PENGEMBANGAN VALIDASI METODE DAN ANALISIS ISONIAZID

DENGAN INSTRUMEN RP-HPLC (Reverse Polarity High Performance

Liquid Chromatography)

Disusun oleh :

Waliyyin Razan Qanit (M0615047)

S1 FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tuberculosis masih menjadi penyakit yang menempati ranking atas dari

awal penyakitnya ditemukan hingga saat ini. Penyakit tuberculosis disebabkan
oleh Mycrobacterium tuberculosis dan termasuk penyakit yang menular. Setelah
beberapa dekade berlalu sejak penemuan penyakit ini diperoleh obat
antituberculosis yang kuat namun penyakit tuberculosis tetap menjadi penyakit
menular yang menyebabkan kematian tingkat atas. Penyakit ini berkembang pesat
pada pasien-pasien terutama pengidap HIV, manula (manusia lanjut usia), serta
anak-anak. Pengobatan untuk penyakit tuberculosis biasanya dengan cara
pemberian kombinasi obat anti-tuberculosis dengan jangka waktu yang cukup
lama dan penggunaan yang teratur hingga penyakit tuberculosis tersebut
dinyatakan sembuh (Glass et al., 2007).
Menurut (WHO, 1994), untuk mengendalikan penyebaran penyakit ini
adalah dengan pemberian Fix Dose Combination obat anti-tuberculosis yang
artinya pemberian 2 atau lebih obat dalam satu dosis tunggal. Fix Dose
Combination obat yang baik akan memberikan bioavailibilitas, dan efek
teurapetik yang baik juga. Untuk mendukung perolehan Fix Dose Combination
yang baik maka diperlukan metode analisis yang baik untuk obat anti-tuberculosis
yang beredar di pasaran, salah satunya isoniazid.
Isoniazid (piridin-4-carbohidrazid) merupakan salah satu obat anti-
tuberculosis yang digunakan sebagai obat lini pertama hingga saat ini, namun
digunakan secara kombinasi dengan obat anti-tuberculosis lain seperti rifampicin,
ethambutol, atau pirazinamid. Mekanisme kerja utama dari isoniazid adalah
menghambat biosintesis asam mikolat mikroorganisme yang berguna sebagai
unsur penting dalam pembentukan dinding sel pada mikroorganisme. Isoniazid
akan bersifat bakteriostatik untuk bakteri yang tidak aktif (resting bacilli), dan
akan bersifat bakterisidal untuk mikroorganisme yang membelah secara cepat.
Isoniazid merupakan prodrug yang akan menjadi metabolit aktif setelah
dikonversi oleh microbacterial catalase-peroxidase.

Gambar 1. Struktur Isoniazid

HPLC (High Performace Liquid Chromatography) merupakan instrumen

yang paling sering digunakan untuk metode analisis obat tunggal maupun
kombinasi beberapa obat. Banyak sekali faktor yang mempengaruhi hasil analisis
dengan instrument HPLC diantaranya penggunaan pelarut, teknik elusi, kolom
yang digunakan, pH saat elusi berlangsung, dan lain-lain. Oleh karena banyaknya
faktor yang mempengaruhi maka perlu dilakukan pengembangan terhadap
optimalisasi metode analisis isoniazid menggunakan HPLC sehingga diharapkan
setiap kali analisis tehadap isoniazid dilakukan hasilnya akurat dan presisi.
Validasi metode analisa menurut SNI 19-17025-2000 adalah konfirmasi
pegujian serta pengadaan bukti yang objektif bahwa suatu persyaratan untuk suatu
maksud khusus terpenuhi. Validasi metode analisa memiliki tujuan untuk
membuktikan bahwa setiap metode analisa yang digunakan dalam pengujian akan
selalu mencapai hasil yang terbaik secara konsisten.
Validasi lumrahnya dipergunakan untuk metode analisa yang baru dibuat
dan akan dikembangkan, sedangkan untuk metode yang memang telah ada dan
baku namun metodenya baru pertama kali dipergunakan di laboratorium, biasanya
tidak perlu divalidasi, hanya perlu diverifikasi. Prosedur verifikasi hampir sama
dengan validasi hanya saja parameter pada verifikasi tidak lengkap seperti pada
validasi (Riyadi, 2009).
Beberapa parameter yang diperhatikan dalam validasi metode analisis
menurut USP, diantaranya :
1. Akurasi
 Parameter yang mempresentasikan derajat kedekatan hasil analisis
dengan kadar analit sebenarnya. Biasanya dinyatakan dengan persentase
recovery.
2. Presisi (keterulangan)

Parameter yang merupakan ukuran keterulangan metode analisis yang

digunakan dan biasa digambarkan sebagai simpangan baku relative.

3. Spesifisitas (keselektifan)

Parameter ini digunakan untuk melihat adanya interferensi terhadap

respon dari analit.

4. Linieritas

Parameter yang menunjukkan kemampuan metode analisis yang

diteliti untuk mempresentasikan hubungan secara proporsional respons
detector dengan perubahan konsentrasi analit.

5. Limit of Detection (batas deteksi)

Batas deteksi mempresentasikan konsentrasi terkecil dari analit yang

masih dapat dianalisa oleh metode yang digunakan.

6. Limit of Quantitation (batas quantitas)

Parameter yang menunjukkan konsentrasi terkecil dari suatu analit

yang dapat terkuantifikasi

7. Ruggedness dan Robustness (kekuatan dan ketahanan)

Kekuatan dan ketahanan dari metode analisa ditunjukkan oleh kedua

parameter ini. Pada parameter Ruggedness dapat digunakan variasi
analis/instrumen, atau waktu analisa. Sedangkan pada parameter Robustness
dapat dilakukan modifikasi pada sampel produksi agar diperoleh gambaran
mengenai analisa terhadap obat jadi
 BAB II
Metode Penelitian

2.1 Preparasi
2.1.1 Preparasi Fase Gerak

3.12 gram sodium dihidrogen ortoposfat ditimbang dan dilarutkan dalam

700 ml air, dan ditambahkan 1 ml Trietil Amine ke dalam larutan dan larutan
diencerkan sampai 1000ml. Larutan disaring dengan membrane filter ukuran
0.45µ. Diperoleh 0.02 M sodium dihidrogen ortoposfat (pH 6.5) plus 1 ml TEA.
Larutan sodium dihidrogen ortoposfat buffer pH 6.5 hasil penyaringan
dicampurkan dengan acetonitrile dengan perbandingan 45 : 55 dan disonifikasi
agar homogen

2.1.2 Preparasi Larutan Standar

100 mg working standar isoniazid ditimbang dan dimasukan ke dalam

labu ukur 100 ml dan ditambahkan 70 ml fase gerak sodium dihidrogen ortoposfat
buffer pH 6.5 dan acetonitrile (45 : 55). Larutan standar dibuat konsentrasinya
menjadi 24µg/ml.

2.1.3 Preparasi Larutan Sampel

10 tablet sampel isoniazid ditimbang dan digerus halus menjadi serbuk,

lalu diambil 300 mg serbuk isoniazid dan dimasukan ke dalam labul ukur 1000ml.
Lalu dimasukkan fase gerak sodium dihidrogen ortoposfat pH 6.5 dan acetonitrile
(45 : 55) sebanyak 700 ml ke dalam labu ukur dan larutan disonifikasi selama 30
menit. Larutan sampel disaring dengan 0.45µg PDVF filter dan konsentrasi
larutan sampel dibuat menjadi 24µg/ml.

2.1.4 Kondisi Analisis

Digunakan HPLC dengan kolom reverse phase protonsil C18 (250 x

4.6mm, ukuran partakel 5μm), fase gerak acetonitril : sodium dihidrogen
ortoposfat buffer pH 6.5 (55 : 45). Kecepatan alir fase gerak 1 mL/menit, serta
sampel yang diinjeksikan sebanyak 20μL dengan waktu analisis selama 8 menit.

2.2 Validasi Metode Analisis

2.2.1 Selektivitas dan spesifisitas

Untuk mengetahui selektivitas dan spesifisitas dari metode yang digunakan

yaitu dengan cara mencari puncak paling tajam pada spektra serta dilihat waktu
retensinya dan dibandingkan dengan puncak dan waktu retensi dari larutan
standar. Jika waktu retensi standar sama dengan waktu retensi sampelnya maka
metode dapat dikatakan spesifik, dalam hal ini parameter resolusi dan factor
asimetrik juga dihitung (Valson & Snehalata, 2017).

2.2.2 Presisi (keterulangan)

Uji presisi dilakukan dengan cara melakukan uji dengan metode yang
digunakan secara intraday dan interday. Studi presisi secara intraday dilakukan
dengan melihat hasil uji sampel dengan 3 konsetrasi bertingkat menggunakan
metode yang sama sebanyak 3 kali pengujian pada hari yang sama, sedangkan
untuk studi presisi secara interday dilakukan dengan melihat hasil uji sampel
dengan 3 konsentrasi bertingkat menggunakan metode yang sama sebanyak 3 kali
pada hari yang berbeda. Dari hasil uji baik secara intraday maupun interday
dihitung nilai %RSD (Relative Standard Deviation) yang mana %RSD yang dapat
diterima yakni tidak lebih dari 2 % (Valson & Snehalata, 2017).

2.2.3 Akurasi

Metode penilaian akurasi adalah dengan penambahan sejumlah standar

pada sampel yang akan dianalisis. Lalu dihitung nilai recovery dengan rumus :

( )
%

2.2.4 Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitaion (LOQ)

LOD dan LOQ dijelaskan melalui kurva standar kalibrasi. Cara

pengujian baik LOD maupun LOQ adalah dengan cara menginjeksikan larutan
standar dengan konsentrasi rendah pada instrument RP-HPLC. Batas deteksi
minimal (LOD) dihitung sebagai 3.3 Ə/S dan batas minimal terquantifikasi (LOQ)
dihitung sebagai 10 Ə/S, menurut garis penuntun ICH Ə adalah standar deviasi dari
respon (y- intersep) dan S adalah gradient kurva kalibrasi (Valson & Snehalata,
2017).

2.2.5 Robustness

Pengujian Robustness (ketahanan) dilakukan dengan memberikan sedikit

modifikasi pada metode yang digunakan seperti penggantian rasio fase gerak ±2%,
dan penggantian panjang gelombang yang digunakan ± 2nm, serta penggantian
kecepatan alir fase gerak ± 0,1 ml.
 BAB III
ISI DAN PEMBAHASAN

Pada metode analisis ini digunakan HPLC reverse phase atau HPLC fase
terbalik karena RP-HPLC merupakan instrument yang paling umum digunakan
selain itu RP-HPLC bisa digunakan untuk menganalisa baik senyawa non-polar
dan senyawa polar. Keuntungan RP-HPLC adalah saat menganalisa senyawa
polar pemisahannya akan lebih baik, senyawa yang mudah terionkan (ionic) yang
tidak dapat terpisahkan pada HPLC fase normal akan dapat terpisahkan pada
kromatografi fase terbalik dengan penggunaa air sebagai salah satu komponen
fase gerak (Mulja, 1995).
Metode analisis ini menggunakan fase gerak yang sama dengan
penelitian yang dilakukan oleh Valson & Snehalata (2017) yakni acetonitril :
sodium dihidrogen ortoposfat buffer pH 6.5 (55 : 45), dengan sedikit modifikasi
pada rasio fase geraknya dan penambahan jumlah TEA pada fase gerak hanya 1
ml. Dengan penambahan rasio perbandingan larutan buffer dihidrogen ortoposfat
pH 6.5 diharapkan kepolaran fase gerak meningkat serta kelarutan isoniazid pada
fase gerak semakin tinggi karena isoniazid mudah larut pada pelarut suasana
asam, sehingga diharapkan hasil analisisnya berupa waktu retensi menjadi lebih
cepat serta pemisahan terjadi secara sempurna, karena menurut Puspaningtyas et
al., (2016), semakin polar fase gerak maka senyawa yang non polar akan semakin
terikat kuat pada fase stasioner sedangkan senyawa polar aku keluar menuju
detector lebih dulu sehingga waktu retensi analit menjadi lebih kecil.
Penambahan TEA memiliki fungsi untuk mencegah terjadinya tailing
untuk senyawa basa dengan cara berikatan dengan residu silanol sehingga
senyawa yang basa bisa melewati kolom tanpa terjadi ikatan yang terlalu kuat
(memperkecil tailing). Trietilamin cocok digunakan untuk analisis isoniazid
karena isoniazid memiliki sifat basa. Pada optimasi metode analisis yang
dilakukan oleh Valson & Snehalata (2017) TEA yang ditambahkan pada fase
gerak sebanyak 1,5 ml. Namun pada metode analisis ini digunakan hanya 1 ml
saja karena 1 ml sudah cukup memberikan hasil yang baik, selain itu terlalu
banyaknya penggunaan TEA pada fase gerak bisa merusak kolom sehingga
volume penggunaannya dibatasi. Kecepatan alir pada metode analisis ini
disamakan dengan penelitian yang dilakukan oleh Valson & Snehalata (2017)
karena dianggap sudah optimal untuk analisa isoniazid dengan instrument HPLC.
 BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN

4.1 Kesimpulan
Pada metode analisis ini digunakan fase gerak sodium dihidrogen
ortoposfat buffer pH 6.5 dan acetonitrile (45 : 55) dan penambahan TEA 1ml
dengan tujuan agar waktu retensinya kecil, serta tidak terjadi tailing sehingga hasil
analisis bisa tergolong bagus. Peningkatan kepolaran pelarut dengan menambah
rasio larutan buffer sodium dihidrogen ortposfat pH 6.5 sehingga kelarutan
isoniazid pada fase gerak meningkat. TEA digunakan untuk senyawa basa
sehingga cocok digunakan untuk analisis isoniazid

4.2 Saran
Metode analisis yang tertulis pada makalah ini masih merupakan
rancangan dan belum diuji secara langsung, sehingga diperlukan pengembangan
dan revisi lebih lanjut agar diperoleh validasi metode analisis isoniazid terbaik
pada instrumen RP-HPLC
Daftar Pustaka

Glass, B.D., Agatonovic-Kustrin, S., Chen, Y.-J., Wisch, M.H. Optimization of a

Stability-Indicating HPLC Method for the Simultaneous Determination of
Rifampicin, Isoniazid, and Pyrazinamide in a Fixed-Dose Combination using
Artificial Neural Networks. Journal of Chromatographic Science, 45(1) : 38-
44

Mulja, M. dan Suharman, 1995, “Analisis Instrumental”, ed.1. Surabaya :

Airlangga University Press.

Puspitaningtyas, A., Surjani, W., & Neena, Z. 2016. Pengaruh Komposisi Fasa
Gerak Pada Penetapan Kadar Asam Benzoat Dan Kafein Dalam Kopi
Kemasan Menggunakan Metode KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
Jurnal Universitas Negeri Malang
Riyadi, W. 2009. Validasi Metode Analisis. Chem-Is-Try

The United State Pharmacopeial Convention. (2006). The United States

Pharmacopeia (USP). 30th Edition. United States.

Valson, J.A., & Snehalatha, B. Method Development and Validation of RP-HPLC

Method for Simultaneous Estimation of Isoniazid, Ethambutol Hydrochloride
and Rifampicin in Bulk and Combined Tablets Dosage Forms. World Journal
of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 6(5)
 WORLD JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACEUTICAL SCIENCES
Valson et al. SJIF
World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Impact Factor 6.647
Sciences
Volume 6, Issue 5, 1464-1472 Research Article
ISSN 2278 – 4357

METHOD DEVELOPMENT AND VALIDATION OF RP-HPLC METHOD FOR

SIMULTANEOUS ESTIMATION OF ISONIAZID, ETHAMBUTOL
HYDROCHLORIDE AND RIFAMPICIN IN BULK AND COMBINED TABLETS
DOSAGE FORMS
Jincy Anna Valson* and Dr. Snehalatha Boddu

Department of Quality Assurance, Oriental College of Pharmacy, Sanpada, Navi-Mumbai.

Article Received on ABSTRACT

17 March. 2017, A simple, accurate, precise, rapid, selective and reproducible reverse
Revised on 07 April 2017, phase high performance liquid chromatographic (RP-HPLC) method

Accepted on 28 April 2017

for simultaneous estimation of Isoniazid, Ethambutol Hydrochloride
and Rifampicin in tablet formulation. Good chromatographic
separation was achieved isocratically using a Prontosil C18 column
*Corresponding Author
(250 x 4.6mm, 5μm) and mobile phase consisting of acetonitrile:
Jincy Anna Valson
0.02M sodium dihydrogen phosphate buffer (60:40) with 1.5ml of
Department of Quality
Triethyl Amine , adjusted to pH 6.5 with Orthophosphoric acid, at flow
Assurance, Oriental
college of Pharmacy, rate 1ml/min. The first method of these three drugs which involves
Sanpada, Navi-mumbai. absorbance measurement at 208nm The retention time of Isoniazid,
Ethambutol Hydrochloride and Rifampicin and was found to be 2.463min, 2.767min and
3.650min respectively. Linearity was obtained in the range of 8-48 μg/ml,18-63 μg/ml and
32-112 μg/ml respectively. The correlation coefficient for calibration curve of all three peaks
was found to be 0.9999. The recoveries of Isoniazid, Ethambutol Hydrochloride and
Rifampicin in pharmaceutical preparation were all greater than 98% and their relative
standard deviations were not more than 2.0%. The developed methods were validated
according to ICH guidelines.

KEYWORDS: Isoniazid, Rifampicin, Ethambutol Hydrochloride, RP-HPLC, Validation

INTRODUCTION
Tuberculosis (TB) is a disease that may have first been identified over 15,000 years ago.
Even a century after the discovery of its cause, Mycobacterium tuberculosis, and decades

www.wjpps.com Vol 6, Issue 5, 2017. 1464

www.wjpps.com Vol 6, Issue 5, 2017. 1465