TEZĂ DE DOCTORAT

Evaluare dermatoscopică, histologică şi

moleculară a melanomului şi a leziunilor cu
potenţial de transformare în melanom -
REZUMAT

Doctorand Loredana Ungureanu

Conducător de doctorat Prof. Dr. Rodica Cosgarea

 Loredana Ungureanu

CUPRINS

INTRODUCERE .............................................................................................................................. 9

STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII ............................................................................11

1. Tumorile melanocitare – diagnostic şi semnificaţie patologică ..........................13
1.1. Nevii melanocitari ................................................................................................................................................. 13
1.1.1. Nevii melanocitari congenitali .............................................................................................................. 13
1.1.2. Nevii melanocitari dobândiţi comuni (NMC) ................................................................................. 13
1.1.2.1. Epidemiologie............................................................................................................................................................ 13
1.1.2.2. Diagnostic clinic şi histopatologic ................................................................................................................ 13
1.1.2.3. Factori de risc pentru dezvoltarea NMC .................................................................................................. 14
1.1.2.4. Semnificaţia patologică a NMC ....................................................................................................................... 14
1.1.3. Nevii melanocitari atipici/displazici (NMA/NMD) ..................................................................... 14
1.1.3.1. Epidemiologie............................................................................................................................................................ 15
1.1.3.2. Diagnostic clinic şi dermatoscopic .............................................................................................................. 15
1.1.3.3. Diagnostic histopatologic................................................................................................................................... 16
1.1.3.4. Factori de risc pentru dezvoltarea NMD ................................................................................................. 18
1.1.3.5. Semnificaţia patologică a NMD ...................................................................................................................... 18
1.2. Melanomul ................................................................................................................................................................ 18
1.2.1. Epidemiologie ............................................................................................................................................... 18
1.2.2. Diagnostic clinic şi dermatoscopic ...................................................................................................... 19
1.2.3. Diagnostic histopatologic ........................................................................................................................ 20
1.2.4. Factori de risc pentru dezvoltarea melanomului ........................................................................ 20
1.2.5. Stadializare şi factori de prognostic ................................................................................................... 20
1.2.6. Semnificaţia patologică a melanomului............................................................................................ 21
2. Rolul dermatoscopiei în evaluarea leziunilor melanocitare cutanate ..............23
2.1. Diagnosticul leziunilor melanocitare prin dermatoscopie ................................................................ 23
2.1.1. Analiza modelului dermatoscopic ....................................................................................................... 23
2.1.2. Regula ABCD .................................................................................................................................................. 24
2.1.3. Lista celor 7-puncte.................................................................................................................................... 24
2.1.4. Metoda Menzies ........................................................................................................................................... 25
2.1.5. Algoritmul CASH .......................................................................................................................................... 25
2.1.6. Algoritmul ASAP .......................................................................................................................................... 25
2.1.7. Compararea algoritmilor diagnostici................................................................................................. 25
2.2. Urmărirea leziunilor melanocitare prin dermatoscopie .................................................................... 26
2.2.1. Noţiuni generale .......................................................................................................................................... 26
2.2.2. Modele de modificare dermatoscopică ............................................................................................. 29
2.3. Evaluarea preoperatorie a grosimii melanomului prin dermatoscopie .................................... 32
2.3.1. Rolul evaluării preoperatorii a grosimii melanomului ............................................................. 32
2.3.2. Evaluarea dermatoscopică a grosimii melanomului .................................................................. 32
2.3.2.1. Criterii dermatoscopice de progresie a melanomului.................................................................... 32
2.3.2.2. Evaluarea preoperatorie a grosimii melanomului prin regula ABCD a dermatopscopiei 34
2.3.2.3. Combinarea criteriilor clinice şi dermatoscopice pentru evaluarea preoperatorie a grosimii melanomului 34
3. Modificări moleculare în leziunile melanocitare .......................................................35
3.1. Căi implicate în patogeneza melanomului ................................................................................................. 35
3.1.1. Căile de proliferare ..................................................................................................................................... 35
3.1.1.1. Rolul ciclinelor în proliferarea celulară din leziunile melanocitare ...................................... 36
3.1.1.2. Rolul căii MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) în leziunile melanocitare ......... 37
3.1.2. Căile de senescenţă..................................................................................................................................... 38
3.1.3. Căile de apoptoză ........................................................................................................................................ 39
3.2. Micromediul tumoral ........................................................................................................................................... 42
3.2.1. Rolul moleculelor de adeziune în melanom ................................................................................... 42
3.2.2. Rolul stromei tumorale în melanom .................................................................................................. 43
3.2.3. Concluzii .......................................................................................................................................................... 44

CONTRIBUŢIA PERSONALĂ .................................................................................................45

1. Ipoteză de lucru. Obiective .................................................................................................47
2. Metodologie generală............................................................................................................49
3. Studiul 1. Urmărirea leziunilor melanocitare prin dermatoscopie – modele de modificare
dermatoscopică ............................................................................................................................51
3.1. Introducere ............................................................................................................................................................... 51
3.2. Ipoteză de lucru/Obiective................................................................................................................................ 52
3.3. Material şi metodă ................................................................................................................................................. 52
 Loredana Ungureanu

3.4. Rezultate .................................................................................................................................................................... 54

3.5. Discuţii ........................................................................................................................................................................ 67
3.6. Concluzii..................................................................................................................................................................... 71
4. Studiu 2. Evaluarea preoperatorie a grosimii melanomului prin dermatoscopie 73
4.1. Introducere ............................................................................................................................................................... 73
4.2. Ipoteză de lucru/Obiective ............................................................................................................................... 74
4.3. Material şi metodă ................................................................................................................................................ 74
4.4. Rezultate .................................................................................................................................................................... 75
4.5. Discuţii ........................................................................................................................................................................ 87
4.6. Concluzii..................................................................................................................................................................... 91
5. Studiul 3. Modificări moleculare în leziunile melanocitare.................................. 93
5.1. Introducere ............................................................................................................................................................... 93
4.2. Ipoteză de lucru/Obiective................................................................................................................................... 98
4.3. Material şi metodă ................................................................................................................................................... 98
4.4. Rezultate ................................................................................................................................................................. 104
4.5. Discuţii ..................................................................................................................................................................... 109
4.6. Concluzii.................................................................................................................................................................. 111
6. Concluzii generale ............................................................................................................... 113
7. Originalitatea şi contribuţiile inovative ale tezei.................................................... 115
REFERINŢE ................................................................................................................................. 119
ANEXE
Anexa 1 – Modele de modificare dermatoscopică ............................................................................................. 127
Anexa 2 – Rezultatele studiilor in silico realizate pentru genele de interes luate în studiu .......... 133

Cuvinte cheie: melanom, nevi melanocitari, dermatoscopie, examen

histopatologic, oncogene.
 Loredana Ungureanu

Introducere
Melanomul este o tumoră agresivă, rezistentă la tratament a melanocitelor. Incidenţa melanomului a crescut
constat în toată lumea. Spectrul curent al acestei tumori include două extreme. La o extremă se află melanoamele
cutanate primare subţiri care se caracterizează printr-un tratament standardizat şi o rată de vindecare ridicată. La
polul opus se află melanomul metastatic pentru care nu există un tratament cu eficienţă dovedită şi care se asociază
cu un prognostic nefast. Având în vedere că tratamentul melanomului avansat este încă în stadiu experimental, se
depun eforturi deosebite de cercetare pentru a înţelege patologia, genetica şi imunologia melanomului şi mai ales
pentru a găsi metode reproductibile de diagnostic precoce.
Dermatoscopia este o tehnică diagnostică non-invazivă care utilizează mărirea optică pentru a permite
vizualizarea unor structuri morfologice invizibile cu ochiul liber, realizând o legătură între examenul clinic
dermatologic şi dermatopatologie. Dermatoscopia oferă detalii morfologice suplimentare pentru diagnosticul unei
varietăţi de leziuni pigmentare, fiind deosebit de importantă în special în diagnosticul melanomului şi a imitatorilor
acestuia.
Dermatoscopia a crescut semnificativ sensibilitatea şi specificitatea diagnosticului de melanom comparativ cu
examinarea clinică. Totuşi, sensibilitatea nu atinge 100% şi unele melanoame nu pot fi diagnosticate nici prin această
metodă. Ca urmare, un procent de nevi trebuie excizaţi pentru a nu rata diagnosticul de melanom. Urmărirea
leziunilor pigmentare prin dermatoscopie permite detectarea unor modificări minime în ceea ce priveşte
dimensiunea sau modelul dermatoscopic, modificări invizibile la examinarea cu ochiul liber sau la urmărirea prin
fotografierea întregii suprafeţe corporale şi care permit diagnosticul de melanom incipient. Prin utilizarea urmăririi
dermatoscopice, procentul observat de melanoame subţiri şi in situ este superior celui aşteptat în populaţia generală.
Criteriile de selecţie a pacienţilor pentru urmărirea dermatoscopică sunt deosebit de importante, având în vedere că
doar pacienţii cu risc crescut şi/sau leziunile atipice au un beneficiu real consecutiv urmăririi.
În ciuda faptului că, criteriul „evoluţie” a fost inclus în algoritmul ABCDE de diagnostic a melanomului, nu
există date obiective care să indice exact care modificări sunt mai tipice sau sugestive pentru malignitate, în special
în leziunile incipiente, de mici dimensiuni. Pornind de la aceste informaţii, unul dintre obiectivele cercetării de faţă a
fost evaluarea modificărilor dermatoscopice care apar pe parcursul urmăririi leziunilor melanocitare la pacienţii cu
risc crescut de melanom, pentru a identifica schimbările care indică malignitatea. Ipoteza este că nevii melanocitari
şi melanoamele prezintă, în timp, modele de modificare diferite, modele care se corelează cu aspectele
histopatologice.
Dermatoscopia şi-a dovedit utilitatea şi în evaluarea preoperatorie a grosimii tumorale. Aceasta este deosebit
de importantă în cazul melanomului cutanat, influenţând atât prognosticul cât şi stabilirea marginilor de excizie şi
selectarea pacienţilor în vederea efectuării tehnicii ganglionului santinelă. S-a observat că frecvenţa de apariţie a
unor caracteristici dermatoscopice este fie direct proporţională – ariile gri-albastre sau vălul gri-albăstrui, striurile
radiare şi pattern-ul vascular neregulat- fie invers proporţională -reţeaua pigmentară- cu grosimea melanomului.
Aceste rezultate sunt consecinţa unei corelaţii puternice între criteriile dermatoscopice şi modificările
histopatologice dependente de progresia melanomului. Un al doilea scop al cercetării a fost de a investiga existenţa
unei corelaţii între frecvenţa de apariţie a diferitelor structuri dermatoscopice, utilizând analiza modelului
dermatoscopic şi grosimea histologică a tumorii, alegându-se ca şi punct graniţă un indice Breslow de 1 mm.
Cu toate că nevi melanocitari sunt factori de risc independenţi pentru melanomul cutanat, rolul lor etiologic
nu este stabilit cu exactitate. Pe de altă parte, nevi melanocitari, care sunt tumori benigne derivate din acelaşi tip de
celule ca şi melanomul, pot oferi informaţii cu privire la patogeneza şi progresia acestuia. În acest context, un al
treilea scop al cercetării a fost evaluarea expresiei unor gene cu rol dovedit în carcinogeneză, comparativ în
melanom, NMD, NMC şi pielea normală.
Prin această cercetare am încercat să aduc noi informaţii cu privire la rolul dermatoscopiei în diagnosticul
leziunilor melanocitare şi în evaluarea preoperatorie a grosimii tumorale, în vederea facilitării diagnosticului
incipient şi a stabilirii strategiei terapeutice. De asemenea am încercat să studiez expresia unor gene cu potenţial rol
diagnostic/prognostic în melanom, în vederea unei mai bune înţelegeri a acestei neoplazii caracterizate printr-o
agresivitate crescută. Rezultatele acestei cercetări trebuie validate pe loturi mai largi de studiu şi aplicate în practica
clinică pentru un diagnostic şi tratament precoce şi eficient.

Studiul 1. Urmărirea leziunilor melanocitare prin dermatoscopie –

modele de modificare dermatoscopică
Obiectivul acestui studiu retrospectiv a fost evaluarea modificărilor dermatoscopice care apar pe parcursul
urmăririi leziunilor melanocitare la pacienţii cu risc crescut de melanom, pentru a identifica schimbările care indică
malignitatea. Ipoteza studiului de faţă, bazată pe cunoştinţele actuale, este că nevii melanocitari şi melanoamele
prezintă, în timp, modele de modificare diferite, modele care se corelează cu aspectele histopatologice.
 Loredana Ungureanu

Material şi metodă
Obiectul acestui studiu retrospectiv a fost reprezentat de 86 de leziuni pigmentare echivoce urmărite
dermatoscopic înaintea exciziei. Leziunile au fost urmărite şi excizate în cadrul Clinicii Dermatologie Cluj, în perioada
ianuarie 2006 – decembrie 2012 (72 de luni) și au reprezentat 2.9% din totalul de 2965 leziuni urmărite la 1406
pacienți.
La prima examinare toate leziunile prezentau atipie dermatoscopică, dar nu întruneau criteriile de melanom,
utilizând metoda analizei modelului dermatoscopic. Vizitele de urmărire au fost programate la intervale diferite,
cuprinse între 3 şi 12 luni, în funcţie de atipia dermatoscopică. Urmărirea la intervale de 3 luni a fost utilizată în cazul
leziunilor cu grad moderat de atipie iar cea la 6-12 luni în cazul celor cu grad scăzut de atipie.
Din studiu au fost excluse leziunile localizate la nivel genital, palmo-plantar sau la nivelul extremităţii cefalice,
datorită modelului dermatoscopic particular. Istoricul de traumatism şi expunerea recentă (ultimele trei luni) la
radiaţii ultraviolete naturale sau artificiale au reprezentat alte criterii de excludere.
Toate leziunile au fost excizate deoarece pe parcursul urmăririi s-au modificat din punct de vedere al
aspectului dermatoscopic, modificările fiind considerate semnificative de către doi evaluatori independenţi.
Modificările dermatoscopice semnificative au fost definite ca şi creştere asimetrică în dimensiune, modificare
asimetrică a pigmentaţiei sau apariţia de structuri noi, sugestive pentru melanom.
Leziunile excizate au fost supuse examenului histopatologic utilizând tehnica de includere în parafină,
efectuarea de secţiuni seriate şi colorarea cu hematoxilină-eozină.
Pe baza diagnosticului histopatologic, leziunile au fost împărţite în două categorii: nevi melanocitari şi
melanoame. Nevii melanocitari au fost divizaţi, la rândul lor, în nevi melanocitari displazici (NMA) cu trei grade de
displazie (uşoară, moderată, severă) şi nevi melanocitari comuni (NMC), iar melanoamele au fost împărţite în
melanoame in situ şi melanoame invazive.
Imaginile dermatoscopice corespunzătoare primei vizite şi vizitei la care s-a indicat excizia leziunii au fost
comparate pentru a detecta modificarea dermatoscopică utilizând următoarele variabile:
1. Modificare a dimensiunii – absentă, creştere în dimensiune simetrică sau asimetrică.
2. Modificare a pigmentaţiei/culorii:
• Accentuarea pigmentaţiei sau culorii – absentă, simetrică, asimetrică, apariţia unei pigmentaţii
excentrice
• Depigmentare – absentă, asimetrică, apariţia unor zone brun deschise.
3. Apariţia de structuri dermatoscopice noi:
• Structuri gri-albastre – absente, zone fără structură, reţea gri-albastră, puncte/globuli gri-albaştri
• Structuri de culoare albă – absente sau prezente
• Structuri de culoare roşie – absente, prezente
• Puncte/globuli bruni sau negri – absenţi, periferici, centrali, periferici şi centrali
4. Modificări ale reţelei pigmentare (absente, reţea pigmentară atipică) sau apariţia de
pseudopode/extensii neregulate.
Modificările dermatoscopice apărute în nevii melanocitari au fost comparate cu cele apărute în melanoame
pentru a detecta schimbările care ridică suspiciunea de leziune malignă.

Rezultate
După excizie, examenul histopatologic a arătat existenţa a 50 (58.1%) nevi melanocitari atipici, 4 (4.7%)
melanoame in situ, 2 (2.3%) melanoame invazie şi 30 (34.9%) nevi melanocitari comuni (fig. 3.4)
Evaluarea modificării nevilor melanocitari comparativ cu melanoamele pe parcursul urmăririi
dermatoscopice
În prima parte a studiului am analizat diferenţele procentuale ale diverselor elemente dermatoscopice între
grupul pacienţilor la care histopatologic s-a diagnosticat melanom (lotul M) comparativ cu grupul subiecţilor la care
s-au diagnosticat nevi melanocitari (lotul NM). Am observat diferențe semnificative statistic, între cele două loturi, în
ceea ce privește creșterea asimetrică, apariția zonelor brun-deschis, a zonelor fără structură gri-albastre, a rețelei
gri-albastre, a pseudopodelor/extensiilor neregulate. Toate aceste modificări au fost observate mai frecvent în lotul
M.
Tabel 1. Validitatea diferitelor modificări dermatoscopice în diferenţierea melanom/nev melanocitar
Sensibilitate Specificitate Valoare Valoare
% % predictivă predictivă
pozitivă % negativă
%
Creştere asimetrică 50.00 90.00 27.27 96
Zone brun-deschis 83.3 63.76 14.71 98.08
Zone fără structură gri-albastre 33.33 97.5 50 95.12
Reţea gri-albastră 16.67 96.25 25 93.90
Pseudopode 33.3 95.00 33.3 95
 Loredana Ungureanu

Evaluarea modificării nevilor melanocitari atipici comparativ cu nevii melanocitari comuni pe parcursul
urmăririi dermatoscopice
În a doua parte a analizei rezultatelor am comparat diferenţele procentuale ale diverselor elemente descrise la
dermatoscopie între grupul pacienţilor la care s-au diagnosticat nevi melanocitari atipici (lotul NMA) comparativ cu
grupul subiecţilor la care s-au diagnosticat nevi melanocitari comuni (lotul NMC). În lotul NMA au apărut mai
frecvent, cu semnificație statistică, următoarele structuri: zone de culoare brun-deschis, puncte/globuli gri-albaștri,
pseudopode/extensii neregulate.
Evaluarea modificării nevilor melanocitari atipici comparativ cu melanoamele pe parcursul urmăririi
dermatoscopice
În a treia parte a analizei rezultatelor am comparat diferenţele procentuale ale diverselor elemente
dermatoscopice între grupul pacienţilor la care s-au diagnosticat histopatologic nevi melanocitari atipici (lotul NMA)
şi grupul subiecţilor la care s-a diagnosticul histopatologic a fost de melanom (lotul M). În lotul M au apărut mai
frecvent, cu semnificație statistică, următoarele structuri: zone de culoare brun-deschis, zone fără structură gri-
albastre, rețea gri-albastră, iar în lotul NMA s-au descris mai frecvent puncte/globuli gri-albaștri.

Concluzii
Studiul de faţă a permis observarea anumitor modificări a căror specificitate este foarte crescută pentru
diagnosticul de melanom – creşterea asimetrică, apariţia zonelor fără structură sau a reţelei gri-albastre, apariţia
pseudopodelor sau a striurilor radiare. Astfel, prezenţa oricăreia dintre aceste modificări trebuie să ridice
suspiciunea de melanom şi să conducă la excizia leziunii.
Modificarea dermatoscopică cu sensibilitatea cea mai crescută a fost reprezentată de apariţia zonelor fără
structură brun-deschis. Deşi specificitatea acestei schimbări este mai scăzută, ea putând fi observată şi în NMA,
observarea ei impune, de asemenea, excizia leziunii.
Cu toate că nu a fost atins pragul de semnificaţie statistică, considerăm că apariţia globulilor/punctelor
neregulate la nivelul unei leziuni considerate atipice dermatoscopic la prima vizită, în absenţa expunerii solare şi la
persoane peste 40 de ani reprezintă, de asemenea, indicaţie de excizie.
Deşi studiul descris nu a evidenţiat o modificare dermatoscopică singulară, cu o sensibilitate foarte crescută
care să permită stabilirea diagnosticului de melanom, în toate cazurile, el a permis descrierea unor schimbări foarte
specifice care indică necesitatea exciziei.
În ciuda faptului că, criteriul „evoluţie” a fost inclus în algoritmul ABCDE de diagnostic a melanomului, nu
există date obiective care să indice exact care modificări sunt mai tipice sau sugestive pentru malignitate, în special
în leziunile incipiente, de mici dimensiuni. Studiul de faţă demonstrează că pe parcursul urmăririi leziunilor
melanocitare atipice dermatoscopic, NMA şi melanoamele evoluează diferit. Astfel, urmărirea dermatoscopică este
utilă, în special în cazul pacienţilor cu multiple leziuni melanocitare. Principalele avantaje ale acestei tehnici sunt
reprezentate de identificarea leziunilor maligne într-un stadiu timpuriu şi reducerea numărului exciziilor inutile.

Studiul 2. Evaluarea preoperatorie a grosimii melanomului prin

dermatoscopie
Scopul acestui studiu a fost de a investiga existenţa unei corelaţii între frecvenţa de apariţie a diferitelor
structuri dermatoscopice, utilizând analiza modelului dermatoscopic şi grosimea histologică a tumorii, alegându-se
ca şi punct graniţă un indice Breslow de 1 mm. Ipoteza studiului a fost reprezentată de existenţa unei corespondenţe
între diferitele structuri dermatoscopice şi histopatologice, pe măsura progresiei melanomului. Un alt obiectiv a fost
reprezentat de demonstrarea corelaţiei dintre structurile dermatoscopice şi examenul histopatologic în cazul
leziunilor cu un Breslow mai mic de 1 mm.

Material şi metodă
O serie de 100 de melanoame consecutive, diagnosticate şi excizate în cadrul Clinicii Dermatologie Cluj în
perioada ianuarie 2006 – octombrie 2012 au fost introduse în acest studiu retrospectiv. Au fost excluse din studiu
leziunile care nu au putut fi încadrate într-un singur câmp dermatoscopic precum şi leziunile localizate la nivel facial
sau acral, având în vedere modelul dermatoscopic particular.
Din punct de vedere clinic, leziunile au fost clasificate în funcţie de forma clinică (melanoame extensive în
suprafaţă şi nodulare) şi în funcţie de palpabilitate (leziuni plane, leziuni reliefate şi leziuni nodulare).
Leziunile au fost fotografiate cu ajutorul unui aparat de fotografiat Nikon Coolpix 4500 şi s-au obţinut imagini
dermatoscopice in vivo, la o mărire standard de 10X utilizând dermatoscopul Heine Delta 20 adaptat la aparatul foto
Nikon, după acoperirea leziunii cu o soluţie antiseptică (Mikrozid AF) pentru a face stratul cornos translucent.
Imaginile fotografice au fost obţinute în aceleaşi condiţii tehnice, după îndepărtarea firelor de păr de pe leziune şi de
pe pielea adiacentă leziunii cu o lamă de ras.
 Loredana Ungureanu

Leziunile excizate au fost supuse examenului histopatologic utilizând tehnica de includere în parafină,
efectuarea de secţiuni seriate şi colorarea cu hematoxilină-eozină. În funcţie de grosimea Breslow, melanoamele au
fost împărţite în patru categorii: in situ, sub 1 mm, între 1-2 mm şi peste 2 mm grosime.
S-a urmărit existenţa unei corelaţii între indicele Breslow şi vârsta, sexul pacientului, forma clinică,
palpabilitatea şi criteriile dermatoscopice caracteristice melanomului.
Imaginile dermatoscopice au fost analizate, orb în ceea ce priveşte grosimea tumorală, de către doi evaluatori
independenţi, pentru a stabili prezenţa sau absenţa următoarelor structuri dermatoscopice:
• Reţea pigmentară atipică
• Puncte brune/negre neregulat distribuite
• Globuli bruni/negri neregulat distribuiţi
• Pseudopode
• Striuri periferice
• Zone gri-albastre fără structură
• Reţea gri-albastră
• Zone fără structură brun deschise
• Zone albe cicatriciale
• Aspect vascular atipic.
Structurile dermatoscopice evaluate au fost selectate din literatura, fiind considerate relevante103,106,107,110-113.
Pentru 24 de leziuni in situ sau cu indice Breslow sub 1 mm s-au făcut secţiuni seriate corespunzător
diferitelor structuri dermatoscopice observate şi s-a căutat corespondentul histopatologic. Structurile
dermatoscopice urmărite au fost următoarele: reţeaua pigmentară atipică, striurile radiare, punctele şi globulii bruni
sau negri, structurile gri-albastre şi aspectul vascular neregulat sau polimorf.

Rezultate
Conform examenului histopatologic, după calcularea indicelui Breslow, 13% din pacienţi au fost clasificaţi ca
având melanom in situ, 17% melanom cu grosime sub 1 mm, 31% melanom cu grosime între 1 şi 2 mm şi 39%
melanom cu grosime peste 2 mm. Am observat că indicele Breslow a crescut odată cu vârsta pacienţilor (test ANOVA;
p=0.004).
Evaluarea structurilor dermatoscopice
Am analizat relaţia diverselor entităţi descrise la dermatoscopie cu indicele Breslow împărţind leziunile în
două categorii: grosime sub 1 mm şi peste 1 mm (tabel 2).

Tabel 2. Structuri dermatoscopice în funcţie de indicele Breslow

Variabilă Indice Breslow <1 mm Indice Breslow >1 mm P
Vârsta 42±14.9 50.9±13.3 0.004
Sex Masculin 9 30 0.3
Feminin 21 40
Forma clinică MN 0 28 <0.001
MES 30 42
Nodular 0 38
Palpabilitate Reliefat 13 31 <0.001
Plan 17 1
Reţea pigmentară atipică 25 (83.3%) 25 (35.7%) <0.001
Puncte brune/negre neregulat 13 (43.3%) 28 (40.0%) 0.9
distribuite
Globuli bruni/negri neregulat 18 (60.0%) 42 (60.0%) 1
distribuiţi
Pseudopode 2 (6.6%) 10 (14.0%) 0.4
Striuri periferice 14 (46.6%) 30 (42.5%) 0.8
Zone gri-albastre 13 (43.3%) 67 (95.7%) <0.001
Reţea gri-albastra 18 (60%) 16 (22.8%) 0.001
Zone brun-deschis 16 (53.3%) 5 (7.1%) <0.001
Model vascular atipic 4 (13.3%) 49 (70%) <0.001
Zone albe-cicatriciale 4 (13.3%) 34 (48.5%) 0.002

Concluzii
Studiul de faţă demonstrează că anumite structuri dermatoscopice prezintă o asociere semnificativă statistic
cu grosimea melanomului. Astfel, dermatoscopia poate avea un rol în evaluarea preoperatorie a grosimii tumorale, în
vederea unei mai bune planificări a strategiei diagnostice şi terapeutice. Totuşi, performanţa diagnostică nu atinge
100%, fiind necesare studii suplimentare, mai ales prospective.
Conform observaţiilor studiului de faţă, melanoamele subţiri prezintă reţea pigmentară atipică, reţea gri-
albastră şi zone brun-deschis, iar melanoamele groase se asociază cu zone albe-cicatriciale, model vascular atipic şi
 Loredana Ungureanu

zone gri-albastre fără structură. Aceste structuri dermatoscopice au un corespondent histopatologic definit, iar
distribuţia lor corespunde modelului de progresie al melanomului.

Studiul 3. Modificări moleculare în leziunile melanocitare

Nevii melanocitari dobândiţi reprezintă factori de risc independenţi pentru melanomul cutanat, numărul total de
nevi melanocitari fiind cel mai important factor de risc independent pentru melanom, riscul de melanom crescând liniar cu
numărul de nevi melanocitari54. Prezenţa nevilor melanocitari displazici reprezintă factor de risc adiţional, independent
pentru melanom. Cu toate acestea, rolul etiologic exact pe care NM îl au în dezvoltarea melanomului nu a fost stabilit. S-a
sugerat că NMC, NMD şi melanomul reprezintă etape evolutive distincte ale leziunilor melanocitare, totuşi nu există dovezi
care să sugereze o progresie obligatorie prin aceste etape. Mai mult, există dovezi că melanomul apare cel mai frecvent de
novo, dezvoltându-se rar pe leziuni preexistente care pot fi atât NMC cât şi NMD. În plus majoritatea NM sunt stabili în
timp. Pe de altă parte, NM care sunt tumori benigne derivate din acelaşi tip de celule ca şi melanomul, pot oferi informaţii
cu privire la patogeneza şi progresia acestuia.
În acest context, studiul de faţă îşi propune să evalueze expresia unor gene cu rol dovedit în carcinogeneză,
comparativ în melanom, NMD, NMC şi pielea normală.

Material şi metodă
Probe biologice
În vederea analizei expresiei genice, s-au prelevat probe biologice din 13 melanoame, 11 nevi atipici şi 14 nevi
comuni histopatologic. De asemenea au fost recoltate 10 probe reprezentând ţesut cutanat normal, în calitate de martor
sau referinţă. Toate probele au fost recoltate în cadrul Clinicii de Dermatologie Cluj, după obţinerea consimţământului
informat al pacientului. Probele tisulare au fost imediat îngheţate şi apoi conservate în azot lichid la -80oC. Diagnosticul
histopatologic s-a efectuat de rutină pentru toate probele, fragmentele de studiu fiind prelevate din zone uniforme,
omogene dermatoscopic. Din studiu au fost excluse leziunile de dimensiuni mici, în cazul cărora diagnosticul
histopatologic ar fi fost influenţat prin prelevarea de ţesut în scop de cercetare.
Au fost alese pentru analiză genele CYR61, GDF15, NDRG1, KRT18, CLU, BCL2 şi ITGAV. Alegerea lor a ţinut cont de
mecanismele moleculare principale în care acestea sunt implicate: proliferarea şi progresia celulară (KRT18, NDRG1),
apoptoză (BCL2, CLU), angiogeneză primară (CYR61 şi GDF15) şi adeziunea celulară (ITGAV). Normalizarea nivelelor de
expresie a genelor alese s-a făcut prin raportare la gena housekeeping 18S.
Reacţia de PCR cantitativ (qRT-PCR)
Reacţia de PCR cantitativ în timp real, qRT-PCR (quantitative real time PCR) este o tehnică capabilă să
cuantifice precis abundenţa transcripţională a genelor selecţionate în urma analizelor de genomică funcţională,
conceptul de timp real referindu-se la detectarea produşilor de PCR pe măsura acumulării. Deşi analiza de qRT-PCR
este denumită analiză cantitativă, ea nu se referă la o analiza cantitativă absolută. Aceasta se datorează faptului că nu
se poate stabili cu exactitate numărul de copii (transcripţi mARN) ai unei gene indiferent de tipul de ţesut utilizat sau
exactitatea măsurătorii realizate.
Schimbările de expresie genică (fold change – FC) au fost calculate prin metoda ΔCp, valorile CP fiind
normalizate in prealabil la valorile genei housekeeping (18S). Valoarea medie de expresie a fiecărei gene la nivelul
pielii (ţestul normal) a fost considerată referinţă pentru determinarea expresiei genice la nivelul nevilor comuni,
nevilor atipici şi a melanoamelor.
Pentru o mai uşoară înţelegere a supra- sau subexpresiei genice în grupul de interes vs. grupul de referinţă a
fost calculată valoarea FR (fold regulation). Această valoare coincide cu FC pentru rapoarte supraunitare fiind egală
cu -1/FC pentru valori subunitare şi arată de câte ori creşte respectiv descreşte nivelul de expresie în proba de
interes faţă de proba de referinţă.

Rezultate
KRT18
Gena KRT18 a prezentat o subexpresie pronunţată în nevul comun (FR=-11.11) şi melanom (FR=-2.44) faţă de
ţesutul normal şi o expresie uşor crescută în nevul atipic (FR=1.42). Analiza statistică a pus in evidenţă diferenţe
semnificative in comparaţiile M vs TN (p=0.038), NA vs NC (p=0.001) şi NC vs TN (p<0.001).
BCL-2
Rezultatele obţinute au arătat o supraexprimare a genei BCL2 atât in melanom (FR=1.58), nev atipic (FR=1.9)
şi nev comun (FR=2.91) faţă de ţesutul normal, insă doar în comparaţia NC vs TN (p=0.01) valorile au fost
semnificative statistic. Nivelul de expresie al genei BCL2 a fost statistic semnificativ crescut şi in nevul comun faţă de
melanom (p=0.042).
 Loredana Ungureanu

CLU
Pentru gena CLU a fost observată o subexpresie în melanom (FR=-1.52) şi nevul comun (FR=-1.96) faţă de
ţesutul normal precum şi o uşoară subexpresie în nevul atipic (FR=-1.27). Doar in comparaţia NC vs TN (p=0.002)
valorile au fost semnificative statistic.
CYR61
Gena CYR61 a prezentat o subexpresie în melanom (FR=-1.49) şi nevul comun (FR= -3.85) faţă de ţesutul
normal şi o supraexpresie în nevul atipic (FR= 1.67). Analiza statistică a pus in evidenţă rezultate semnificative doar
în comparaţia NA vs NC (p<0.001).
GDF15
Nivele mari de expresie ale genei GDF15 au fost observate în melanom (FR=17.09) şi nevul atipic (FR=3.73)
faţă de ţesutul normal. Analiza statistică a pus in evidenţă diferenţe statistic semnificative in comparaţiile M vs NC
(p=0.033), M vs TN (p=0.033) precum şi NA vs NC (p=0.02) respectiv NA vs TN (p=0.012).
ITGAV
Deşi uşoare creşteri ale nivelului de expresie al ITGAV au fost remarcate în nevul comun faţă de ţesutul
normal (FR= 1.40) analiza statistică nu a identificat diferenţe între grupurile luate in studiu.

Concluzii
Prelucrarea statistică a evidenţiat diferenţe între grupurile luate in studiu pentru toate moleculele evaluate, cu
excepţia ITGAV.
KRT18 este exprimată în melanom şi ar putea servi la diferenţierea NA de NC.
BCL-2 poziţionează NA între NC şi M, dar nu permite un diagnostic diferenţial între leziunile melanocitare; nu
pare a juca un rol major în rezistenţa la apoptoză.
CLU situează NA pe o poziţie intermediară între NC şi M, dar nu permite diferenţierea leziunilor melanocitare;
rol important în rezistenţa la apoptoză a melanomului, putând servi ca o ţiintă terapeutică.
CYR61 – un rol de supresie tumorală în leziunile incipiente, ca un răspuns la stres şi o depăşire a acestei
funcţii asociată cu scăderea expresiei în leziunile invazive; rol de diferenţiere a NA de NC.
GDF15 reprezintă un marker de progresie în melanom, dar şi un marker de diferenţiere între NM şi M sau
între NC şi NA.
ITGAV este un marker de progresie, de prognostic nefavorabil fiind asociat cu invazia şi metastazarea.

Originalitatea şi contribuţiile inovative ale tezei

În cadrul acestei lucrări am încercat să evaluez din punct de vedere dermatoscopic, histologic şi molecular
melanomul şi leziunile cu potenţial de transformare în melanom, având în vedere că acesta din urmă reprezintă nu
numai cea mai serioasă problemă oncologică în dermatologie, dar şi una dintre cele mai agresive neoplazii din
întreaga oncologie. Singurul tratament eficient, care asigură vindecarea, în cazul melanomului este excizia în stadiu
incipient. În acest scop, însă este necesar să se realizeze un diagnostic precoce. Dermatoscopia este o tehnică non-
invazivă care permite diagnosticul şi urmărirea leziunilor melanocitare, dar şi evaluarea preoperatorie a grosimii
histologice a tumorii.

Studiul de analiză a modificărilor dermatoscopice a permis evidenţierea unor schimbări foarte specifice
pentru melanom care impun excizia leziunii. Studiul de faţă reprezintă primul studiu de urmărire dermatoscopică
din ţara noastră. În plus, au fost evaluate structuri dermatoscopice nou descrise, care nu au fost investigate în
studiile anterioare.

Evaluarea preoperatorie a grosimii melanomului este importantă în vederea stabilirii unei conduite
terapeutice optime. Studiul de evaluare dermatoscopică a grosimii tumorale a permis evidenţierea unei corelaţii
semnificative între anumite structuri dermatoscopice şi indicele Breslow, considerând ca şi punct graniţă o grosime
de 1 mm. Studiile anterioare au utilizat un punct graniţă de 0.75mm, care este dificil de aplicat în practică. Mai mult,
studiul de faţă a evaluat structuri dermatoscopice nou descrise şi puţin investigate anterior.

Studiul de analiză genetică este inovativ pe de o parte prin cercetarea unor gene puţin sau deloc investigate în
tumorile melanocitare iar pe de altă parte prin tehnica utilizată. El a permis evidenţierea unor gene cu potenţial rol
diagnostic/prognostic în melanom, însă rezultatele trebuie validate pe loturi mai largi şi prin tehnici uzuale.
PhD Thesis

Dermatoscopical, histological and molecular

assessment of melanoma and lesions with
potential of developing into melanoma -
SYNOPSIS

PhD Student Loredana Ungureanu

PhD Coordinator Professor Dr. Rodica Cosgarea

 Loredana Ungureanu

TABLE OF CONTENTS

INTRODUCTION ................................................................................................................................................................. 9
CURRENT STATE OF KNOWLEDGE ................................................................................................................................................. 11
Melanocytic tumours – diagnosis and pathological significance ................................................................................... 12
Melanocytic naevi ......................................................................................................................................................................... 12
Congenital melanocytic naevi .................................................................................................................................................. 12
Common acquired melanocytic naevi (CMN) .......................................................................................................................... 12
Epidemiology ...................................................................................................................................................................... 12
Clinical and histopathological diagnosis ............................................................................................................................. 12
Risk factors for CMN development .................................................................................................................................... 13
The pathological significance of CMN ................................................................................................................................ 13
Atypical/dysplastic melanocytic naevi (AMN/DMN)............................................................................................................ 13
Epidemiology ...................................................................................................................................................................... 13
Clinical and dermatoscopic diagnosis ................................................................................................................................. 14
Histopathological diagnosis ................................................................................................................................................ 15
Risk factors for DMN development .................................................................................................................................... 17
The pathological significance of DMN ................................................................................................................................ 17
Melanoma ..................................................................................................................................................................................... 17
Epidemiology ........................................................................................................................................................................... 17
Clinical and dermatoscopic diagnosis ...................................................................................................................................... 18
Histopathological diagnosis ..................................................................................................................................................... 19
Risk factors for melanoma development ................................................................................................................................. 19
Staging and prognosis factors .................................................................................................................................................. 19
The pathological significance of DMN ..................................................................................................................................... 22
The role of dermatoscopy in assessing melanocytic skin lesions .................................................................................... 22
The diagnosis of melanocytic lesions through dermatoscopy ...................................................................................................... 22
The dermatoscopy pattern analysis......................................................................................................................................... 22
The ABCD rule .......................................................................................................................................................................... 23
The list of the 7 points ............................................................................................................................................................. 23
The Menzies method ............................................................................................................................................................... 24
The CASH algorithm ................................................................................................................................................................. 24
The ASAP algorithm ................................................................................................................................................................. 24
A comparison of the diagnosis algorithms............................................................................................................................... 24
Melanocytc lesions surveillance through dermatoscopy ............................................................................................................. 25
General concepts ..................................................................................................................................................................... 25
Patterns of dermatoscopic change ......................................................................................................................................... 28
Preoperative evaluation of melanoma thickness through dermatoscopy .................................................................................... 31
The role of preoperative evaluation of melanoma thickness .................................................................................................. 31
Dermatoscopic evaluation of melanoma thickness ................................................................................................................. 31
Dermatoscopic criteria for melanoma progression ............................................................................................................ 31
Preoperative evaluation of melanoma thickness through the ABCD rule of dermatoscopy .............................................. 33
Combining clinical and dermatoscopic criteria in preoperative evaluation of melanoma thickness ................................. 33
Molecular changes in melanocytic lesions ..................................................................................................................... 34
Pathways in melanoma pathogenesis ........................................................................................................................................... 34
Proliferation pathways ............................................................................................................................................................ 34
The role of cyclines in melanocytic lesions cell proliferation ............................................................................................. 35
The role of MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) in melanocytic lesions .................................................................. 36
Senescence pathways .............................................................................................................................................................. 37
Apoptosis pathways ................................................................................................................................................................. 38
Tumour microenvironment........................................................................................................................................................... 41
The role of adherence molecules in the melanoma ................................................................................................................ 41
The role of tumour stroma in the melanoma .......................................................................................................................... 42
Conclusions .............................................................................................................................................................................. 43
PERSONAL CONTRIBUTION ........................................................................................................................................................................... 44
WORK HYPOTHESIS. OBJECTIVES ................................................................................................................................................. 46
GENERAL METHODOLOGY .......................................................................................................................................................... 48
STUDY 1. DERMATOSCOPIC SURVEILLANCE OF MELANOCYTIC LESIONS – PATTERNS OF DERMATOSCOPIC CHANGES....................................... 50
Introduction .................................................................................................................................................................... 50
Work hypothesis/Objectives ........................................................................................................................................... 51
Materials and method .................................................................................................................................................... 51
Results ............................................................................................................................................................................ 53
Discussions ..................................................................................................................................................................... 66
 Loredana Ungureanu

Conclusions .................................................................................................................................................................... 70
STUDY 2. PREOPERATIVE EVALUATION OF MELANOMA THICKNESS THROUGH DERMATOSCOPY ................................................................ 72
Introduction ................................................................................................................................................................... 72
Work hypothesis/Objectives .......................................................................................................................................... 73
Materials and method ................................................................................................................................................... 73
Results ............................................................................................................................................................................ 74
Discussions ..................................................................................................................................................................... 86
Conclusions .................................................................................................................................................................... 90
STUDY 3. MOLECULAR CHANGES IN MELANOCYTIC LESIONS ............................................................................................................. 92
Introduction ................................................................................................................................................................... 92
Work hypothesis/Objectives .......................................................................................................................................... 97
Materials and method ................................................................................................................................................... 97
Results .......................................................................................................................................................................... 103
Discussions ................................................................................................................................................................... 108
Conclusions .................................................................................................................................................................. 110
GENERAL CONCLUSIONS .......................................................................................................................................................... 112
ORIGINALITY AND CONTRIBUTIONS ............................................................................................................................................ 114
REFERENCES ..................................................................................................................................................................... 119
ANNEXES ........................................................................................................................................................................... 127
Annex 1 – Patterns of dermatoscopic modifications ................................................................................................... 127
Annex 2 – The results of in silico studies for studied genes ......................................................................................... 132

Key words: melanoma, melanocytic nevi, dermatoscopy, histopathological

exam, oncogenes.
 Loredana Ungureanu

Introduction
Melanoma is an aggressive, treatment - resistant tumour of the melanocytes. Its incidence has been constantly
increasing throughout the world. There are two extremes within the current spectrum of this tumour. On the one
hand, there are the thin primary cutaneous melanomas, characterised by a standardised treatment and an increased
cure rate. On the other hand, there is the metastatic melanoma, whose treatment, though proven to be efficient, is
associated with a poor prognosis. Taking into account that the treatment for advanced melanoma is still under
experiment, vast research efforts have been mobilised in order to increase the understanding of the pathology,
genetics and immunology of the melanoma and particularly to find reproducible methods for early diagnosis.
Dermatoscopy is a non-invasive diagnosis technique which is based on optic enlargement allowing the
visualisation of invisible morphological structures, thus connecting the dermatological clinical examination with
dermatopathology. Dermatoscopy makes extra morphological details available in order to diagnose a large variety of
pigmented lesions. It is, thus, extremely important in the diagnosis of melanoma and its imitators.
Dermatoscopy has significantly increased the precision and specificity of melanoma diagnosis as compared to
clinical examination. However, the precision is not 100% and some melanomas might not be diagnosed through this
method. Consequently, a certain percentage of naevi have to be excised not to escape melanoma diagnosis. Surveying
the pigmented lesions with the help of dermatoscopy allows the detection of the slightest changes in size or
dermatoscopic pattern which cannot be normally visualised. Total-body photography surveillance enables the
diagnosis of early melanoma. However, in dermatoscopic monitoring, there can be noted a percentage of thin and in
situ melanoma increasingly higher than expected in general population. This is why the criteria used when selecting
patients for dermatoscopic surveillance are extremely important, taking into account that only high-risk patients or
those with atypical lesions really benefit as a result of this monitoring.
Although the ‘evolution’ criteria has been included in the ABCDE melanoma diagnosis algorithm, there is no
objective information that might indicate which changes are typical and which are more suggestive of malignity,
especially in the case of early, small-size lesions. Taking all these into account, the objective of this research has been
the evaluation of dermatoscopic changes that appear during the melanocytic lesions surveillance period at
melanoma high-risk patients in order to identify those particular changes that indicate malignity. The hypothesis is
that melanocytic naevi and melanomas are associated, in time, with different change patterns, correlated with
histopathological aspects.
Dermatoscopy has proved useful in the preoperative evaluation of tumour thickness. It is particularly
important in the case of cutaneous melanoma, as it influences both the prognosis and the definition of the margins of
resection as well as in selecting patients for sentinel lymph node biopsy (SLNB). It has been noted that the frequency
of dermatoscopic characteristics is either directly proportional – grey-blue areas or the grey-blue veil, radial striae
and irregular vascular pattern – or inversely proportional – the pigment network – with the thickness of the
melanoma. This is the result of the powerful connection between the dermatoscopic criteria and the melanoma
progression-dependent histopathological changes. A second objective was to investigate whether there is a
correlation between the frequency of various dermatoscopic structures, using the dermatoscopic pattern analysis
and the thickness of the tumour, selecting as borderline a Breslow index of 1mm.
Though melanocytic naevi are independent risk factors for cutaneous melanoma, their etiologic role has not
been given a precise definition. On the other hand, melanocytic naevi which are benign tumours originating from the
same cell type as melanoma, can be an important source of information about the pathogenesis and progression of
the latter. Within this context, the third objective of this study has been to compare the expression of some genes
which proved to play a role in the carcinogenesis in melanoma, dysplastic melanocytic naevi (DMN), common
melanocytic naevi (CMN) and normal skin.
This research has tried to bring forth new information related to the role of dermatoscopy in the diagnosis of
melanocytic lesions and in the preoperative evaluation of tumour thickness in order to facilitate early diagnosis and
set the therapeutic strategy. We have also tried to study the expression of certain genes with a potential role in the
diagnosis/prognosis of melanoma in order to improve the understanding of this highly aggressive neoplasia. The
results of this research have to be validated on larger-sized study groups and further applied in clinical practice for
an early and efficient diagnosis and treatment.

Study 1. Dermatoscopic surveillance of melanocytic lesions – patterns of

dermatoscopic changes
The objective of this retrospective study was to evaluate the dermatoscopic changes which appeared during
melanocytic lesions surveillance in patients at high risk for melanoma in order to identify the modifications that
indicate malignity. Based on current data, the hypothesis of the present study was that melanocytic naevi and
 Loredana Ungureanu

melanomas are associated, in time, with different change patterns, the latter correlating with histopathological
aspects.

Material and method

This study focused on 86 ambiguous pigmented lesions under dermatoscopic surveillance before excision. The
lesions had been monitored and excised within the Clinic of Dermatology Cluj, from January 2006 up to December
2012 (72 months) and represented 2.9% of the total 2,965 lesions under surveillance in 1,406 patients.
On first examination all lesions presented atypical dermatoscopic features, but did not meet all criteria to be
classified as melanomas using the dermatoscopic pattern analysis. Surveillance visits had been scheduled at different
time intervals, between 3 and 12 months, depending on the atypical dermatoscopic feature. Lesions moderately
atypical were surveyed at every 3 months, whereas those slightly atypical at every 6-12 months.
The study did not include lesions located at the genital, palm and plantar level as well as those located at
cephalic extremities due to their particular dermatoscopic patterns. Previous traumas or recent exposure (within the
previous 3 months) to natural or artificial UVAs were also among the exclusion criteria.
All lesions were resected as they presented significant dermatoscopic modifications (as assessed by two
independent evaluators) throughout the surveillance period. These significant dermatoscopic changes were defined
as asymmetrical size growth, asymmetrical pigmented growth or new, melanoma-suggestive structures.
Resected lesions underwent histopathological examination through paraffin embedding, serial sectioning and
hematoxylin and eosin staining.
Based on the histopathological diagnosis, lesions were grouped as follows: melanocytic naevi and melanomas.
Melanocytic naevi were also divided into further sub-categories, as follows: dysplastic melanocytic naevi (DMN) with
three degrees of dysplasia (mild, moderate, severe) common melanocytic naevi (CMN). Melanomas were divided into
in situ melanomas and invasive melanomas.
We compared the dermatoscopic images from first visit with the ones from the visit that indicated lesions
excision in order to detect the dermatoscopic change by using the following variables:
1. Size modification – absent, symmetrical or asymmetrical size growth.
2. Pigmentary/colour modification:
• Accentuated pigment or colour – absent, symmetrical, new eccentric pigmentation.
• Depigmentation – absent, asymmetrical, new light-brown areas.
3. New dermatoscopic structures:
• Grey-blue areas– absent, structure-free areas, grey-blue network, grey-blue dots/globules.
• White-coloured structures– absent or present.
• Red-coloured structures – absent or present.
• Brown or black dots/globules – absent, peripheral, central, peripheral and central.
4. Pigmented network modifications (absent, atypical pigmented network) or new irregular
pseudopods/extensions.
Dermatoscopic modifications that appeared in melanocytic naevi were compared to those in the melanomas
to detect changes that indicate suspicion of malign lesion.

Results
After resection, the histopathological examination confirmed the following: 50 (58.1%) atypical melanocytic
naevi, 4 (4.7%) in situ melanomas, 2 (2.3%) invasive melanomas and 30 (34.9%) common melanocytic naevi (figure
3.4).
Comparative evaluation of the melanocytic naevi and melanomas modifications throughout
dermatoscopic surveillance

In the first part of the study we analysed the differences in the percentages of the various dermatoscopic
elements between the patient group with histopathologically diagnosed melanoma (batch M) and the one with
melanocytic naevi diagnosis (batch MN). We have noted statistically significant differences between the two batches
as far as the following are concerned: asymmetrical growth, new light-brown areas, new grey-blue structure-free
areas, grey-blue network and irregular pseudopods/extensions. These modifications were predominantly observed
in batch M.

Table 1. The validity of different dermatoscopic modifications in distinguishing the melanoma from the melanocytic naevus
Precision Specificity Positive Negative
% % predictive predictive
value % value
%
Asymmetrical growth 50.00 90.00 27.27 96
Light-brown areas 83.3 63.76 14.71 98.08
Grey-blue structure-free areas 33.33 97.5 50 95.12
Grey-blue network 16.67 96.25 25 93.90
Pseudopods 33.3 95.00 33.3 95
 Loredana Ungureanu

Comparative evaluation of the atypical melanocytic naevi and common melanocytic naevi modifications
throughout dermatoscopic surveillance

In the second part of results analysis, we compared the differences in the percentages of various
dermatoscopic elements between the patient group with diagnosed atypical melanocytic naevi (batch AMN) and the
one with diagnosed common melanocytic naevi (batch CMN). The AMN group displayed more frequently and with
statistical significance, the following structures: light-brown areas, grey-blue dots/globules, irregular
pseudopods/extensions.

Comparative evaluation of the atypical melanocytic naevi and melanomas modifications throughout
dermatoscopic surveillance

In the third part of results analysis, we compared the differences in the percentages of various dermatoscopic
elements between the patient group with diagnosed atypical melanocytic naevi (batch AMN) and the one with
diagnosed melanomas (batch M). The M group displayed more frequently and with statistical significance, the
following structures: light-brown areas, structure-free grey-blue areas, grey-blue network, whereas the AMN batch
reported grey-blue dots/globules more frequently.
Conclusions
The present study enables the identification of certain modifications which can point to the melanoma
diagnosis with increased specificity – asymmetrical growth, new structure-free areas or grey-blue network, new
pseudopods or radial striae. Therefore, the presence of any of these changes may indicate melanoma suspicion and
lead to lesions resection.
The most sensitive dermatoscopic modification was represented by new structure-free light-brown areas.
Though with a lower degree of specificity, this change could be observed in the AMN cases. Its identification triggers
lesion resection, too.
Although the threshold of statistical significance has not been reached, we consider new irregular
dots/globules on a lesion identified as atypical on first visit and without previous sun exposure in patients over 40
an indication for resection too.
In spite of the fact that the study has not pointed to an individual, increasingly sensitive dermatoscopic
modification, which would enable the diagnosis of melanoma in all cases, it has underlined the very specific changes
that indicate the need for resection.
Though the ‘evolution’ criterion was included in the ABCDE algorithm of melanoma diagnosis, there are not
objective data to precisely indicate which changes are more typical or suggestive of malignity, especially in the case
of early, small-sized lesions. The present study has shown that, throughout atypical melanocytic lesions
dermatoscopic surveillance, AMN and melanomas have different evolutions. Therefore, dermatoscopic surveillance
is useful especially in the case of patients with multiple melanocytic lesions. The main advantages of this technique
are the early identification of malign lesions and a decrease in the number of useless resections.

Study 2. Preoperative evaluation of melanoma thickness through

dermatoscopy
The purpose of this study was to investigate whether there is a correlation between the frequency with which
various dermatoscopic structures appear by using the dermatoscopic pattern analysis and the histologic thickness of
the tumour using as borderline a Breslow index of 1 mm. The starting point of the study was the hypothesis that
there is a correspondence between the various dermatoscopic and histopathologic structures as the melanoma
evolves. A second objective was to demonstrate the correlation between the dermatoscopic structures and the
histopathological examination for lesions with a Breslow index less than 1 mm.
Material and method
This retrospective study was based on 100 consecutive melanomas which had been diagnosed and resected
within the Clinic of Dermatology Cluj between January 2006 and October 2012. Lesions that could not be included in
a single dermatoscopic field as well as those located at face or acral level were excluded due to their particular
dermatoscopic pattern.
From a clinical point of view, these lesions were grouped according to their clinical form (superficially
spreading melanomas and nodular melanomas) and according to their palpability (flat lesions, raised lesions or
nodular lesions).
Lesions were photographed using a Nikon Coolpix 4500 camera; in vivo dermatoscopic images were obtained
with a standard image enlargement of 10X using the Heine Delta 20 dermatoscope adapted to the Nikon camera,
after covering the lesion with an antiseptic substance (Mikrozid AF) to make the stratum corneum more translucent.
Photographic images were obtained in the same conditions, after removing hair from the lesion and the surrounding
skin area with a blade.
 Loredana Ungureanu

Removed lesions underwent histopathological examination by paraffin embedding, serial sectioning and
hematoxylin and eosin staining. Melanomas were grouped according to the Breslow index as follows: in situ, under 1
mm, between 1 and 2 mm and over 2 mm.
We looked for a correlation between the Breslow index and the age and sex of the patient, clinical aspect,
palpability as well as the melanoma-specific dermatoscopic criteria.
Dermatoscopic images were blindly analysed from the point of view of tumour thickness by two independent
evaluators in order to establish the presence of any of the following dermatoscopic structures:
• Atypical pigmented network
• Irregularly distributed brown/black dots
• Irregularly distributed brown/black globules
• Pseudopods
• Peripheral striae
• Structure-free grey-blue areas
• Grey-blue network
• Structure-free light-brown areas
• White scar-like areas
• Atypical vascular aspect.
The evaluated dermatoscopic structures were taken from current literature and considered relevant.
For 24 of the in situ lesions or lesions with a Breslow index less than 1 mm, serial sectioning was performed
on the identified dermatoscopic structures. Then, their histopathological correspondent was looked for. The focus
was on the following dermatoscopic structures: atypical pigmented network, radial striae, brown or black dots or
globules, grey-blue structures and irregular or polymorphic aspect.

Results
According to the histopathological examination, after calculating the Breslow index, 13% of the patients were
classified as having melanoma in situ, 17% with under 1 mm-thick melanoma, 31% with melanoma with thickness
between 1 and 2 mm and 39% with over 2 mm-thick melanoma. It was noted that the older the patient the higher the
Breslow index.
Dermatoscopic structures evaluation
We analysed the relationship between the various entities equated with the Breslow index on dermatoscopy
by grouping lesions into two categories: under 1 mm-thick lesions and over 1 mm-thick lesions (Table 2).

Table 2. Dermatoscopic structures according to the Breslow index

Variable Breslow index <1 Breslow index >1 mm P
mm
Age 42±14.9 50.9±13.3 0.004
Sex Male 9 30 0.3
Female 21 40
Clinical form NM(nodular) 0 28 <0.001
SSM(superficially 30 42
spreading)
Nodular 0 38
Palpability Raised 13 31 <0.001
Flat 17 1
Atypical pigmented network 25 (83.3%) 25 (35.7%) <0.001
Irregularly distributed brown/black 13 (43.3%) 28 (40.0%) 0.9
dots
Irregularly distributed brown/black 18 (60.0%) 42 (60.0%) 1
globules
Pseudopods 2 (6.6%) 10 (14.0%) 0.4
Peripheral striae 14 (46.6%) 30 (42.5%) 0.8
Grey-blue areas 13 (43.3%) 67 (95.7%) <0.001
Grey-blue network 18 (60%) 16 (22.8%) 0.001
Light-brown areas 16 (53.3%) 5 (7.1%) <0.001
Atypical vascular aspect. 4 (13.3%) 49 (70%) <0.001
White scar-like areas 4 (13.3%) 34 (48.5%) 0.002

Conclusions
The present study demonstrates that certain dermatoscopic structures present a statistically significant
association with the thickness of the melanoma. Therefore, dermatoscopy can play an important role in the
preoperative assessment of tumour thickness, improving the way in which the diagnosis and therapeutic strategy is
planned. However, the diagnosis efficiency is not 100%, further research, especially prospective studies are needed.
 Loredana Ungureanu

According to the present study, thin melanomas present atypical pigmented network, grey-blue network and
light-brown areas, whereas thick melanomas are associated with white scar-like areas, atypical vascular pattern and
structure-free grey-blue areas. These dermatoscopic structures have a clear histopathological correspondent and
their distribution follows the pattern of melanoma progression.

Study 3. Molecular changes in melanocytic lesions

Acquired melanocytic naevi represent independent risk factors for skin melanoma, the total number of melanocytic
naevi being the most important independent risk factor for melanoma as the likelihood of melanoma grows hand-in-hand
with the number of melanocytic naevi54. Dysplastic melanocytic naevi are an additional, independent melanoma risk
factor. However, the exact role which the MN plays in the development of melanoma has not been established yet. It has
been suggested that CMN (common MN), DMN (dysplastic MN), and melanoma are distinct development stages of
melanocytic lesions, though there is no evidence to suggest that the progression necessarily follows these steps. Moreover,
there is proof that melanoma appears more frequently de novo, and only rarely develops on pre-existing lesions, either
CMN or DMN. More than this, most of the MNs are stable in time. On the other hand, MN which are benign tumours
originating from the same type of cells as melanomas can provide insights on the latter’s pathogenesis and progression.
Within this context, this study has compared the expression of genes that proved to play a role in carcinogenesis in
melanoma, DMN, CMN and normal skin.

Material and method

Biological samples
In order to perform the genetic expression analysis, we sampled 13 melanomas, 11 atypical naevi and 14 common
naevi as well as 10 normal skin tissue instances as control batch. All samples were obtained within the Clinic of
Dermatology Cluj, once the patient’s informed consent was given. Tissue samples were immediately frozen and stored in
liquid nitrogen at -80oC. Routine histopathological diagnosis was performed for all samples, and the study fragments were
sampled from even, dermatoscopically homogenous areas. Small-size lesions were excluded as their histopathological
diagnosis had been influenced by research sampling.
The following genes were selected for analysis: CYR61, GDF15, NDRG1, KRT18, CLU, BCL2 and ITGAV based on the
main molecular mechanisms in which they are involved: cell proliferation and progression (KRT18, NDRG1), apoptosis
(BCL2, CLU), primary angiogenesis (CYR61 and GDF15) and cell adherence (ITGAV). The normalization of the selected
gene expression was performed against housekeeping gene 18S.

Quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR)

Quantitative real time polymerase chain reaction is a technique that can precisely quantify the transcriptional
abundance of selected genes following functional genome analysis. It is real time as it detects PCR products as they
accumulate. Though seen as a quantitative analysis, qRT-PCR is not absolute as it cannot exactly establish the
number of gene copies (mARN transcripts) no matter the tissue type or the precision of the measurements.
Gene expression changes (fold change – FC) were calculated through the ΔCp method, were the Cp values had
been previously normalised to the housekeeping gene values (18S). The average value of gene expression at skin
level (normal skin) was considered as reference against which the gene expression at the level of common naevi,
atypical naevi and melanomas was determined.
To increase the understanding of gene up- or down- regulation in the target group vs the control group, the FR
(fold regulation) value was calculated. This is the FC value for improper fractions and is equal to -1/FC for proper
fractions and it shows how much the expression level increases or decreases in the target batch as compared to the
control batch.

Results
KRT18
KRT18 proved to be down-regulated in the common naevi (FR=-11.11) and melanoma (FR=-2.44) as compared to
normal tissue and slightly up-regulated in the atypical naevi (FR=1.42). The statistical analysis demonstrated significant
differences between the following compared groups: M vs NT (p=0.038), AN vs CN (p=0.001) and CN vs NT (p<0.001).
BCL-2
BCL2 proved to be up-regulated in the melanoma (FR=1.58), and both the atypical naevus (FR=1.9) and the
common one (FR=2.91). Statistically significant differences were only noted between CN and NT (p=0.01). BCL2
presented a statistically significant up-regulation in the common naevus too, as compared to the melanoma
(p=0.042).
CLU
CLU was up-regulated in the melanoma (FR=-1.52) and the common naevus (FR=-1.96) as compared to
normal tissue as well as slightly down-regulated in the atypical naevus(FR=-1.27). Statically significant values were
only obtained between CN and NT (p=0.002).
CYR61
 Loredana Ungureanu

CYR61 was down-regulated in the melanoma (FR=-1.49) and the common naevus (FR= -3.85) as compared to
normal tissue and up-regulated in the atypical naevus (FR=1.67). Statically significant values were only obtained
between AN and CN (p<0.001).
GDF15
GDF15 was up-regulated in the melanoma (FR=17.09) and the atypical naevus (FR= 3.73) as compared to
normal tissue. Statically significant values were only obtained between M and CN (p=0.033), M and NT (p=0.033), as
well as AN and CN (p=0.02) and AN and NT (p=0.012).
ITGAV
Though ITGAV was slightly up-regulated in the common naevus as compared to normal tissue (FR=1.40), the
statistical analysis showed no differences between the study groups.

Conclusion
The statistical analysis showed differences between the study groups for all molecules assessed, except for
ITGAV.
KRT is expressed in the melanoma and could help in differentiating AN from CN.
BCL-2 places AN between CN and M, but does not enable a differential diagnosis between melanocytic lesions;
it cannot play a major role in the resistance to apoptosis.
CLU places AN between CN and M, but does not enable the differentiation of melanocytic lesions; it has an
important role in the resistance to apoptosis of the melanoma and can be a therapeutic target.
CYR61 –role in the tumour suppression in early lesions, as response to stress and an overcoming of this
function associated with down-regulation in invasive lesions; role in differentiating AN from CN.
GDF15 is a progression marker in melanoma, as well as a marker of differentiation between MN and M or
between CN and AN.
ITGAV is a progression marker as well as a marker of unfavourable prognosis as it is associated with invasion
and metastasis.

Originality and contributions

This thesis has assessed the melanoma and lesions with melanoma potential, from a dermatoscopic,
histological and molecular point of view, taking into account the fact that melanoma is not only the most serious
oncological problem in dermatology but it is also one of the most aggressive neoplasia in oncology. The only efficient
treatment that assures cure in the case of melanoma is resection in its early stage. Because of this, an early diagnosis
is of utmost importance. Dermatoscopy is a non-invasive technique which enables the diagnosis and the surveillance
of melanocytic lesions as well as the preoperative evaluation of the histological thickness of the tumour.
The study of the dermatoscopic modifications has underlined the very melanoma-specific changes which
impose lesions excision. This is the first study of dermatoscopic surveillance in our country. Moreover, newly-
identified dermatoscopic structures have been assessed, structures that had not been investigated before.
The preoperative evaluation of the melanoma thickness is important in deciding upon the best therapeutic
strategy. The study of the tumour thickness dermatoscopic assessment showed significant correlations between
certain dermatoscopic structures and the Breslow index, considering 1mm-thickness as borderline value. Previous
studies used a 0.75 mm borderline, which is difficult to put into practice. Additionally, this study evaluated new and
less investigated dermatoscopic structures.
The study on genetic analysis breaks new grounds through its research on melanocytic tumour genes less
investigated or not investigated at all as well as through the technique employed. It identified genes with a potential
role in the diagnosis/prognosis of the melanoma, though its results have to be validated on larger batches and
practice.
Loredana Ungureanu