UNIVERSIDAD PERUANA UNIÓN

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE ENFERMERÍA

MANUAL PRÁCTICO DE
MICROBIOLOGÍA – II Unidad

AUTORES

Miguel Otiniano Trujillo

Microbiólogo Parasitólogo

Pool Marcos Carbajal

Biólogo

2018

Alumno
 PRÁCTICA Nª 04

RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

IDENTIFICACIÓN DE LA SERIE BLANCA

OBJETIVO

▪ Identificación y reconocimiento de los elementos formes de la sangre de la serie blanca

en una muestra de sangre periférica.

INTRODUCCIÓN

En la práctica médica, la diferenciación de los elementos formes como leucocitos es

importante para establecer el diagnóstico de algunas patologías relacionadas.

En general, los estudios de sangre se hacen en una extensión o frotis sanguíneo,

obtenidas por la distribución de la sangre en un soporte como las láminas portaobjeto.
Por lo tanto, la evaluación microscópica y morfológica de extendidos de sangre constituye
la base del diagnóstico hematológico, que se complementa con la determinación de
enzimas características y otros componentes celulares mediante técnicas citoquímicas.
En esta sesión observaremos las diferentes morfologías de las células de la sangre.

TINCIÓN DE WRIGHT O GIEMSA

Esta coloración es conocida como policromática debido a que produce varios colores. Es
una solución de alcohol metílico de un colorante ácido (eosina) y otro básico (azul de
metileno). El alcohol sirve como un fijador del frotis sanguíneo al portaobjetos. El
amortiguador, que consiste en una solución tamponada, mantiene el pH del colorante y
favorece la mejor absorción por los diferentes componentes celulares.

Técnica:

 Colocar el frotis secado al aire sobre una rejilla o cubeta de tinción con la sangre
hacia arriba.
 Cubrir completamente el portaobjetos o cubreobjetos con el colorante de Wright
gota a gota. Dejarlo que permanezca en el frotis aproximadamente de 5-8 minutos,
para fijar los glóbulos sanguíneos.
 El colorante deberá cubrir completamente el portaobjetos, pero no debe derramarse
por los bordes. Deberá agregarse una cantidad adicional si éste se comienza a
evaporar.
 Agregar directamente al colorante un volumen igual de amortiguador de Wright,
para evitar la coloración débil. Esperar la formación de brillo metálico. Puede
usarse de igual manera agua desionizada. Dejar actuar de 10-15 minutos.
 Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensión presente un
aspecto rosado al examinarlo a simple vista.
 Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol
para eliminar cualquier resto de colorante.
 Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersión.
LEUCOGRAMA
Los leucocitos de dividen en:

A) GRANULOCITOS
Aquellos que tienen gránulos específicos: neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Los gránulos
observados en extendido están cargados de lisosomas y enzimas hidrosolubles que son
agentes antibacterianos necesarios para la digestión de partículas fagocitarias.
1. NEUTRÓFILOS

1.1. Neutrófilos abastonados. Es el granulocito en banda. Mide de 10µm a 14µm, núcleo

condensado que puede presentar una o dos constricciones, pero no tiene puente de
cromatina. El citoplasma presenta gránulos específicos e inespecíficos, membrana celular
lisa, citoplasma de color ligeramente rosado dependiendo de la coloración.

1.2. Neutrófilos segmentados. Mide igualmente de 10 µm a 14 µm, núcleo que presenta

mayor condensación y está formado por varios lóbulos (hasta 4) unidos por puentes de
cromatina. El citoplasma está cargado de gránulos.

Alteraciones leucocitarias de los neutrófilos

 Granulaciones tóxicas. Son gránulos basófilos más oscuros que lo normal y se
observan durante el transcurso de infecciones severas y estadios tóxicos.
 Vacuolas tóxicas. Se observan en el citoplasma de los neutrófilos durante
infecciones severas y estados tóxicos.
 Cuerpos de Dohle. Son áreas teñidas de azul en el citoplasma de los
polimorfonucleares neutrófilos y se encuentra en infecciones, especialmente en
neumonías.
  Palillo de tambor. Es un pequeño apéndice (cromatina sexual) que permite
conocer el sexo del individuo mediante una simple observación en un frotis de
sangre
 Polisegmentación. Son neutrófilos con 5 o más lobulaciones. Se observa en las
anemias por deficiencia de vitamina B-12 y ácido fólico, Síndrome de Down y otras
anomalías.
 Desviación a la izquierda. Significa el aumento de las formas inmaduras (en
banda o cayado, y juveniles) dentro de los neutrófilos. Constituye un importante
valor diagnóstico y pronóstico. Puede observarse en: infecciones e intoxicaciones.
 Desviación a la derecha. Corresponde a la hipersegmentación nuclear. La mayoría
de PMN presenta más de 5 lobulaciones.

2. EOSINÓFILOS. Son parecidos a los neutrófilos, pero son algo mayores. Generalmente
el núcleo es bilobulado y lo que más caracteriza a esta célula es la presencia de gránulos
color naranja-marrón notorios, muchas veces estos gránulos hacen que se pierda la
membrana celular por el rompimiento de ésta, ya que estas células son muy frágiles.

3. BASÓFILOS. La característica más importante de esta célula es la cantidad de

gránulos de color azul negruzco que se encuentra ocupando toda la célula (cuando la
célula es madura) y parte de la célula cuando ésta es inmadura. Presenta un núcleo que
no se logra observar por la cantidad de gránulos que contienen histamina y heparina.

Maduración de la Serie Granulocítica

B) AGRANULOCITOS
No poseen gránulos. Aquí tenemos a los linfocitos y monocitos.

4. LINFOCITOS. Pueden ser: linfocitos grandes y linfocitos pequeños.

Linfocitos grandes. Miden de 15µm a 25µm, presentan generalmente un núcleo

ligeramente oval discretamente indentado, la cromatina es densa pero no tanto como en el
linfocito pequeño (esto lo puede confundir con el monocito). Citoplasma abundante, azul
pálido y puede contener gránulos azurófilos inespecíficos.

Linfocitos pequeños. Miden de 9µm a 15µm, presentan un núcleo que ocupa casi toda la
célula, excéntrico, cromatina fuertemente densa. El citoplasma es escaso, basófilo y puede
contener gránulos azurófilos inespecíficos.

5. MONOCITOS. Son los leucocitos de mayor tamaño en la sangre (14m a 20m). Su

núcleo es generalmente excéntrico, aunque puede ser central. Su cromatina nuclear es
laxa, distribuida en forma regular, la forma del núcleo generalmente es de una madeja de
lana o arriñonada, aunque puede tener forma de un abastonado. El citoplasma es de color
gris y puede presentar gránulos inespecíficos (azurófilos) que carecen de significado
clínico.

Maduración de la serie linfoide

RESULTADOS

1. Dibujar o pegar los diferentes tipos de células blancas que has observado en la práctica

Neutrófilo Segmentado Neutrófilo Abastonado

 Eosinófilo Basófilo

Linfocito Monocito

2. ¿Qué es un Hemograma?
3. ¿En qué casos clínicos puede haber una leucocitosis?
4. ¿En qué casos clínicos puede haber una leucopenia?
5. ¿Cómo se puede saber diagnosticar una leucemia?
6. ¿Explique en qué consiste una leucemia?
7. Dibuje o esquematice la eritropoyesis

RESPUESTAS
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS O WEBGRÁFICAS

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 PRÁCTICA N° 5
DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS
OBJETIVO
 Investigar en la sangre la presencia o ausencia de los antígenos A, B y Rh que se
localizan en la superficie de los glóbulos rojos, utilizando anticuerpos específicos
para cada uno de ellos.
 Evidenciar la reacción antígeno – anticuerpo (Ag – Ac) por medio de la reacción de
aglutinación.

FUNDAMENTO

Todas las células del cuerpo humano, incluyendo los glóbulos rojos, están rodeadas por
una membrana plasmática que contiene glucoproteínas determinadas genéticamente,
denominadas antígenos. Sobre las membranas de los glóbulos rojos hay ciertos antígenos,
llamados epítopos, que determinan el grupo sanguíneo de una persona.

Si el receptor de una transfusión de sangre tiene anticuerpos, que reaccionan con los
antígenos presentes en las células transfundidas, los glóbulos rojos se agruparán, o
aglutinarán, y luego se romperán, lo que resulta en una reacción a la transfusión de
sangre potencialmente mortal. Por eso es importante determinar el grupo sanguíneo de un
individuo antes de realizar transfusiones de sangre, para evitar la mezcla de sangres
incompatibles. Aunque hay muchos antígenos diferentes presentes en las membranas de
los glóbulos rojos, los antígenos ABO y Rh causan las reacciones de transfusiones más
vigorosas y potencialmente mortales.

Los grupos sanguíneos del sistema ABO están determinados por la presencia o ausencia
de dos antígenos: el tipo A y el tipo B. Debido a que estos antígenos están determinados
genéticamente, una persona tiene dos copias (alelos) del gen para estas proteínas, una
copia de cada progenitor. La presencia de estos antígenos se debe a un alelo dominante y
su ausencia se debe a un alelo recesivo.

En el plasma sanguíneo se encuentran preformados los anticuerpos contra los antígenos

A y B. Una persona tiene anticuerpos sólo contra los antígenos que no están en sus
glóbulos rojos, por lo que una persona con sangre del grupo A tendrá anticuerpos anti-B.

En la Tabla se resumen los antígenos de los glóbulos rojos y los anticuerpos del plasma
para cada grupo sanguíneo.
El factor Rh es otra proteína determinada genéticamente que puede estar presente sobre
las membranas de los glóbulos rojos.

Aproximadamente el 85% de la población es Rh positivo (Rh1), y sus glóbulos rojos tienen

esta proteína en su superficie. Los anticuerpos contra el factor Rh no se encuentran
preformados en el plasma. Son producidos por un individuo Rh negativo (Rh2) sólo
después de la exposición a células sanguíneas de una persona que es Rh1. Esta
exposición puede ocurrir durante el embarazo, cuando las células Rh1 del bebé atraviesan
la placenta y exponen a la madre al antígeno.

Sistema sanguíneo ABO

Sistema sanguíneo Rh

MUESTRA BIOLÓGICA

1 ml de sangre completa con o sin anticoagulante.

MATERIALES Y REACTIVOS

 Tubos de ensayo 12 x 75 mm.

 Laminas portaobjeto.
 Punteras amarillas.
 Aplicadores de madera.
 Guantes.
 Antisuero “A”.
 Antisuero “B”.
 Antisuero Rh (Anti - D).
PROCEDIMIENTO

1. Rotular las láminas de vidrio.

2. Depositar 01 gota de sangre en una placa portaobjeto, realizar este proceso en tres
láminas para cada antisuero.
3. Depositar los antisueros respectivos. (anti A, anti B, anti D).
4. Con un aplicador de madera mezclar la suspensión.
5. Leer la presencia de aglutinación haciendo movimientos de vaivén suavemente.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Grupo A: Si aglutina la placa con anti A. (Celeste).

Grupo B: Si aglutina la placa con anti B. (Amarillo).

Grupo O: No aglutinan las placas con anti A y anti B.

Factor Rh: Rh Positivo si aglutina el anti D. Rh Negativo si no aglutina.

RESULTADOS

Estudiante Aglutinación con Aglutinación con Aglutinación con Grupo

suero anti A suero anti B suero anti Rh Sanguíneo
CUESTIONARIO

1. Mencione los dos principales sistemas sanguíneos que existen en la especie humana.
2. Mencione tres sistemas sanguíneos diferentes que posee la especie humana.
3. ¿Cuál es el grupo sanguíneo que más predomina en América Latina y en el Perú?
4. ¿Por qué es importante que las personas cuando se van a casar sepan sus grupos
sanguíneos?
5. ¿Qué es la eritroblastosis fetal?
6. ¿Qué grupo sanguíneo se le considera el Donador Universal?
7. ¿Qué grupo sanguíneo se le considera el Receptor Universal?
8. Pegue la foto de los resultados sanguíneos de sus compañeros

RESPUESTAS
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
 PRÁCTICA Nª 6

DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS

OBJETIVOS

▪ Reconocer las características morfológicas y en los cultivos de las bacterias Gram

positivas
▪ Identificar bioquímicamente las diferentes bacterias Gram positivas de importancia
clínica.

INTRODUCCIÓN

Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clínica con forma
de cocos como Staphylococcus aureus, especies de Streptococcus, principalmente S.
pneumoniae y cocos anaerobios: Peptostreptococcus.

Entre los bacilos Gram positivos patógenos más comunes tenemos Bacillus anthracis,
Clostridium, Gardnerella, Listeria, Corynebacterium. Todas estas bacterias se encuentran
causando procesos infecciosos en los seres humanos y en algunos casos estas se
encuentran colonizando alguna parte del cuerpo junto con bacterias de la flora normal.
Por eso se hace necesario para su aislamiento e identificación realizar toma de muestras y
procesamiento bacteriológicos correctos.

Dentro de los Gram positivos, los cocos y en especial las especies de Streptococcus y los
Staphylococcus son los más fáciles de aislar e identificar mediante observación de
hemólisis, pruebas bioquímicas o diferenciales específicas como la prueba de catalasa
para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus, la prueba de coagulasa para diferenciar
Staphylococcus patógenos de los no patógenos, la reacción de Quellung para distinguir
neumococos etc.

MATERIALES

▪ Cultivos de Streptococcus pneumoniae en agar Sangre

▪ Cultivo de Staphylococcus aureus en agar Manitol salado y agar Sangre
▪ Tubos con plasma (1ml) y pipetas graduadas de 1 ml estériles
▪ Reactivo de peróxido de hidrógeno
▪ Equipo para la coloración de Gram
▪ Láminas portaobjetos
▪ Asas bacteriológicas
▪ Mecheros
▪ Microscopios

METODOLOGÍA

Pruebas bioquímicas y laboratoriales para diferenciar Staphylococcus y Streptococcus

1. Prueba de Hemólisis
 Observar el tipo de hemólisis que presentan las placas en agar Sangre
2. Prueba de la Catalasa: con una colonia de la placa de agar Sangre y con una de
Manitol salado.
3. Prueba de Coagulasa: en dos tubos con un ml de plasma cada uno, depositar en uno
0,5 ml del cultivo de Staphylococcus aureus y en otro un ml de Staphylococcus
epidermidis. Incubar 30 minutos a 37º C.
 4. Preparación de Frotis: preparar un frotis con las colonias que han desarrollado en
agar sangre y en agar manitol salado.

1. Con el asa de siembra

tomar una colonia de la
placa de Petri 2. Extender la muestra sobre la
lámina portaobjetos

3. Fijar el extendido con la

llama del mechero

La identificación de Staphylococcus y Streptococcus, se basa en la morfología de las

colonias que se observan en los cultivos primarios y en el tipo de hemólisis en agar
Sangre.

RESULTADOS. Dibujar o pegar las colonias gram positivas coloreadas

Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes

Prueba de la Catalasa o Peroxidasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición de peróxido de hidrógeno en
agua y oxígeno. Se encuentra presente en la mayoría de los microorganismos aerobios y
anaerobios facultativos excluyendo los estreptococos.
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rápida con
desprendimiento de burbujas: la enzima catalasa convierte el peróxido de hidrógeno
(H2O2) en agua y oxígeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar los géneros
Micrococcus y Staphylococcus: catalasa positiva del género Streptococcus: catalasa
negativa.

Con el asa de siembra se toma

una colonia del cultivo del
Peróxido de
microorganismo y se coloca en la
negativo. hidrógeno
lámina

(+) BURBUJEO: Staphylococcus

(-) NO BURBUJEO: Streptococcus

Positivo Negativo

5. Fermentación del Manitol

El agar Manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de

Staphylococcus patógenos en cultivos mixtos, ya que se aprovecha la capacidad de los
Staphylococcus de desarrollar en presencia de Cloruro de sodio (Na Cl) al 7,5 % y la de
fermentar manitol, en este caso se observará la formación de un halo amarillo en el agar
circundante a las colonias.
Prueba de la Coagulación del plasma

Staphylococcus aureus produce una proteína llamada coagulasa, capaz de aglutinar el

plasma tratado con oxalato, citrato o heparina en presencia de un factor contenido en el
suero.
Este factor sérico reacciona con la coagulasa, activando el fibrinógeno y produciendo un
coágulo o trombo de fibrina. La coagulasa se presenta en forma unida (adherida a la
célula) y en forma libre. El estudio de la actividad coagulasa se puede llevar a cabo en un
tubo de ensayo (para coagulasa libre) y en portaobjetos (coagulasa nido), también llamado
factor de agregación, la prueba en tubo se hace poniendo un ml de plasma al que se le
agrega una asada de un cultivo nocturno de S. aureus. Se incuba la mezcla a 37º C
durante 4 horas y se considera positivo ante cualquier grado de coagulación.

(+) PRUEBA POSITIVA

Formación de coágulo
Staphylococcus aureus

(-) PRUEBA NEGATIVA

No hay formación de coágulo
Staphylococcus epidermidis

Coágulo

POSITIVO NEGATIVO

RESULTADOS

Dibuje, esquematice o pegue fotos de todos los procedimientos realizados.

CUESTIONARIO

1. Mencione dos (2) pruebas bioquímicas que permitan diferenciar:

• Streptococcus pneumoniae:
• Streptococcus pyogenes:

2. ¿Cuáles son las pruebas de patogenicidad para identificar S. aureus?

3. ¿Por qué razón se recomienda aislar Streptococcus en agar sangre?
4. Realice un flujograma para la identificación de bacteria Gram positivas
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS O WEBGRÁFICAS
 PRÁCTICA Nª 7

IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS Y Pseudomonas aeruginosa

OBJETIVOS

▪ Conocer los procedimientos de identificación bioquímica de las principales bacterias

gram negativas.
▪ Interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas y correlacionarlas con la
diferentes especies de bacterias gram negativas.

INTRODUCCIÓN

Las bacterias Gram negativas pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los
primeros los más abundantes tanto en el hombre como en los animales. Varios de estos
microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal, algunos están asociados a
infecciones entéricas y a procesos infecciosos (especialmente cuando éstas bacterias
invaden otros órganos o sistemas).
Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal, de un portador sano o de
la diseminación endógena de la bacteria en una persona susceptible, pudiéndose ver
afectado cualquier órgano del cuerpo.

Familia de Bacilos Entéricos

Esta familia Enterobacteriaceae, incluye a varios patógenos que causan síndromes

diarreicos. Un gran número de ensayos han sido desarrollados a manera de identificar
rápidamente al patógeno, para que posteriormente el médico, con base en el reporte,
indique el tratamiento adecuado o para que los epidemiólogos puedan localizar la fuente
de infección. Dentro de los bacilos gram negativos, las Enterobacterias son responsables
del 30 a 35 % de todas las septicemias, más del 70 % de todas las infecciones del tracto
urinario y muchas infecciones intestinales.

Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiológicos de infecciones
entéricas tenemos: Salmonella, Shigella, y Escherichia coli. Estas pueden producir cuadros
diarreicos e infección sistémica, que son procesos infecciosos que se diseminan
generalmente por vía sanguínea o linfática.

Medios de aislamiento primario

Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el

desarrollo de otras. Esta capacidad puede ser moderada (agar Eosina azul de metileno
(EMB) y Mac Conkey) y alta (agar Salmonella-Shigella, Desoxicolato y Citrato) o
completamente específica (Sulfato de bismuto y Verde brillante).

Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que permite
desde el principio tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras de lactosa como
Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa: Salmonella, Shigella.

Medios diferenciales. Pruebas Bioquímicas

Son aquellos en los que se pone de manifiesto las propiedades metabólicas de los
microorganismos frente a diferentes sustratos. Existen medios que permiten observar
una, dos o más características metabólicas de la bacteria inoculada. Entre los más
utilizados están:
▪ Agar Triple Azúcar (TSI): medio sólido que contiene glucosa, sales de hierro
y un indicador de pH. Permite conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los
carbohidratos. Se detecta la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S), así como de gas. El
tubo se siembra por picadura y en estría por lo que se debe observar tanto el fondo como
la superficie del medio

▪ Agar Lisina Hierro (LIA): medio sólido que contiene lisina, sales de hierro, glucosa y un
indicador de pH. Se determina la descarboxilación y desaminación oxidativa de la lisina,
la producción de ácido sulfhídrico o sulfuro de hidrógeno (H2S) y la fermentación de
glucosa. Se siembra por picadura y estría.

▪ Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM): medio semisólido, se utiliza en la

producción de sulfuro de hidrógeno, la formación de Indol y movilidad. Se inocula con
una única punción con asa de siembra recta a través del centro, hasta una profundidad
de unos dos tercios del medio.

▪ Agar Citrato de Simmons: medio sólido que contiene citrato de sodio, compuesto que
puede ser utilizado como única fuente de carbono, por algunas bacterias. Se siembra por
picadura y estría

• Agar Úrea (Método de Christensen): medio sólido, se utiliza para determinar la

capacidad de un organismo para producir la enzima ureasa, que hidroliza la úrea. La
hidrólisis de la úrea produce amoníaco y anhídrido carbónico. La formación de amoníaco
alcaliniza el medio y el cambio de pH se detecta por el cambio de color del rojo fenol de
naranja pálido a magenta.

Existen más pruebas bioquímicas que pueden utilizarse como complemento a las ya
descritas como son: rojo de metilo, Voges Proskawer, utilización de malonato, las cuales
ayudan a determinar la especie del microorganismo aislado. En ocasiones a pesar de
recurrir a diversas pruebas metabólicas, no se consigue la identificación, siendo
necesario realizar reacciones inmunológicas para llegar al diagnóstico definitivo.

Principales Géneros Bacterianos de la Familia Enterobacterias:

MATERIALES

▪ Placas con medio Mac Conkey, Eosina azul de metileno (EMB) y Salmonella-Shigella
▪ Tubos con medio TSI, Citrato de Simmons, LIA, ÚREA, SIM, sin sembrar y
sembrados con cepa problema
▪ Asas de siembra
▪ Reactivo de Kovacs
▪ Microscopio
▪ Aceite de inmersión

METODOLOGÍA

ENTEROBACTERIAS
 En las prácticas se harán los trabajos de laboratorio que nos permitan observar las
características de cultivo y con ello su identificación
 A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa de siembra previamente
esterilizada una muestra y sembrar por estrías en los medios Mac Conquey y
Salmonella – Shigella.
 Incubar a 37ºC por 24 horas.
 Transcurrido el tiempo de incubación, observar la morfología de las colonias de las
placas sembradas (Mac Conkey y S-S).
 Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato de Simmons,
LIA y SIM. Esto se hace por puntura en los medios y luego en estrías en la parte de
inclinación (pico de flauta) como lo indicará el profesor en cada medio. Llevar a
incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
 Hacer la lectura de las pruebas bioquímicas, interpretar y realizar la identificación
del microorganismo proporcionado.

INTERPRETACIÓN BIOQUÍMICA

Agar Triple Azúcar (TSI):

 Fermentación de glucosa: en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a color
amarillo. Es una reacción débil.
 Fermentación de sacarosa: en todo el tubo el medio cambia a amarillo,
principalmente en el fondo, donde se intensifica el color debido a la reacción de la
glucosa.
 Fermentación de lactosa: en la superficie el medio vira a amarillo.
 Debido a la fermentación puede hacer producción de gas, lo que se manifiesta por
la presencia de burbujas en el medio.
 Producción de ácido sulfhídrico o sulfuro de hidrógeno (H2S): por degradación
enzimática de aminoácidos que contienen azufre originan un precipitado de color
negro. La producción de H2S tiene lugar en ambiente ácido, de ahí que el
precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan ácidos a
partir de la glucosa. Así, un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del
tubo, aunque el color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro.

Agar Lisina Hierro (LIA):

 Descarboxilación de lisina: el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramente
morado en la superficie.
 Fermentación de la glucosa: en el fondo del tubo el medio vira a amarillo.
 Desaminación de la lisina: vira a color rojizo en la superficie del medio. Es
característico de Proteus y Providencia.
 Producción de H2S: precipitado de color negro.
Agar Citrato de Simmons:
▪ Utilización de citrato como fuente de carbono: el medio vira a color azul.

Agar Úrea:
▪ Los microorganismos que hidrolizan la úrea producen un cambio de color en el pico de
flauta de naranja pálido a magenta.

Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM):

 Motilidad: Los cultivos móviles muestran un crecimiento difuso o turbidez lejos de
la línea de inoculación, por lo que observando si el crecimiento está solo en la
picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el
microorganismo es inmóvil o móvil.
 Indol: la aparición transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la
interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por lo tanto, la
prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehído
del reactivo originando un complejo de color rojo.
 Producción de H2S: precipitado de color negro.

Escherichia
coli

Klebsiella
 Salmonella

Shigella

RESULTADOS

Realizar la lectura e identificación de los microorganismos, observar y anotar los

resultados.

• Escherichia coli:

TSI LIA Citrato de SIM

Simmons
• Klebsiella sp

TSI LIA Citrato de SIM

Simmons

• Proteus sp

TSI LIA Citrato de SIM

Simmons

• Salmonella sp

TSI LIA Citrato de SIM

Simmons
• Shigella sp

TSI LIA Citrato de SIM

Simmons

BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES (BGNNF)

Los bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF) constituye un grupo heterogéneo

de microorganismos generalmente considerados patógenos oportunistas. Son bacterias
no esporuladas, aerobias estrictas, no utilizan los carbohidratos como fuente de energía o
los degradan a través de vías metabólicas diferentes a la fermentación. Se encuentran
ampliamente distribuidos en la naturaleza y pueden sobrevivir en el ambiente
hospitalario, como en el agua, soluciones salinas, superficies húmedas, humidificadores,
incubadoras, nebulizadores, catéteres, soluciones desinfectantes y superficies inertes,
como reservorios de potenciales infecciones.

Los principales géneros bacterianos de este grupo lo conforman:

 Pseudomonas
 Acinetobacter
 Stenotrophomonas

Pseudomonas

Son ubicuos, se encuentran en la tierra, materia orgánica en descomposición, en la

vegetación, en el agua. También podemos encontrar estos microorganismos en el
ambiente hospitalario, en lugares húmedos, como comida, baños, respiradores. No forman
parte de la flora normal del ser humano con excepción de los pacientes hospitalizados y
en pacientes ambulatorios inmunodeprimidos.

Debido a las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad nutricional, se logra

su amplia distribución ambiental, siendo capaces de utilizar un gran número de
compuestos orgánicos como fuentes de carbono y nitrógeno.

Son bacilos Gram negativos móviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios
estrictos, la mayoría de las cepas son móviles por medio de uno o más flagelos polares;
utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera oxidativa; y suelen ser citocromo
oxidasa positivos.

El género Pseudomonas se divide en cuatro grupos: Grupo fluorescente, Grupo Stutzeri,

Grupo Alcalígenes y Grupo con pigmento amarillo.
Grupo fluorescente: pertenecen a este grupo las especies: Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas putida, las cuales se caracterizan por la
producción de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da fluorescencia blanca a verde
azulada bajo luz ultravioleta de longitud de onda larga (400 nm). Sólo una especie,
Pseudomonas aeruginosa, produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina.

Pseudomonas aeruginosa produce un aspecto característico cuando crece en una placa de

agar sangre, se pueden observar grandes colonias grises y presenta beta hemólisis. Las
colonias tienen un aspecto de piel de caimán y con brillo metálico.

La exudación de pus azulado, con olor similar a las uvas, por la producción de piocianina
es característico en las heridas infectadas por este microorganismo. La piocianina es un
antibiótico que puede permitir que la Pseudomonas aeruginosa exista en la naturaleza,
también puede desempeñar un papel en la nutrición, al funcionar como una forma de
adquirir fosfatos inorgánicos. Se puede realizar una identificación rápida de Pseudomonas
aeruginosa si se observan las siguientes características: morfología típica de las colonias,
producción de pigmentos difusibles, olor a fruta y positividad en la prueba de oxidasa.

CARACTERÍSTICAS DEL GRUPO FLUORESCENTE:

PRUEBA Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas

aeruginosa fluorescens putida
PIOVERDINA + + +
PIOCIANINA + - -
Acinetobacter

Es un género de bacterias Gram-negativas, presentan una morfología de tipo cocobacilo,

son estrictamente aerobios no fermentadores, no móviles (no tiene flagelos; 'sin
motilidad'), oxidasa-negativos que se presentan en pares al microscopio. Se distribuyen
ampliamente en la naturaleza, son importantes en el suelo y contribuyen a su
mineralización

Acinetobacter es también una importante fuente de infección en los hospitales para los
pacientes debilitados. Son capaces de sobrevivir en diversas superficies (tanto húmedas
como secas) en el ámbito hospitalario. Ocasionalmente son aislados de los productos
alimenticios y algunas cepas son capaces de sobrevivir sobre diversos equipos médicos e
incluso sobre la piel humana sana.

Su principal representante es Acinetobacter baumannii. Muchas cepas son

multiresistentes a antibióticos

Stenotrophomonas

Es un patógeno intrahospitalario que afecta principalmente a personas

inmunodeprimidas o que padecen fibrosis quística, produciendo celulitis, abscesos
cutáneos, infección del tracto urinario, meningitis, endocarditis bacteriana, colonizando
además catéteres, produciendo bacteriemia y sepsis.

Es resistente a los antibióticos betalactámicos, por lo que para su tratamiento se usan

quinolonas como el ciprofloxacino, cefalosporinas como la ceftazidima.
MATERIALES

▪ Placas con agar Nutritivo sembrada con cepa problema.

▪ Asas de siembra

Pseudomonas
aeruginosa

piocianina

RESULTADOS

LIA Citrato de SIM

TSI
Simmons

CUESTIONARIO

1. Realizar la lectura bioquímica en el siguiente cuadro de las bacterias estudiadas:

LIA CITRATO
Enterobacterias TSI SIM
Pendiente Gas H2S LDC LDA Sulfuro Indol Movilidad
2. ¿Cuáles son las principales enterobacterias causantes de cuadros diarreico?
3. ¿Cuáles son los principales problemas de salud intrahospitalaria que causan
Pseudomonas y Acinetobacter?
3. Realizar un flujograma para la identificación de bacterias Gram negativas.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS O WEBGRÁFICAS