GUIA DE LABORATÓRIO – QUÍMICA ORGÂNICA EXPERIMENTAL I – PROFA.

EUGÊNIA CRISTINA SOUZA BRENELLI

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Capítulo

2
CROMATOGRAFIA
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2.1. INTRODUÇÃO
A cromatografia pode ser definida como a separação de uma mistura
de dois ou mais compostos diferentes por distribuição entre fases, uma das
quais é estacionária e a outra móvel. Dependendo da natureza das duas
fases envolvidas há diversos tipos de cromatografia:
v sólido-líquido (coluna, camada fina, papel)
v líquido-líquido (HPLC – cromatografia líquida de alta eficiência)
v gás-líquido (cromatografia gasosa)
Assim, a cromatografia é uma técnica utilizada para analisar, identificar
ou separar os componentes de uma mistura.
A mistura é adsorvida em uma fase fixa, e uma fase móvel passa
continuamente através da mistura adsorvida. Pela escolha apropriada da fase
fixa e da fase móvel, além de outras variáveis, pode-se fazer com que os
componentes da mistura sejam arrastados ordenadamente. Os componentes
que interagem pouco com a fase fixa são arrastados facilmente pela fase
móvel; aqueles com maior interação ficam mais retidos.
As partículas de sólido adsorvem os componentes da mistura devido à
ação de diversas forças intermoleculares. Estas forças podem variar conforme
o seu tipo. Uma ordem aproximada para a força destas interações é a
seguinte: formação de sais > coordenação > pontes de hidrogênio > dipolo-
dipolo > Van der Waals.

2.2. CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA

A cromatografia em camada fina (ou delgada) é uma técnica simples e
muito importante para a separação rápida e qualitativa de pequenas
quantidades de material. Ela também pode ser utilizada de modo
quantitativo e neste caso é chamada de cromatografia em camada fina
preparativa. Ela é usada para determinar a pureza de um composto,
identificar componentes em uma mistura comparando-os com padrões;
acompanhar o progresso de uma reação pelo aparecimento dos produtos e
desaparecimento dos reagentes, isolar componentes puros de uma mistura e
para monitorar uma cromatografia em coluna.
Na cromatografia de camada fina a fase líquida ascende por uma
camada fina do adsorvente estendida sobre um suporte. Freqüentemente, o
suporte utilizado é uma placa de vidro.
Sobre a placa espalha-se uma camada fina de adsorvente suspenso em
água (ou outro solvente) e deixa-se secar. A placa coberta e seca chama-se
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"placa de cromatografia em camada fina" (placa de CCF). Quando a placa de

CCF é colocada verticalmente em um recipiente fechado (cuba cromatográfica
ou câmara de eluição) que contém uma pequena quantidade de eluente, este
eluirá pela camada do adsorvente por ação capilar.
A amostra é colocada na parte inferior da placa, através de aplicações
sucessivas de uma solução da amostra em um solvente volátil com um
pequeno capilar. Deve-se formar uma pequena mancha circular. Em seguida
a placa é colocada na câmara de eluição. À medida que o solvente sobe pela
placa, a amostra é compartilhada entre a fase líquida móvel e a fase sólida
estacionária. Durante este processo, os diversos componentes da mistura
são separados. As substâncias menos polares avançam mais rapidamente
que as substâncias mais polares. Esta diferença na velocidade resultará em
uma separação dos componentes da amostra. Quando estiverem presentes
várias substâncias, cada uma se comportará segundo suas propriedades de
solubilidade e adsorção, dependendo dos grupos funcionais presentes na sua
estrutura (Figura 2.1).

Figura 2.1. Cromatografia em camada fina.

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Depois que o solvente ascendeu pela placa, esta é retirada da cuba e

seca até que esteja livre do eluente. Cada mancha corresponde a um
componente separado na mistura original. Se os componentes são
substâncias coloridas, as diversas manchas serão claramente visíveis (Figura
2.2). Contudo, é bastante comum que as manchas sejam invisíveis porque
correspondem a compostos incolores. Para a visualização deve-se "revelar” a
placa.

Figura 2.2. Placa cromatográfica após o desenvolvimento.

Os métodos mais comuns para a visualização de uma placa são:

v vapores de iodo
v lâmpada de ultravioleta (UV)-visível.
No primeiro método, os vapores de iodo reagem com muitos
compostos orgânicos formando complexos de cor marrom ou amarela. No
segundo método, sob a luz UV os compostos geralmente aparecem como
manchas brilhantes na placa.
Um outro método consiste na adição de um indicador de fluorescência
ao adsorvente usado para cobrir as placas. Geralmente este indicador é uma
mistura de sulfetos de cádmio e zinco. A placa tratada deste modo e mantida
sob a luz UV fluoresce. Contudo, onde os compostos foram separados
aparecem manchas escuras eliminando a fluorescência.
Adicionalmente aos métodos citados acima, vários métodos químicos
podem ser utilizados para a visualização da placa. Entretanto eles destroem
ou alteram permanentemente os compostos separados através de reações
químicas e geralmente são específicos para certos grupos funcionais. Como
exemplos podemos citar: o nitrato de prata (para derivados halogenados),
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2,4-dinitrofenilidrazina (para cetonas e aldeídos), verde de bromocresol

(para ácidos), ninhidrina (para aminoácidos), etc.
Um parâmetro muito usado na cromatografia em camada fina é o "fator
de retenção" de um composto - Rf. Na cromatografia em camada fina, o Rf é
função do tipo de suporte empregado, do eluente, da espessura da camada
do suporte e da quantidade relativa do material aplicado na placa
cromatográfica. Ele é definido como a razão entre a distância percorrida pela
mancha do componente e a distância percorrida pelo eluente (Figura 2.3).
Portanto:
Rf = dc / de
Onde:
d c = distância percorrida pelo componente da mistura.
d e = distância percorrida pelo eluente.

Quando as condições de medida forem completamente especificadas, o

valor de Rf é constante para qualquer composto dado e correspondente a
uma propriedade física. Este valor deve apenas ser tomado como guia, já que
existem vários compostos com o mesmo Rf.

Figura 2.3. Cálculo do Rf.

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2.3. EXPERIMENTO: ANÁLISE DE ANALGÉSICOS ATRAVÉS DE

CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA
Utilizaremos neste experimento a cromatografia em camada fina (CCF),
para examinar a composição de vários medicamentos que não necessitam de
prescrição médica e apresentam um efeito analgésico, isto é aliviam a dor e
também são antipiréticos, isto é reduzem a febre.
O analgésico mais conhecido é a aspirina (ácido acetilsalicílico), mas
outros compostos quimicamente semelhantes como o paracetamol (p-
hidróxiacetanilida) e o ibuprofeno também são usados como analgésicos.
Algumas substâncias não são mais utilizadas nas formulações comerciais
como por exemplo a fenacetina e a salicilamida, (Figura 2.4).
Muitos analgésicos compartilham um efeito colateral comum, a
sonolência, de modo que em algumas formulações utiliza-se a cafeína para
minimizar este efeito já que ela apresenta um efeito estimulante.
Adicionalmente aos ingredientes ativos, os comprimidos destes
medicamentos podem conter amido e lactose que dão consistência ao
comprimido e substâncias inorgânicas tamponantes e revestimentos.

O
O H3C
O OH
NH CH3 O
CH3
OH H3 C N
N
O O N N
H3 C
O CH3 OH CH3
CH3
Ácido Acetil Salicílico Paracetamol Ibuprofeno Cafeína

NH CH3 O

NH2

OH
OCH2CH3
Fenacetina Salicilamida
Figura 2.4. Substâncias com atividade analgésica e/ou antipirética.
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Tabela 1. Algumas formulações comerciais de analgésicos disponíveis

no mercado nacional em março de 2001.

Marca Fabricante Componentes

Aspirina Bayer Ácido acetil salicílico
Cafiaspirina Bayer Acído acetil salicílico e Cafeína
Melhoral Acído acetil salicílico e Cafeína
AAS Sanofi Ácido acetil salicílico
Cibalena Ácido acetil salicílico, Cafeína e
Paracetamol
Coristina d Ácido acetil salicílico, Cafeína e outros
Paracetamol Teuto Paracetamol
Dórico Sanofi Paracetamol
Tylenol Paracetamol
Febralgin Boehringer Paracetamol
Ingelheim
Excedrin Brystol Meyers Paracetamol e Cafeína
Squibb
Advil Wyeth-Whitehall Ibuprofeno
Motrin Ibuprofeno
Algifen Sintofarma Ibuprofeno e Paracetamol
Renplex Farmasa Ibuprofeno e Paracetamol
Algi Danilon Allergan Ibuprofeno e Paracetamol
Benegrip Newlab Salicilamida e Maleato de Clorfeniramina
Coristina R Schering Salicilamida e Maleato de Clorfeniramina

2.3.1. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

2.3.1.1. Preparação das Placas Cromatográficas

Prepare duas placas para cromatografia em camada fina a partir de
lâminas de vidro para microscópio. Limpe a superfície das placas com um
algodão embebido em hexano. Não coloque os dedos na superfície da placa,
pois a gordura da pele não permitirá a adesão do suporte (sílica por
exemplo), à placa. Em um béquer de 100 mL, prepare uma suspensão
espessa de sílica gel adequada para cromatografia em camada fina,
utilizando para cada 1 g de sílica uma solução de cerca de 3 mL de
diclorometano com 10 % de metanol. Adicione com agitação usando um
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bastão de vidro, a sílica gel à solução de diclorometano. Isto evita a

formação de grumos. Quando a pasta resultante estiver homogênea
mergulhe rapidamente na mistura as duas placas juntas, face a face, por um
a dois segundos, retire-as e deixe-as secar ao ar.

2.3.1.2. Preparação dos Padrões

Preparar um pouco antes do início da aula as soluções das
substâncias a serem usadas como padrões, dissolvendo 1 g de cada
substância em 20 mL de uma mistura 1:1 de diclorometano:etanol. Usar 0,5
g de amostra no caso do ácido acetil salicílico.

2.3.1.3. Aplicação e Desenvolvimento das Placas Cromatográficas de

Referência
Com a ajuda de um capilar, aplique uma solução da amostra a 1 cm da
base da placa de modo a obter uma mancha. Em seguida a placa deve
colocada em uma câmara de eluição preparada previamente com o eluente
adequado. Para o experimento em questão, um bom eluente para o
desenvolvimento das placas cromatográficas é uma mistura de 2 % de ácido
acético glacial em acetato de etila. E n t r e t a n t o , p a r a o c o m p r i m i d o C i b a l e n a
onde temos três componentes, este eluente não fornece uma boa separação.
Uma alternativa é diminuir a polaridade para 0,5 -1,0% de ácido ácético e
eluir a mesma placa duas vezes ou então procurar um eluente m ais
a p r o p r i a d o . O nível de eluente deve estar abaixo do nível da mancha na
placa. Aplique em cada placa cromatográfica uma solução padrão de cada
um dos componentes e uma solução padrão contendo a mistura de todos os
componentes. É interessante usar a seguinte seqüência (ibuprofeno, ácido
acetil salicílico, fenacetina, paracetamol, cafeína), uma vez que as placas
confeccionadas não têm uma camada de sílica uniforme evitando a obtenção
de resultados conflitantes. Após o desenvolvimento da placa, visualizá-la na
lâmpada UV/visível e circular cuidadosamente as manchas observadas. Em
seguida fazer a revelação na câmara de iodo e calcular os Rfs.

2.3.1.4. Preparação das Amostras

Triture um comprimido e transfira o sólido para um tubo de
ensaio ou frasco Erlenmeyer pequeno. Adicione ao sólido 5 mL de uma
mistura 1:1 de etanol e diclorometano e aqueça cuidadosamente em banho-
maria por alguns minutos. Nem todo o comprimido irá se dissolver. Não se
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preocupe com isto. Depois de aquecer a amostra deixe-a em repouso para o

sólido sedimentar e mergulhe o capilar no líquido sobrenadante e aplique na
placa cromatográfica. Se você souber a identidade do comprimido e as
substâncias nele presentes, aplique na mesma placa, ao lado da amostra do
comprimido utilizando outros capilares as amostras das soluções padrões do
ítem acima correspondentes àquelas substâncias presentes no comprimido.
Caso você não saiba a identidade do comprimido, faça quantas placas forem
necessárias de modo a aplicar numa mesma placa lado a lado, a sua amostra
e as soluções padrões existentes no laboratório. Após o desenvolvimento da
placa cromatográfica, marcar a distância percorrida pelo eluente e revelar a
placa na lâmpada UV/visível. Circular as manchas com cuidado e em seguida
fazer a revelação na câmara de iodo. Calcular os Rfs. A partir do número,
posição e aparência das manchas da sua amostra juntamente com as das
substãncias padrão, identifique os componentes do comprimido que você
utilizou. Desenhe no seu caderno de laboratório os cromatogramas obtidos
identificando as manchas. Apresente no ítem resultados do seu relatório um
desenho de todas as placas obtidas, juntamente com os valores tabelados
dos Rfs calculados. Analise as fórmulas estruturais das substâncias padrão e
forneça uma ordem crescente de polaridade. Discuta se os resultados
obtidos (Rfs) estão de acordo com o que se deveria esperar conforme a
polaridade das substâncias.

2.4. CROMATOGRAFIA EM COLUNA

Na cromatografia em coluna, o sólido utilizado na fase fixa deve ser
um material insolúvel na fase móvel associada (eluente); sendo que os mais
empregados são a sílica gel (SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de
pó finamente dividido. A mistura a ser separada é colocada na coluna com
um eluente pouco polar e aumenta-se gradativamente a polaridade do
eluente e conseqüentemente o seu poder de arraste de substâncias mais
polares. Uma seqüência de eluentes normalmente utilizada é a seguinte: éter
de petróleo, hexano, tetracloreto de carbono, cloreto de metileno, éter
e t í l i c o , a c e t a to d e e t i l a , e t a n o l , m e t a n o l , á g u a e á c i d o a c é t i c o .
O fluxo de eluente deve ser contínuo. Os diferentes componentes da
mistura mover-se-ão com velocidade distintas dependendo de sua afinidade
relativa pelo adsorvente (grupos polares interagem melhor com o adsorvente)
e também pelo eluente. Assim, a capacidade de um determinado eluente em
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arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase diretamente da

polaridade do solvente com relação ao composto.
À medida que os compostos da mistura são separados, bandas ou
zonas móveis começam a ser formadas; cada banda contendo somente um
composto. De um modo geral, os compostos apolares atravessam a coluna
com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os
primeiros têm menor afinidade com a fase estacionária. Se o adsorvente
escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura, ela não
se moverá. Por outro lado, se for escolhido um solvente muito polar, todos
os solutos podem ser eluídos sem serem separados. Com uma escolha
cuidadosa das condições (adsorvente, eluente, tamanho da coluna,
velocidade de eluição), praticamente qualquer mistura pode ser separada. A
Figura 2.5 mostra a separação de uma mistura de dois componentes onde
um deles é um composto apolar e o outro é um composto polar.

Figura 2.5. Cromatografia em coluna.

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2.5. EXPERIMENTO: ISOLAMENTO DE PIGMENTOS CAROTENÓIDES E

CLOROFILA DO ESPINAFRE
Utilizaremos neste experimento a cromatografia em coluna para
separar os pigmentos carotenóides e clorofilas de um extrato de espinafre
utilizando a sílica gel como adsorvente. Utilizaremos também a
cromatografia em camada fina para analisar o extrato de espinafre e as
frações eluídas da coluna.
Em plantas, a fotossíntese ocorre em organelas chamadas de
cloroplastos. Os cloroplastos contêm um certo número de compostos
coloridos (pigmentos), que podem ser classificados em duas categorias:
clorofilas e carotenóides (Figura 2.6).

O
H3C OCH3
N N
Mg O
N N
OFitil

O
Clorofila a
CH3 CH3 CH3
Fitil = CH2CH=CCH2(CH2CH2CHCH2)2CH2CH2CHCH3

2´
1´
3´
7 11 13 15 14´ 12´ 10´ 8´
5 8 9 4´
6 13´ 9´
4 6´
10 12 14 11´ 7´ 5´
15´
3
1
2
β-caroteno
Figura 2.6. Representação estrutural da clorofila a e do β-caroteno.

As clorofilas são os pigmentos verdes que atuam como as principais

moléculas fotoreceptoras das plantas. Elas são capazes de absorver certos
tipos de comprimentos de onda da luz visível que então são convertidos em
energia pelas plantas. Duas formas diferentes destes pigmentos são a
clorofila a e a clorofila b . Na clorofila b o grupo metila (-CH3), realçado pelo
quadro na fórmula estrutural da clorofila a (Figura 2.6), foi substituído por
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um grupo aldeído (–CHO). As feofitinas a e b são idênticas às clorofilas a e b

porém em cada caso o íon Mg+2 foi substituído por dois íons H+.
Os carotenóides são pigmentos amarelos que também estão
envolvidos no processo fotossintético; a estrutura do β−caroteno está
representada na figura 2.6. O α-caroteno difere do isômero β na posição da
dupla ligação no anel cicloexano (C4-C5 ao invés de C5-C6). Adicionalmente,
os cloroplastos também contêm vários derivados de carotenos contendo
oxigênio chamados de xantofilas.

2.5.1. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

2.5.1.1. Extração dos pigmentos

Para minimizar a exposição dos pigmentos extraídos ao ar e à luz é
melhor utilizar imediatamente o extrato obtido. Entretanto, caso isto não
seja possível ele pode ser armazenado no frezer e ser utilizado no momento
oportuno sem prejuízo para o experimento.
Separe as folhas de um maço de espinafre e utilizando uma centrífuga
faça a extração do suco. Durante o processo de extração não é necessária a
adição de água ou qualquer solvente orgânico.
Em um funil de Büchner adaptado a um frasco de filtração e uma linha
de vácuo monte um conjunto filtrante utilizando papel de filtro e uma
suspensão de 15 g de Celite em 50 mL de metanol. Com o vácuo ligado
coloque cuidadosamente, sem perturbar a camada filtrante, 40 mL do suco
extraído no parágrafo acima (com este volume obtém-se uma quantidade de
amostra suficiente para um grupo de 10 alunos). Em seguida lave a camada
filtrante com 10 mL de metanol seguidos de 70 mL de hexano. Aos filtrados
combinados adicione 10 mL de água e transfira esta mistura para uma
centrífuga por cerca de 2 a 3 minutos. Observe a separação de uma camada
superior de coloração verde transparente; transfira essa camada para um
tubo de ensaio limpo com o auxílio de uma pipeta Pasteur.

2 . 5 . 1 . 2 . C romatografia em camada fina dos pigmentos do espinafre

Prepare as placas cromatográficas do mesmo modo que no ítem
2.3.1.1. Com a ajuda de um capilar, aplique a solução do extrato de
espinafre a 1 cm da base da placa de modo a obter uma mancha.
Em seguida a placa deve colocada em uma câmara de eluição
preparada previamente com o eluente hexano/acetona (7:3). O nível de
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eluente deve estar abaixo do nível da mancha na placa. Após a eluição e

evaporação do solvente observa-se duas manchas principais uma amarela
no alto da placa correspondente aos carotenóides (α e β-caroteno) e uma
mancha verde no centro da placa correspondente às clorofilas (a e b ). Caso o
solvente hexano não esteja disponível no momento ele pode ser substituído
pelo solvente cicloexano sem prejuízo para o experimento. O aluno deve
calcular os Rfs obtidos para as manchas observadas e comentá-las no seu
relatório.
A mesma amostra deve ser utilizada no experimento cromatografia em
coluna descrito a seguir.

2.5.1.3. Empacotamento da coluna e separação dos componentes de uma

mistura
Pese em um Erlenmeyer de 50 mL, cerca de 6 g de sílica gel apropriada
para cromatografia em coluna. Misture a sílica com hexano suficiente para
obter uma suspensão homogênea e sem bolhas de ar incluídas. Encha a
coluna cromatográfica até a metade com hexano e derrame, então, a
suspensão de sílica, de modo que ela sedimente aos poucos e
homogeneamente. Caso haja bolhas de ar oclusas na coluna, golpeie-a
suavemente com as mãos de modo até expulsá-las. Controle o nível do
solvente abrindo ocasionalmente a torneira da coluna (caso a sua coluna não
possua uma torneira, adaptar ao terminal da coluna, uma mangueira de
silicone fechada no centro através de uma pinça de Mohr). Terminada a
preparação, o nível de hexano deve estar 0,5 a 1 cm acima do topo da coluna
de sílica.
Distribua homogeneamente sobre o topo da coluna de sílica, com
auxílio de uma pipeta Pasteur ou conta-gotas, 1 mL do extrato de espinafre
obtido anteriormente, (o mesmo que foi utilizado na cromatografia em
camada fina). Após a adsorção do extrato pela coluna, proceda a eluição com
o seguinte gradiente de solventes: utilize 30 mL de cada um dos eluentes:
hexano puro, hexano/acetona (7:3), acetona pura e acetona/metanol (8:1),
vertendo o solvente cuidadosamente pelas paredes internas da coluna,
tomando cuidado para não causar distúrbios ou agitação no nível de sílica na
coluna. Ao mesmo tempo, abra a torneira para escoar o solvente. Recolha as
frações em tubos de ensaio numerados previamente. Após o recolhimento
das frações deve-se realizar a cromatografia em camada fina das mesmas
juntamente com a amostra original. Caso as frações estejam muito diluídas
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elas podem ser concentradas com uma corrente de nitrogênio ou então cada
fração deve ser aplicada várias vezes até que se obtenha manchas
adequadas.

2 . 6 . Q U E S T I ON Á R I O
1- Cite os principais tipos de forças que fazem com que os componentes de
uma mistura sejam adsorvidos pelas partículas do sólido
2- Cite as características do solvente para arrastar os compostos adsorvidos
na coluna cromatográfica:
3- Fale sobre o princípio básico que envolve a técnica de cromatografia:
4- Por quê se deve colocar papel filtro na parede da cuba cromatográfica?
5- Se os componentes da mistura, após a eluição cromatográfica,
apresentam manchas incolores, qual o processo empregado para visualizar
estas manchas na placa cromatográfica?
6- O que é e como é calculado o Rf ?
7- Quais os usos mais importantes da cromatografia de camada fina?