 5 0% su spension manik-manik protamine-
agarosa dalam buffer E ditambah 0,6 M NaCl. Setelah gemetar pada 4 ° C selama 1 jam, manik-manik
dicuci dua kali dalam buffer yang sama dan diresuspensi di 90 pl dari buffer 20 mM Tris, pH 6,8,
mengandung 100 mM KC1, 0,5 mM CaC12 dan 100 & ml PtdSer. Untuk ini ditambahkan lop1
suspensi untuk memberikan akhir 30nm [3H] phorbol 12,13-dibutyrate dengan tidak adanya atau
kehadiran kelebihan 100 kali lipat dari non-label penyelidikan [6, 16]. Setelah tiga mencuci dalam
buffer yang sama, manik-manik dipindahkan ke kilau botol dan dihitung.
Semua penentuan dilakukan dalam rangkap dua.

Satu dimensi elektroforesis gel


Satu-dimensi SDS / SDS-PAGE(SDS-PAGE) dilakukan baik pada gel 12,5% atau 7-12,5%
gradien seperti yang dijelaskan oleh Laemmli 1171.
Untuk Coomassie visualisasi biru protein, gel yang diwarnai dengan 1,5% Coomassie biru
cerah di 45% metanol dan 10% asam asetat, dan destained di 12% metanol, 12% asam asetat. Protein
penanda berikut digunakan: 200 kDa, myosin; 11 6 kDa, galaktosidase; 92 kDa, phosphorylase b; 66
kDa, sapi albumin serum; 45 kDa, ovalbumin; 31 kDa, karbonat anhidrase; 21 kDa, trypsin kedelai
inhibitor;14 kDa, lisozim.

Satu-dimensi pemetaan peptida


protein kinase dimurnikan C, yang diselesaikan pada 7- 12,5% gel gradien, kemudian
dipotong dan dicerna dengan Staphylococcus aureus V8 protease in situ. Peptida dihasilkan dianalisis
pada 17,5% SDS / gel poliakrilamid mengandung 1 mM EDTA [18]. Peptida divisualisasikan dengan
pewarnaan perak gel.

Imunoblotting
Protein dipisahkan dengan SDS-PAGE dipindahkan ke membran nitroselulosa [19] selama 90
menit pada 100 V dalam buffer mengandung 25 mM Tris / Cl, pH 8,3, 20% (v / v) metanol dan 0,1 O
/ O SDS. protein kinase immunoreactive C terdeteksi oleh reaksi berantai dengan antiserum poliklonal
kelinci untuk C kinase, peroksidase berlabel goat- (anti-kelinci antibodi) dan 4-kloro- 1-naftol sebagai
substrat.

Penentuan protein
protein ditentukan dengan menggunakan bovine serum albumin sebagai standar. Protein
ditentukan dengan metode Bradford [20]

Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Page 5


BIOKIMIA LANJUT 2016

HASIL

Ringkasan pemurnian
Kegiatan protein kinase C dielusi dari DEAE-sephacel Kolom sekitar 0,1 M NaCl (Gambar. 1
A), serupa konsentrasi garam yang sebelumnya dijelaskan untuk otak tikus sitosol [8]. enzim tersebut
secara maksimal dirangsang di hadapan kalsium dan fosfolipid. Fraksi yang mengandung puncak
protein aktivitas kinase C (Gambar. 1A dan B, fraksi 25 -45) dikumpulkan dan diterapkan untuk fenil-
Sepharose Cl- 4B kolom di hadapan 1,5 M NaCl. Setelah pembangunan dari resin dengan
menurunnya NaCl (0,6-0 M), sebagian besar C aktivitas protein kinase dielusi menjelang akhir
gradien (Gambar. 1 C). Tambahan 30 ml penyangga dielusi sisanya enzim yang terkait dengan resin.
Analisis SDS-PAGE dari fraksi dikumpulkan dari elusi mengungkapkan protein doublet dari 77-80
kDa (Gambar. 1 D), yang bertepatan dengan aktivitas enzimatik. Puncak fraksi protein kinase C
Kegiatan dikumpulkan dan diterapkan langsung ke protamine sebuah kolom agarosa. Kolom ini
dikembangkan dengan buffer yang mengandung peningkatan jumlah NaCl (0.5- 1,5 M) dan Mg2 + /
ATP. Sebuah puncak yang tajam aktivitas protein kinase C dielusi dari resin dengan adanya Mg2 + /
ATP (Gambar. 1 E). fraksi terelusi dianalisis dengan SDS-PAGE dan mengungkapkan doublet dari I7
- 80 kDa (Gambar. JIKA), yang bertepatan dengan puncak Ca2 + / fosfolipid tergantung aktivitas
kinase. Tidak ada kontaminasi protein divisualisasikan dengan Coomassie pewarnaan atau dengan
autoradiografi dari aliquot dari enzim yang autophosphorylated di hadapan [Y ~~ PIA (TrePsu LTS
tidak ditampilkan}.

Ara. 2. Perak-bernoda gel setelah Cleveland peptida pemetaan protein kinase C doublet. Sebuah
sampel dari protein kinase C (5 pg) menjadi sasaranuntuk 7- 12% SDS-PAGE. Setelah pewarnaan dan
destaining, terlihat atas dan pita protein yang lebih rendah yang dipotong secara individual dari gel
dan diinkubasi dengan beberapa perubahan 62,0 mM Tris / HCl penyangga, pH 6,8, mengandung 1%
SDS, 1 mM EDTA dan 10% (v / v) gliserol (Equilibrium buffer) pada suhu kamar selama 60 menit.
irisan gel yang kemudian dipindahkan ke sumur dari SDS / gel poliakrilamid kedua (17,5%) dengan
susun gel 10-cm dan overlayed dengan 20 pl equilibrium buffer yang mengandung 20% gliserol. Hal
ini, pada gilirannya, dioverlay dengan 10 p1 equilibrium buffer yang mengandung 10% gliserol dan
100 ng S. aureus V8 protease. Berikut elektroforesis, gel perak bernoda dan fragmen peptida
divisualisasikan. Lane A: atas Band fragmen diselesaikan; jalur B: fragmen band yang lebih rendah
diselesaikan. ( gambar ada pada lampiran )

Tabel 1 merangkum hasil yang diperoleh berikut ini Skema pemurnian. Hasil dari otak tikus 40 g
adalah biasanya 200 pg. Protein homogen memiliki aktivitas spesifik dari 4950 nmol min 'mg-'. Ini
merupakan suatu pemurnian relatif 1500 kali lipat menjadi awal DEAE-sephacel kolam renang,
dengan yield 20%. Enzim tidak stabil jika dibekukan dalam buffer E dan lyophilized tapi tetap
sepenuhnya aktif selama beberapa bulan di - 80 "C disimpan dalam buffer E yang mengandung 50%
gliserol.

Karakterisasi ofprotein kinase C


Untuk menyelidiki sifat dari doublet homogen protein menjadi sasaran SDS-PAGE
memanfaatkan 7- 12,5% gradien. Dengan cara ini band yang sedikit dipisahkan. Protein individu yang
dipotong dari gel dan diperlakukan dengan S. aureus V8 protease in situ mengikuti metode Cleveland
et al. [18]. Analisis fragmen peptida oleh SDS-PAGE dan pewarnaan perak mengungkapkan peptida
yang sama fragmen yang dihasilkan baik dari 80-kDa (upper band) atau spesies 77-kDa (band yang
lebih rendah) (Gambar. 2). Selain itu, doublet diakui oleh anti serum poliklonal yang sama terhadap
protein kinase c ( data tidak ditampilkan )

Tabel 2. Pengaruh protamine fosforilasi pada pengikatan protein kinase C Sebuah alikuot (100 pl)
protein kinase C, diperoleh dari phenyl- yang Sepharose kolam itu diseimbangkan dengan protamin-

Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Page 6


BIOKIMIA LANJUT 2016

agarose (50 p1 dari 50% bubur diseimbangkan dengan penyangga E + 0,6 M NaC1) di microfuge
sebuah tabung pada suhu 4 ° C. Setelah 30 menit enzim terikat dielusi dariprotamine-agarosa oleh
inkubasi 15-min dari resin dengan penyangga E + 0,5 mM NaCl yang mengandung 10 mM Mg CI2 /
1 mM ATP (500 pl). resin dicuci dan berputar dalam microfuge Eppendorf. Itu terfosforilasi
protamine-agarose kemudian digunakan kembali sebagai sarana untuk menentukan apakah fosforilasi
substrat memiliki efek pada enzim mengikat. aliquot sama terfosforilasi dan nonphosphorylated
protamine agarosa (50 p1 dari bubur 50% dalam buffer E + 0,6 M NaC1) diinkubasi dengan 100 pl
fenil-Sepharose menggenang enzim. Enzim dielusi seperti dijelaskan di atas dan aliquot 10-pl
digunakan untuk uji protein aktivitas kinase C
Resin Enzyme bound Decrease in binding
Pmol min-1 mg-1 %
Non-phosphorylated protamine-agrose 3548 +/- 144 -
Phosphorylated protamine-agrose 367 +/- 137 90

Ara. 3. Autoradiogram dari in situ protarnine substrat fosforilasi. Protein kinase C (PKC) yang
diperoleh dari fenil-Sepharose kolam renang, dicampur dengan protamin-agarose dalam tabung
microfuge. Setelah 30 menit manik-manik agarosa dicuci dengan penyangga E + 0,6 M NaC1. Untuk
manik-manik (mengandung terikat C kinase) ditambahkan 10 mM MgClz dan 1 mM ATP
mengandung 100 Ci / mol [Y ~~ PIATIPnc. ubations yang dilakukan untuk 0 (lane I), 1 (jalur 2), 3
(jalur 3), 5 (jalur 4), 10 (jalur 5) dan 20 (jalur 6) min masing-masing diikuti oleh penambahan
Laemmli SDS
buffer sampel, mendidih, dan SDS-PAGE / autoradiografi. Sebuah standar protamine sulfat (non-
amobil) reaksi fosforilasi di Kehadiran (jalur 7) atau tidak adanya (jalur 8) enzim dihentikan oleh
mendidih di SDS buffer sampel untuk perbandingan.
Catatan: meningkat fosforilasi protamine di situ (triplet) dibandingkan dengan standar sulfat
terfosforilasi protamine doublet diakui oleh antiserum poliklonal yang sama terhadap protein kinase C
(data tidak ditampilkan).

Analisis protein interaksi kinase C / protamine


Kami selanjutnya melakukan eksperimen untuk menjelaskan mekanisme protein kinase C
mengikat protamine. ketika protamine sulfat digunakan sebagai substrat untuk mengukur protein
aktivitas kinase C, fosforilasi yang independen dari menambahkan kofaktor (Tabel 2), dibandingkan
dengan histone kaya lisin. Namun, setelah penambahan CaZt / PtdSer / diolein phos yang. Fosforilasi
dari protamin sulfat pada gilirannya bertanggung jawab untuk rilis dari kolom. Untuk menguji
hipotesis ini lebih lanjut, protein kinase C terikat untuk protamine agarose dalam buffer E + 0,6 M
NaCl diikuti oleh membasuh protein terikat dan Selain dari [Y ~~ P] AiTn Pth e kehadiran Mg2 + .A
nalysis dari produk terfosforilasi oleh SDS-PAGE / autoradiografi (Gambar. 3) menunjukkan
peningkatan tergantung waktu di fosforilasi protamine in situ pada resin (triplet dari band) serta
sedikit autofosforilasi pada enzim sendiri (top panah). Apalagi jika protamine itu terfosforilasi tidak
lagi terikat protein kinase C (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa resin tidak dapat digunakan lagi
kecuali diperlakukan dengan fosfatase sebelum pengikatan protein kinase C.
H7 baru-baru ini digambarkan sebagai kuat dan spesifik inhibitor protein kinase C [21, 221
dan bisa, karena itu, digunakan untuk lebih mendefinisikan interaksi antara kinase C dan protamine.
Kedua protamine sulfat dan jenis histon 111-S fosforilasi yang dihambat oleh H7, apakah reaksi yang
berjalan di tidaknya Ca '+ / fosfolipid (Tabel 3). Sejak H7 ditunjukkan untuk bersaing dengan ATP
tetapi tidak substrat mengikat ke pusat aktif [21, 221, mungkin diharapkan tidak mengganggu C
kinase mengikat protamine-agarosa kolom. Gagasan ini dikonfirmasi dengan menentukan aktual.

Tabel 3. Pengaruh H7 pada protein aktivitas kinase C Protein kinase C aktivitas diuji dengan baik
protamine atau histonesebagai substrat di hadapan atau tidak adanya kalsium, phosphatidylserineatau
diolein seperti yang dijelaskan di bawah Bahan dan Metode. hasil yangdilaporkan sebagai min nmol

Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Page 7


BIOKIMIA LANJUT 2016

'mg enzim proteinuria' dan mewakili meanf 1 standar deviasi (SD) dari eksperimen rangkap tiga
fosforilasi dari protamine dirangsang dua. hasil ini menunjukkan bahwa protamine dapat berinteraksi
dengan enzim dalam tidak adanya Ca2 + dari fosfolipid sedemikian rupa sehingga pusat aktif dipicu
untuk memfosforilasi mengikat substrat di hadapan Mg2 + dan ATP.

Tabel 4. Pengaruh H7 pada protein kinase C mengikat protamine agarose sebagaimana dinilai oleh
probe (3H] phorbol 12, LS-dibutyrate Aliquots enzim semipurified yang dicampur dengan 0- 100 pM
H7 sebelum penambahan manik-manik protamine-agarose dalam suspensi dalam buffer E + 0,6 M
NaCl. Setelah mencuci untuk menyingkirkan enzim non-terikat, yang manik-manik yang disuspensi
dalam 20 mM Tris, pH 6,8, Loo mM KCl, 0,5 mM CaClz dan 100 pg / ml PtdSer. volume reaksi
dibuat untuk 100 pl dengan penambahan 30 mM [3H] phorbol 12,13-dibutyrate (12,5 Ci / mmol)
dengan adanya atau tidak adanya kelebihan 100 kali lipat dari nonlabelled phorbol dibutyrate. Setelah
30 menit pada 30 ° C manik-manik yang dicuci, dipindahkan ke botol kilau dan dihitung.
Radioaktivitas
di hadapan unlabelled phorbol dibutyrate dianggap sebagai latar belakang dan dikurangi dari estimasi
yang diperoleh di hadapan label saja. Semua perkiraan dilakukan dalam rangkap dua dan dilaporkan
asmeans 1 SD jumlah enzim terikat ke kolom di hadapan atau tidak adanya H7 (Tabel 4).
Amount of H7 [3H] phorbol 12, 13 – dibutyrate bound
M Dpm
0 16769  5072
1 15711  6500
10 17462 4551
100 17921  2741

Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Page 8


BIOKIMIA LANJUT 2016

DISKUSI

Protamine, protein yang sangat dasar, yang telah dijelaskan sebagai substrat spesifik untuk
protein kinase C [15], adalah digunakan untuk pemurnian enzim. Tiga langkah prosedur yang
dijelaskan, menyediakan metode yang relatif sederhana untuk persiapan protein kinase homogen C.
Ini Hasil metode dalam hasil yang memadai dan memungkinkan penggunaan dimurnikan protein
kinase C sebagai reagen biokimia. Baru saja prosedur pemurnian dijelaskan [ll, 121 mahal dan
memakan waktu, menghasilkan jumlah yang sangat rendah enzim dimurnikan. Sebuah perbandingan
langsung dari skema pemurnian kami dengan lainnya dipublikasikan prosedur untuk mendapatkan
protein kinase homogen C disajikan pada Tabel 5.
pemurnian kami lebih lanjut substantiates pengamatan sebelumnya yang protamine kinase
dan C kinase adalah satu dan kegiatan yang sama [23]. Terlepas dari copurification, mereka memiliki
sejenis peta peptida dan sifat antigenik serupa. Alasan untuk muncul sebagai doublet adalah pasti pada
tahap ini tapi bisa melibatkan modifikasi pasca-translasi. Selanjutnya, pengamatan ini tidak terbatas
pada jaringan otak, tetapi diterapkan juga untuk limpa (M. Wooten, hasil tidak dipublikasikan). Selain
itu, Sifat persiapan homogen kami cukup mirip dengan yang dijelaskan untuk protein kinase C
memanfaatkan jaringan lainnya sumber atau metode pemurnian [ll, 121. Demikian juga dengan
spesifik Kegiatan kira-kira sama dengan yang diperoleh dengan metode lain (4619 atau 4135 nmol
min 'mg-' masing-masing) [ll, 12].
Selain itu, data kami menjelaskan cara di mana C kinase berinteraksi dengan protamin.
Dengan tidak adanya Mg2+ dan ATP enzim mampu mengikat protamine bergerak di bawah kondisi
penyangga dijelaskan. Ketika Mgz + dan ATP disediakan, substrat adalah terfosforilasi dan enzim
dirilis. Karena ini terjadi di Ca2+ / fosfolipid-independen cara, ada kemungkinan bahwa pada suatu
mengikat awal perubahan konformasi terjadi kemudian, yang mengaktifkan enzim. Ini berarti
setidaknya beberapa interaksi dengan pusat aktif enzim, baik secara langsung atau melalui alosterik
terkait erat situs efektor. Itu masih harus dibuktikan apakah protamine yang sama molekul dapat
mengimbangi diduga terkait erat PtdSer dan Ca2+ situs -binding atau apakah lebih kompleks
perubahan stoikiometri yang dibawa di lebih distal situs. Ca2+, PtdSer dan diolein bisa meningkatkan
fosforilasi lebih jauh, yang menyiratkan bahwa setidaknya beberapa dari alosterik situs mengikat tetap
kosong.
Sejauh ini, sebagian besar inhibitor protein kinase C berinteraksi langsung dengan situs
fosfolipid mengikat [24, 25]. Kami, bagaimanapun, menunjukkan bahwa H7 menghambat Ca2+ /
tergantung fosfolipid fosforilasi protamine. menegaskan ini yang H7 berinteraksi dengan pusat aktif
dan protamin yang fosforilasi assay bisa memberikan cara mudah menentukan lokasi aksi diduga C
inhibitor kinase perhatian telah difokuskan pada protein kinase C dalam beberapa tahun terakhir
karena peran regulasi dalam beragam proses seluler. Dengan bantuan H7, C kinase spesifik inhibitor,
dan studi mengenai fosforilasi substrat tertentu kita bisa mulai mengungkap peran peraturan yang
kompleks bahwa sistem kinase ini bermain di modulasi biologi fungsi. Protamine fosforilasi dapat
digunakan untuk menyaring mungkin inhibitor C kinase yang beroperasi di pusat aktifnya dan
kromatografi protamine-agarosa dapat digunakan untuk memurnikan enzim dalam jumlah yang relatif
besar. Woodgett dan Hunter [26] baru-baru ini menggambarkan keberadaan yang dari dua bentuk
protein kinase C (78 - SO-kDa spesies). Mereka telah disediakan Data imunologi dan physiochemical
mendukung gagasan bahwa isoform protein ini ada di beberapa jaringan. Di dukungan lebih lanjut
untuk keberadaan isoform enzim, analisis protein kinase pada otak tikus otak . C cDNA klon memiliki
menunjukkan bahwa heterogenitas mungkin karena alternatif splicing [27]. Data kami akan sejalan
dengan temuan ini. Saya takan menarik untuk menentukan apakah dua bentuk yang istimewa
diungkapkan dan mungkin signifikansi fisiologis ekspresi ini.

Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Page 9


BIOKIMIA LANJUT 2016

DAFTAR PUSTAKA

1. Nishizuka, y. ( 1984 ) science ( wash. DC ) 225, 1365-1370.


2. Nishizuka, Y. (1984) Alam (Lond.) 308,693-698.
3. Cooper, R. A., Brunwald, A. D. & Kuo, A. L. (1982) Proc. Nutl Acad. Sci. USA 79,2865-
2869.
4. Kuo, J. F., Anderson, R. G. G., Wise, B. C., Mackerlova, L., Salomonson, J., Brackett, N. L.,
Katoh, N., Shoji, M. & Wrenn, R. W. (1980) Proc. Nutl Acad. Sci. USA 77, 7039 - 7043.
5. Wooten. M. W. & Wrenn, R. W. (1984) FEBS Lett. 171, 183-186.
6. Wolf, M., Cuatrecasas, P. & Sahyoun, N. (1985) J. Biol. Chem.
7. Ganong, B. R., Loomis, C. R .. Hannun, Y. A. & Bell, R. M.
8. Kikkawa, U., Takai, Y., Minakuchi, R., Inohara, S. & Nishizuka,
9. Wise, B. C. & Kuo, J. F. (1982) J. Bid. Chem. 257, 8481 -8488.
10. Le Peuch, C. J., Ballester, R. & Rosen, 0 M. (1983) Proc. NutlAcud. Sci. USA 80,6858 -
6862.
11. Uchida, T. & FILBURN, C. R. (1984) J. Bid. Chem. 259, 1231 1 -12.314.
12. Parker, P. J., stabel, S. & Waterfield, M. D. (1984) EMBO J. 3,953-959.
13. Schatzman, R. C., Raynor, R. L., Fritz, R. B. & Kuo, J. F. (1983)Biochem. J. 209, 435-443.
14. Kikkawa, U., Masayoshi, G., Koumoto, J. & Nishizuka, Y.(1 986) Biochem. Biophys. Res.
Commun.135.636 - 643.
15. Takai, Y., Kishimoto, A ,, Iwasa, Y., Kawahara, Y., Mori, T. & Nishizuka, Y. (1979) J. Biol.
Chem. 254, 3692-3695.
16. Tanaka, Y., Miyake, R., Kikkawa, U. & Nishizuka, Y. (1986) J. Biochem. (Tokyo) 99, 257-
261.
17. Laemmli, U. K. (1970) Alam (Lond.) 277, 680.
18. Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirschner, M. W. & Laemmli,
19. Gershoni, J. M. & Palade, G. E. (1983) Anal. Biochem. 131, 1 -
20. Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72,248-254.
21. Hidaka, H., Inagaki, M., Sachiyo, K. & Sasaki, Y. (1984) Biokimia 23, 5036-5041.
22. Kawamoto, S. & Hidaka, H. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun I25,258-264.
23. Inoue, M., Kishimoto, A ,, Takai, Y. & Nishizuka, Y. (1977) J.Biol. Chem. 252, 7610-7616.
24. Mori, T., Takai, Y., Minakuchi, R., Yu, B. & Nishizuka, Y. (1980) J. Bid. Sahabat karib. 255,
8378380.
25. Katoh, N., Raynor, R. L., Wise, 3 €. C., Schatzman, R. C., Turner,R. S., Helfman, D. M.,
Fain, J. F. & Kuo, J. F. (1982) Biochem.
26. Woodgett, J. R. & Hunter, T. (1987) Mol. Sel. Biol., Dalam pers.
27. Ono, Y., Kurokawa, T., Kawahara, K., Nishimura, O.,Marumoto, R., Igarashi, K., Sugino,
Y.,Kikkawa, U., Ogiga,K. & Nishizuka, Y. (1986) FEBS Lett. 203, 111 -115.260, 15718-
15722.(1986) Puoc. Nutl Acud. Sci. USA 83, 1184-1188.Y. (1982) J. Bid. Chem. 257,
13.341-133.348.
28. U.K. (1977) J. Tawaran. Chem.252.1102-1106.15.J. 202,217-224.

Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Page 10