Anda di halaman 1dari 16

Investigasi Toksisitas Akut dan Kronis Tren dari Pestisida Menggunakan Uji Bioluminesens

Melalui Uji Organisme Vibrio fscheri

Abstrak

Uji toksisitas akut dan kronis yang tinggi menggunakan Vibrio fscheri digunakan untuk menilai
toksisitas berbagai fungisida, herbisida, dan neonicotinoid. . Penggunaan titik waktu di luar 30
menit tradisional dari tes akut menyoroti sensitivitas dan penerapan tes toksisitas kronis dan
menunjukkan bahwa untuk beberapa senyawa toksisitas diremehkan hanya menggunakan tes
akut. Perbandingan nilai-nilai EC50 yang diperoleh dari tes akut dan kronis memberikan
wawasan mengenai modus aksi toksisitas, baik secara langsung atau tidak langsung.
Menggunakan pendekatan hubungan struktur-aktivitas yang mirip dengan yang digunakan
dalam penilaian bahaya, hubungan antara toksisitas dan sifat fisikokimiawi utama pestisida
diselidiki dan tren diidentifikasi. Penelitian ini tidak hanya memberikan informasi baru
mengenai toksisitas akut dari beberapa pestisida tetapi juga merupakan salah satu studi
pertama untuk menyelidiki toksisitas kronis pestisida menggunakan organisme uji V. fscheri.
Temuan menunjukkan bahwa bioluminescence awal memiliki efek besar pada konsentrasi
efektif yang dihitung untuk senyawa target di kedua tes akut dan kronis, menyediakan cara
untuk meningkatkan dan menstandarisasi protokol uji. Selain itu, temuan menekankan
perlunya penyelidikan tambahan mengenai hubungan antara sifat fisikokimia racun dan cara
kerja organisme nontarget.

Pendahuluan

Senyawa xenobiotik yang tak terhitung jumlahnya, termasuk pestisida, obat-obatan, dan produk
perawatan pribadi, antara lain, terus diperkenalkan ke lingkungan dan telah terdeteksi pada konsentrasi
hingga tingkat μg / L. Kehadiran pestisida dalam lingkungan akuatik adalah salah satu tantangan utama
untuk pelestarian dan keberlanjutan lingkungan sebagai akibat dari volume besar yang digunakan setiap
tahun, aktivitas biologis yang melekat, dan sifat residu pestisida dan metabolitnya yang persisten
(Stamatis). et al. 2010; Veljanoska-Sarafloska dkk. 2013). Meskipun senyawa ini pada awalnya dirancang
untuk bertindak pada target tertentu, sejumlah besar bukti dalam literatur menunjukkan efek tidak
langsung pada organisme nontarget (Bonnet et al. 2007; Veljanoska-Sarafloska et al. 2013).

Dalam upaya untuk mengidentifikasi dan mengukur efek biologis pada organisme nontarget dari
pestisida dan xenobiotik lainnya, baterai bioassay in vitro dan in vivo digunakan. Karena setiap bioassay
sering dirancang untuk mengukur hanya satu titik akhir spesifik setelah waktu eksposur tertentu, yang
mengarah ke deskripsi statis dari satu mode aksi beracun sebagai fungsi konsentrasi (Froehner et al.
2002; Kokkali dan van Delft 2014), telah sangat didorong untuk menggunakan berbagai bioasai daripada
hanya satu untuk mendapatkan evaluasi yang lebih menyeluruh dari potensi dampak biologis (Blaschke
dkk. 2010; Froehner dkk. 2002; Kokkali dan van Delft 2014; Parvez dkk. 2006) . Meskipun penting untuk
mempertimbangkan penggunaan berbagai bioasai untuk penilaian bioaktivitas pestisida, itu sama
pentingnya untuk mempertimbangkan efek biologis pada waktu paparan yang berbeda baik jangka
pendek (akut) dan jangka panjang (kronis) untuk memahami racun mode tindakan serta meminimalkan
potensi untuk meremehkan toksisitas dengan memilih waktu pencahayaan yang terbatas.

Uji penghambatan bioluminescence akut menggunakan Vibrio fscheri sebagai organisme uji, yang
dikenal sebagai MicroTox®, adalah uji toksisitas yang banyak digunakan secara komersial yang
didistribusikan oleh Modern Waters. Meskipun tes ini telah dilaporkan sebagai yang paling sensitif
dibandingkan dengan bioassay berbasis bakteri lainnya (Kokkali dan van Delft 2014) dan digambarkan
sebagai cepat, mudah dilakukan, dan biaya-efisien (Froehner et al. 2000) masih ada kemunduran.
Kelemahan utama adalah relevansi ekotoksikologi terbatas dari titik akhir yang dipilih (Backhaus et al.
1997). Diperkirakan bahwa mengevaluasi toksisitas pada waktu inkubasi singkat (15 dan 30 menit) dapat
meremehkan toksisitas suatu senyawa, dalam kasus seperti ini dimana toksisitas terkait dengan
mekanisme biosintesis dan titik akhir toksisitas ditentukan sebelum sel memasuki fase biologis masing-
masing. (Backhaus et al. 1997; Blaschke et al. 2010; Froehner et al. 2000; 2002). Pengembangan
toksisitas selama waktu paparan masih jarang diselidiki, meskipun penelitian telah menyoroti
relevansinya untuk penilaian toksisitas (Backhaus et al. 1997; Blaschke et al. 2010; Deng et al. 2012;
Gellert 2000).

Bioaktifitas pestisida dan xenobiotik lainnya yang diperoleh dengan menggunakan bioassay sering diteliti
bersama dengan sifat fisikokimia, seperti konstanta disosiasi asam (pKa), log oktanol / air coefcient
(Kow), dan berat molekul. Keracunan dan hubungan struktur-aktivitas kuantitatif adalah pendekatan
yang umum digunakan dalam penilaian bahaya yang memprediksi toksisitas senyawa baru berdasarkan
deskriptor kimia ini (Lee dan Chen 2009). Dengan menggunakan pendekatan ini, tren toksisitas telah
ditemukan, termasuk peningkatan toksisitas dengan meningkatnya nilai log Kow dan pKa (Diaz et al.
2013; Lee dan Chen 2009; Majewsky dkk. 2014). Meskipun banyak penelitian telah menggunakan
pendekatan ini berdasarkan hasil yang diperoleh dari tes toksisitas akut, studi terbatas telah menyelidiki
kecenderungan toksisitas kronis dengan sifat fisikokimia menggunakan V. fscheri

Pengaruh pKa memiliki peran yang ditetapkan dalam penilaian ekotoksisitas di mana bentuk terionisasi
dan nonionisasi dari senyawa. dapat menimbulkan efek yang berbeda pada beberapa target, termasuk
protein (pembawa, enzim, dan reseptor), saluran ion, dan organel intraseluler (Diaz et al. 2013).
Pengaruh keadaan ionisasi senyawa terhadap toksisitas sering terkait dengan ketersediaan racun, di
mana ion beracun mungkin jauh lebih mudah larut atau mudah terserap di lingkungan pH yang berbeda
(Rozman et al. 2001). Status ionisasi senyawa juga dapat mengganggu mekanisme transportasi elektron
(Hollingworth 2001), komponen penting dalam produksi ATP, dan diperlukan untuk produksi
bioluminescence di V. fscheri (Dunn 2012).

Koefisien partisi oktanol / air (Kow) adalah karakteristik fisikokimia yang penting untuk penilaian
ekotoksisitas. Sifat kimia ini umumnya digunakan untuk mempelajari perilaku kimia senyawa organik,
terutama refecting kemampuan transfer senyawa antara fase air dan fase organik (Shi et al. 2012).
Bahan kimia dengan nilai Kow rendah s (<10) dapat dianggap relatif hidrofilik, menghasilkan kelarutan
air yang tinggi dan faktor pengayaan biologis dalam kehidupan akuatik.
Sebaliknya, bahan kimia yang memiliki nilai Kow tinggi (> 104) dianggap sangat hidrofobik (May et al.
2016). Sementara pKa dan log Kow senyawa lebih populer deskriptor dibandingkan dengan berat
molekul, parameter ini dapat memberikan wawasan untuk faktor terkait yang mempengaruhi toksisitas.
Faktor-faktor ini termasuk sifat sterik, elektrostatik, dan hidrofobik dari gugus fungsi yang ada pada
senyawa. Sebuah penelitian yang dilakukan oleh Shi et al. (2012) menunjukkan bahwa senyawa besar
memiliki pengaruh pada toksisitas P. phosphoreum, yang bertindak pada mekanisme reaksi transfer
elektron, mirip dengan V. fscheri.

Bahan dan Metode

Senyawa Diuji

Propikonazol (99% murni), atrazin (99% murni), 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) (97% murni), dan
seng sulfat dibeli dari Sigma-Aldrich. Tebuconazole (> 98% murni), climbazole (> 98% murni), dan
myclobutanil (> 97% murni) dibeli dari Abcam Biochemicals. Irgarol (> 98% murni), terbutryn (> 98%
murni), dicamba (> 98% murni), mecoprop (> 98% murni), diuron (> 98% murni), thiamethoxam (> 98%
murni), acetamiprid ( > 98% murni), dan thiacloprid (> 98% murni) dibeli dari Santa-Cruz Biotechnology.
Bahan kimia yang digunakan dalam media kultur dibeli dari Fisher Scientifc: natrium klorida, trypton,
ekstrak ragi; Sigma-Aldrich: kalium klorida dan magnesium klorida; dan Merck Chemicals: gliserol.

Pelarut pembawa yang digunakan untuk menyiapkan larutan stok pestisida adalah metanol kelas LC-MS
(MeOH) dan dimetil sulfoksida (DMSO) yang dibeli dari Fischer Scientifc dan Sigma-Aldrich, masing-
masing. Larutan stok propikonazol, myclobutanil, irgarol, terbutryn, dicamba, 2,4-D, dan mecoprop
disiapkan dalam MeOH pada konsentrasi 1000 mg / L. Larutan stok thiamethoxam, acetamiprid, dan
thiacloprid disiapkan di MeOH pada konsentrasi 10.000 mg / L. Larutan stok dari tebuconazole,
climbazole, atrazine, dan diuron disiapkan dalam 10% DMSO di MeOH (v / v) pada konsentrasi 5000 mg /
L.

Budidaya Organisme Uji

Prosedur untuk budidaya organisme uji telah dijelaskan dalam pekerjaan kami sebelumnya (Nasuhoglu
et al. 2016). Budidaya organisme uji dilakukan dengan cara yang sama untuk tes toksisitas akut dan
kronis. Singkatnya, bakteri luminescent freezeried (Vibrio fscheri, NRRL-B11177, ATCC 49387) direhidrasi
dalam 1 mL air laut medium lengkap (SWCM). 0,5 mL bakteri yang telah dihidrasi kemudian dipindahkan
ke 100 mL media air laut yang dilengkapi nutrisi (NSSWM) dan diinkubasi pada 22 ° C dan dikocok pada
150 rpm selama kurang lebih 24 jam (atau sampai fase pertumbuhan eksponensial tercapai
sebagaimana ditentukan oleh densitas optik pada 600 nm). Sampel sepuluh-mililiter dari kaldu cair yang
diinkubasi mengandung V. fscheri kemudian dipindahkan ke dalam tabung centrifuge polyurethane 15-
mL dan disentrifugasi pada 5000 rpm selama 5 menit. Supernatan kemudian tertuang, dan sisa pelet
bakteri disuspensikan dengan 1 mL gliserol 30% / NSSWM (v / v) dan ditempatkan dalam 1,5 mL
cyrovials untuk dibekukan di bawah nitrogen cair dan disimpan pada - 80 ° C sampai waktu
eksperimentasi.
Sebuah cyrovial yang mengandung kultur V. fscheri yang diawetkan dicairkan di atas es dan volume 250-
μL dari kultur ini dipindahkan ke 50 mL NSSWM segar dan diinkubasi pada 22 ° C pada 150 rpm selama
kurang lebih 10–12 jam (atau hingga densitas optik). dari 1–1,5 tercapai). Untuk menjaga budaya yang
sehat menunjukkan respon luminesensi yang stabil, pengenceran dilakukan setiap 12 jam menggunakan
rumus berikut:

Pendekatan ini digunakan untuk menstandarisasi kepadatan sel awal dalam NSSWM yang digunakan
untuk setiap uji toksisitas. Setiap 12 jam inkubasi, selain pengukuran OD, pengukuran luminescence juga
dilakukan dengan mentransfer 200 μL sampel ke dalam pelat polyster 96 berwarna hitam buram
Polarecrene dan diukur dengan detektor Beckman-Coulter DTX 800 Multimode untuk memastikan
bahwa bakteri berada di akhir fase eksponensial (LEPC).

Persiapan Pengenceran dan Uji Toksisitas Akut

Sekali kultur bakteri mencapai densitas optik 1–1,5, setelah kira-kira 12 jam inkubasi, serangkaian
pengenceran dilakukan untuk menyiapkan kultur sebelum terpapar kontaminan. Pengenceran ini
dilakukan untuk mencapai luminesensi yang optimal, 15.000–20.000 unit cahaya relatif (RLU), yang
menghasilkan nilai EC50 dari kontrol yang berada dalam rentang yang dilaporkan dalam literatur
menggunakan MicroTox komersial @. Hasil yang diperoleh untuk berbagai pendaran awal dibahas di
bagian hasil. Sepuluh mililiter budaya disentrifugasi pada 5000 rpm selama 3 menit, dan supernatan
dibuang. SWCM ditambahkan ke pelet bakteri yang tersisa sampai luminescence optimal tercapai.
Menggunakan pelat 96-well, pengenceran kontaminan dan kontrol dilakukan (Gbr. 1). Larutan stok
pestisida 200 μL (individu atau campuran) ditempatkan di A1 dengan baik di pelat pengenceran. Sumur
B1 mengandung 140 μL, dan sumur C1 hingga H1 mengandung 180 μl dari masing-masing pembawa
pelarut (MeOH atau 10% DMSO / MeOH). Volume 60 µL dari A1 ke B1 dan volume 20 µL dari A1 ke C1
dipindahkan.

Mulai dari B1, sumur bernomor genap diencerkan secara berurutan dengan faktor 10 dan demikian pula
jumlah bilangan ganjil yang diencerkan secara seri dengan faktor 10 dimulai dari C1. Akhirnya, 10 µL dari
masing-masing sumur di pelat pengenceran (untuk tebuconazole, climbazole, atrazine, dan diuron) dan
50 µL (untuk sisa 10 senyawa) dipindahkan ke sumur yang sesuai dalam pelat uji buram hitam (kolom 2–
4, 6 –8, 10–12). Teknik pengenceran yang sama dilakukan untuk kontrol positif, ZnSO4 (C1 pada Gambar.
1), di mana 10 μL dari setiap sumur dipindahkan ke pelat uji yang sesuai di kolom 1. Dari pelarut
pembawa masing-masing, 10 atau 50 µL dipindahkan ke semua sumur kolom 9 di pelat uji sebagai
kontrol pelarut (C2 pada Gambar. 1). Pelarut diizinkan untuk menguap sebelum penambahan budaya V.
fscheri. Setelah penguapan pelarut organik, 200 µL kultur bakteri ditambahkan ke masing-masing sumur
di pelat uji. Untuk mengukur penurunan luminesen alami selama durasi pengujian, 200 µL kultur bakteri
ditambahkan ke setiap sumur di kolom 5 (C3 pada Gambar 1). Setiap pelat uji terdiri dari tiga rangkap
tiga dari tiga sampel yang diencerkan secara serial dan tiga kontrol terpisah.
Persiapan Pengenceran dan Uji Toksisitas Kronis

Persiapan pengenceran dan metodologi untuk uji toksisitas kronis dijelaskan dalam Nasuhoglu et al.
(2016). Briefy, persiapan yang sama pengenceran dilakukan untuk tes toksisitas kronis seperti yang
dijelaskan untuk toksisitas akut. Setelah kultur bakteri mencapai densitas optik 1–1,5 setelah kira-kira 12
jam inkubasi, pengenceran dilakukan dengan menggunakan rumus berikut.

Langkah pengenceran ini digunakan untuk menstandarisasi kepadatan sel awal dan mendapatkan
respons pendaran awal yang konsisten sekitar 1000 RLU. Ini kepadatan sel awal dan respon luminesensi
dipilih untuk memastikan bahwa jumlah nutrisi yang disediakan cukup untuk mempertahankan budaya
bakteri yang sehat selama sekitar 24 jam. Pada kepadatan sel awal yang lebih tinggi (sesuai dengan
pendaran awal yang lebih tinggi), akan ada risiko bahwa kultur memburuk dari waktu ke waktu karena
kurangnya nutrisi, yang akan dirancukan dengan penurunan luminescence karena paparan kontaminan.
Pelat pengenceran dan pengujian dibuat sama dengan uji toksisitas akut dengan modifikasi minor.
Pengenceran sampel mengikuti prosedur yang sama; Namun, pengenceran dilakukan di piring daripada
vertikal untuk memaksimalkan rentang konsentrasi. Setiap lempeng terdiri dari pengenceran serial
rangkap tiga sampel dan dua kontrol negatif (pembawa pelarut dan kultur bakteri). Setelah penguapan
pelarut organik dan penambahan 200 µL kultur bakteri di setiap sumur, pelat ditutupi dengan flm
permeabel (membran penyegel Breath-Easy) untuk memungkinkan difusi oksigen dan memfasilitasi
respirasi aerobik bakteri. Luminescence di setiap sumur dicatat selama 20 jam setiap 15 menit (gemetar
selama 15 detik sebelum setiap pengukuran untuk mencegah pengendapan bakteri dan untuk
menghomogenisasi campuran di setiap lubang).
Analisis Data

Uji Toksisitas Akut Luminescence

sampel dan kontrol diukur pada dua titik akhir, 15 dan 30 menit, seperti yang direkomendasikan dalam
metode standar. Penghambatan persen luminescence ditentukan dengan menggunakan persamaan
berikut:

t adalah waktu pengukuran (15 atau 30 menit endpoint), Lc, t adalah nilai rata-rata luminescence dari
kontrol bakteri pada t min, Ls, t adalah diamati luminescence sampel pada setiap pengenceran pada t
menit, dan lluminescence adalah persentase penghambatan untuk setiap pengenceran pada titik akhir
titik yang diberikan. Merencanakan penghambatan luminesensi versus konsentrasi log dari sampel
menghasilkan kurva respon dosis dimana konsentrasi median efektif (EC50) dapat dihitung (Gbr. 2).
Untuk setiap sampel, kurva respons dosis dihasilkan pada dua titik akhir dan validitas masing-masing
pelat ditetapkan dengan mengukur EC50 dari kontrol positif, ZnSO4, diharapkan berada dalam kisaran
3–10 mg / L (Ghosh et al 1996)

Uji Toksisitas Kronis

Luminasi dari sampel dan kontrol dicatat setiap 15 menit selama 20 jam (Gambar 3a, b). Merencanakan
pendaran dari waktu ke waktu memberikan bukti hubungan dinamis antara tingkat luminescence dan
konsentrasi racun. Gambar 3a menunjukkan perubahan luminescence dengan berbagai konsentrasi
diuron dari waktu ke waktu. Seperti yang digambarkan pada Gambar. 3b, luminescence secara signifikan
menurun selama 5 jam pertama yang mewakili periode waktu dimana bakteri perlu mencapai kerapatan
sel kritis sebelum menunjukkan luminesensi (yaitu, quorum sensing). Sebagai hasil dari variabilitas tinggi
dalam kepadatan sel dan luminescence, titik data dalam rentang waktu ini tidak termasuk dalam analisis
data. Peningkatan luminescence antara 7 dan 15 jam mengikuti tren linier yang dapat digambarkan
sebagai penghambatan laju luminesensi, yang berubah untuk setiap konsentrasi racun. Karena
konsentrasi diuron menurun dari 75 menjadi 7,5 mg / L, penghambatan luminesensi dibandingkan
dengan kontrol pelarut menurun. Penghambatan laju luminesensi dapat dihitung menggunakan
persamaan berikut:

mc adalah penghambatan laju luminesensi awal yang dihitung dari kemiringan nilai luminesens rata-rata
dari kontrol pelarut, ms adalah laju awal luminesensi dihitung dari kemiringan pendaran yang diamati
dari sampel tertentu, dan Irate adalah penghambatan laju awal luminesensi. Merencanakan
penghambatan laju awal luminesensi di atas konsentrasi sampel akan menghasilkan kurva respons dosis
(Gambar 3c), di mana EC50 dapat diukur.

Untuk uji toksisitas akut dan kronis, konsentrasi efektif yang menunjukkan penghambatan 50% (EC50)
dihitung menggunakan respon dosis sigmoidal nonlinear menggunakan Origin Pro, OriginLab
Results dan Diskusi

Acute Toxicity Test

Untuk menyelidiki toksisitas senyawa yang dipilih untuk penelitian ini dan membandingkan nilai
toksisitas yang dilaporkan di seluruh literatur, serangkaian eksperimen validasi yang mengonfirmasi
sensitivitas metode throughput tinggi yang disesuaikan telah diselesaikan. Toksisitas ditentukan pada
dua titik akhir: 15 dan 30 menit. Seperti yang telah dibahas sebelumnya, kisaran luminesensi awal yang
optimal dari kultur bakteri dibentuk dengan menghitung EC50 dari ZnSO4 pada 15 menit endpoint
dengan berbagai luminesensi awal (Tabel 1).

The EC50 dari ZnSO4 dilaporkan dalam literatur untuk tes akut dalam kisaran 3-10 mg / L (Ghosh et al.
1996), yang diperoleh dengan rentang RLU awal spesifik 15.000-20.000 menggunakan metode
throughput yang tinggi. Kesepakatan nilai-nilai EC50 dari ZnSO4 pada kisaran luminesensi 15,000–20,000
RLU menunjukkan bahwa metode tersebut disesuaikan dengan 96-well plate works. Selain itu,
mengingat kesalahan standar yang lebih rendah yang diperoleh dalam kisaran bioluminescence awal,
semua tes toksisitas akut dilakukan dalam rentang optimal.

Metode toksisitas akut dilakukan untuk keempat belas senyawa. Setiap senyawa diuji dalam rangkap
tiga dan persen penghambatan ditentukan dengan normalisasi data ke kontrol bakteri di dalam setiap
lempeng. Kurva respons dosis dikonstruksi dengan memplot inhibisi persen versus konsentrasi log. Hasil
eksperimen yang diperoleh dari kurva respon dosis yang ditunjukkan pada Gambar. 4 diringkas dan
dibandingkan dengan beberapa toksisitas yang ada yang dilaporkan dalam literatur (Tabel 2). Kurva
respon dosis pada 15 menit untuk senyawa lain dan semua kurva yang diperoleh pada waktu paparan 30
menit dapat ditemukan dalam bahan tambahan.

Kurva respons dosis diperoleh untuk semua sampel kecuali untuk thiacloprid. Seperti yang diilustrasikan
pada Gambar 4, thiacloprid tidak menunjukkan efek toksik terhadap bakteri dalam rentang konsentrasi
yang dipilih dan tidak mungkin untuk menghasilkan respon dosis sigmoid. Berbeda dengan acetamiprid,
serupa dalam struktur kimia dan juga neonicotinoid piridin berbasis, EC50 ditentukan menjadi 23,0 dan
27,6 mg / L pada 15 dan 30 menit, masing-masing. Kurva respons dosis untuk atrazin menunjukkan
bahwa EC50 berada pada konsentrasi yang lebih tinggi daripada yang diselidiki dalam rentang
pengenceran. Selanjutnya, EC20 memberikan penilaian toksisitas yang lebih akurat, dan sebagai
tambahan, EC20 sesuai dengan nilai yang ditemukan dalam literatur (referensi yang diberikan pada
Tabel 2).
Secara umum, tidak ada perbedaan yang signifikan yang ditemukan antara nilai-nilai EC50 yang
diperoleh pada dua titik akhir: 15 dan 30 menit. Propikonazol, Irgarol, dan dicamba memiliki perbedaan
yang paling mencolok antara dua titik waktu. Membandingkan toksisitas senyawa individu dalam setiap
kelas, herbisida ditemukan menjadi kurang beracun dibandingkan dengan fungisida dan neonicotinoids.
Kecenderungan ini kemungkinan besar karena mode aksi dari senyawa ini. Fungisida telah dilaporkan
menyebabkan efek tidak langsung pada spesies bakteri yang berbeda, termasuk respirasi, metabolisme,
dan menonaktifkan protein dan enzim (Yang et al. 2011), yang ini adalah mekanisme pendorong utama
untuk bioluminescence (Dunn 2012). Senyawa neonicotinoid menunjukkan toksisitas yang relatif tinggi
(kecuali untuk thiacloprid), yang menarik mengingat fakta bahwa kelas senyawa ini sangat selektif dalam
modus tindakan mereka di situs reseptor dalam sistem saraf invertebrata (Simon-Delso et al. 2015) .
Penjelasan yang mungkin untuk toksisitas acetamiprid dan thiamethoxam terkait dengan dampak
teridentifikasi dari acetamiprid pada aktivitas ATPase di mana neonicotinoid ini menyebabkan stres
oksidatif (Yao et al. 2006).
Ketika menyelidiki toksisitas senyawa yang dipilih di seluruh literatur, ada tren penting yang
menunjukkan kebutuhan untuk penilaian toksisitas komprehensif lebih lanjut. Toksisitas untuk sebagian
besar senyawa yang ditunjukkan dalam penelitian ini tidak secara signifikan berubah di antara titik akhir;
Namun, propikonazol, irgarol, dan dicamba memiliki penurunan nilai EC50 yang signifikan pada 30 menit
timepoint. Perbedaan nilai EC50 untuk dua titik waktu (15 dan 30 menit) dari propikonazol, irgarol, dan
dicamba adalah 21,41, 29,86, dan 20,37 mg / L, masing-masing. Tanpa mempertimbangkan dan
melaporkan konsentrasi efektif pada 30 menit, toksisitas untuk senyawa yang mirip dengan
propikonazol, irgarol, dan dicamba mungkin diremehkan. Kecenderungan lain yang menonjol di seluruh
studi yang dilaporkan melakukan uji toksisitas akut dengan V. fscheri adalah berbagai konsentrasi efektif
untuk senyawa tertentu. Diuron, misalnya, memiliki nilai EC50 pada 30 menit berkisar antara 9,2 dan
58,07 mg / L (Bonnet dkk. 2007; Gatidou dkk. 2015; Oturan dkk. 2008), dan atrazine telah melaporkan
nilai EC50 pada 15 menit mulai dari 39 hingga 150 mg / L (Gaggi et al. 1995; Polo dkk. 2011). Penjelasan
yang mungkin mungkin variasi dari bioluminescence awal yang digunakan untuk melakukan pengujian.
Seperti yang ditunjukkan untuk kontrol ZnSO4 pada Tabel 1, bioluminescence awal memiliki efek besar
dalam menghitung konsentrasi efektif.
Uji Toksisitas Kronis

Dari ketiga metode pengolahan data yang diusulkan dalam Nasuhoglu et al. (2016), penghambatan laju
luminesensi awal. direkomendasikan sebagai metode penilaian untuk mengukur toksisitas kronis
senyawa yang dipilih untuk penelitian ini. Metode penilaian ini dipilih, karena memiliki manfaat
menyediakan analisis toksisitas tergantung waktu sampel secara ekonomi dan tepat waktu, memberikan
nilai EC50 global daripada titik waktu tertentu. Kurva respons dosis (tidak ditampilkan) dikonstruksi
untuk semua senyawa yang diteliti kecuali untuk dicamba, 2,4-D, dan thiamethoxam yang tidak ada
toksisitas efektif yang diamati dalam rentang konsentrasi yang diteliti (dicamba dan 2,4-D: 1,25 × 102
untuk 3,75 × 10-4 mg / L, thiamethoxam: 1,25 × 103-3,75 × 10-3 mg / L). Nilai EC50 yang dihitung
dilaporkan dalam Tabel 3. Meskipun telah ada penelitian terdahulu yang menyelidiki toksisitas akut
untuk beberapa senyawa yang dipilih dalam penelitian ini (Tabel 2), tidak ada tes toksisitas kronis yang
dilaporkan untuk salah satu senyawa target menggunakan V. fscheri. Pentingnya pengujian toksisitas
kronis disorot oleh Backhaus et al. (1997), di mana ditemukan bahwa senyawa dengan modus tindakan
tidak langsung mengerahkan efeknya setelah waktu inkubasi singkat dan mengabaikan titik akhir setelah
waktu pemaparan lebih lama mungkin meremehkan toksisitas. Mode tidak langsung dari tindakan
termasuk mengganggu membran sel, menyebabkan kerusakan struktural dan / atau gangguan status
energi, yang semuanya terkait dengan produksi luminescence.

Perbandingan hasil yang diperoleh dari dua tes toksisitas throughput yang tinggi dan nilai EC50 yang
dilaporkan menyoroti pentingnya mempertimbangkan poin waktu di luar 15 menit dan 30 menit
toksisitas akut. Propikonazol, atrazin, irgarol, mecoprop, dan diuron memiliki nilai EC50 yang secara
signifikan lebih rendah berdasarkan pada uji toksisitas kronis. Atrazin memiliki perbedaan terbesar EC50
antara dua tes toksisitas (EC50, kronis = 9,96 mg / L, EC50, akut pada 30 menit = 262,64 mg / L),
sedangkan propikonazol, irgarol, mecoprop, dan diuron memiliki nilai EC50 dua atau lebih kali lebih
rendah dari nilai yang diperoleh dengan menggunakan uji toksisitas akut. Climbazole, thiacloprid,
myclobutanil, dan terbutryn memiliki nilai EC50 yang sama untuk kedua tes toksisitas, tetapi climbazole
dan thiacloprid memiliki nilai yang lebih rendah dalam tes kronis sementara myclobutanil dan terbutryn
memiliki nilai lebih rendah dalam tes akut. Tebuconazole adalah satu-satunya senyawa yang memiliki
nilai EC50 lebih tinggi yang diperoleh dalam tes toksisitas kronis. Empat senyawa yang tersisa (dicamba,
2,4-D, thiacloprid, dan thiamethoxam) tidak memiliki toksisitas yang efektif yang diamati dalam uji akut
atau kronis.

Seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Nasuhoglu et al. (2016), jika nilai EC50 akut ekuivalen atau
lebih kecil dari nilai yang diperoleh dalam tes kronis, senyawa dianggap menunjukkan modus tindakan
tidak langsung. Sebaliknya, jika EC50 kronis kurang dari nilai yang diperoleh dalam uji akut, maka
senyawa tersebut menunjukkan modus tindakan langsung. Berdasarkan hasil eksperimen yang disajikan
dalam penelitian ini, atrazin, propikonazol, climbazole, irgarol, mecoprop, diuron, dan thiacloprid dapat
dianggap menunjukkan modus aksi langsung menghambat jalur biosintesis V. fscheri. Senyawa-senyawa
yang tersisa, tebuconazole, myclobutanil, terbutryn, dicamba, 2,4-D, acetamiprid, dan thiamethoxam,
dapat dianggap memiliki mode aksi toksisitas tidak langsung terhadap V. fscheri. Cara kerja untuk
acetamiprid bervariasi tergantung pada nilai EC50 yang diperoleh dari metode toksisitas tingkat tinggi
dan dilaporkan dalam literatur. Hasil yang diperoleh untuk acetamiprid menggunakan metode high-
throughput secara signifikan lebih rendah daripada apa yang dilaporkan dalam literatur (Dell'Arciprete
et al. 2009); acetamiprid memiliki nilai EC50 pada 15 menit 129,0 dan 23,0 mg / L yang diperoleh oleh
Dell'Arciprete et al. (2009) dan studi ini, masing-masing. Dibandingkan dengan nilai EC50 yang diperoleh
dengan menggunakan uji toksisitas kronis, modus tindakan acetamiprid tidak langsung dan langsung
untuk nilai eksperimental dan dilaporkan, masing-masing. Penjelasan yang mungkin untuk perbedaan ini
dapat disebabkan oleh jenis pelarut pembawa yang digunakan untuk melakukan uji toksisitas akut.
Dalam penelitian ini, MeOH digunakan sebagai pelarut pembawa tetapi diuapkan sebelum mengekspos
bakteri ke senyawa target, meminimalkan dampak potensial pelarut organik terhadap V. fscheri.
Meskipun tidak jelas apa pelarut operator digunakan dalam penelitian yang dilakukan oleh
Dell'Arciprete et al. (2009), telah ditunjukkan bahwa DMSO (1,45-2,9%) menyebabkan respon
luminesensi tinggi hingga 40% menggunakan Vibrio harveyi (Mariscal et al. 2003). Jika pelarut pembawa
adalah DMSO dalam studi oleh Dell'Arciprete et al. (2009), ini dapat menghasilkan redaman
penghambatan luminescence yang disebabkan oleh acetamiprid yang mengarah ke toksisitas yang lebih
rendah (nilai EC50 yang lebih tinggi).

Tren toksisitas dengan hormat terhadap sifat kimia

Korelasi antara efek toksisitas senyawa dan sifat fisikokimia masing-masing merupakan pendekatan
penting dalam penilaian bahaya. Mengevaluasi tren toksisitas untuk eksperimen akut dan kronis penting
karena fakta bahwa beberapa bahan kimia menunjukkan tingkat toksisitas yang berbeda di bawah
kondisi jangka pendek dan panjang (May et al. 2016). Investigasi korelasi potensial antara toksisitas akut
dan kronis dan sifat-sifat kimia telah digunakan untuk organisme target lain, seperti spesies Daphnia dan
fsh, dan menggunakan sifat fisikokimia yang sama hubungan antara hasil toksisitas akut dan kronis
dipelajari. Gambar 5 menyajikan hubungan toksisitas (akut dan kronis) sehubungan dengan tiga sifat
fisikokimia, konstanta disosiasi asam (pKa), koefisien oktanol / air log (Kow), dan berat molekul. Sebagai
hasil dari kesamaan antara EC50 dari dua titik waktu yang diperoleh dengan menggunakan uji toksisitas
akut, nilai yang diperoleh pada waktu paparan 15 menit digunakan untuk menyelidiki tren toksisitas.
Dalam kasus di mana senyawa tidak menunjukkan efek yang diamati atau memiliki kesalahan signifikan
(thiacloprid dan atrazine), hasil yang dilaporkan dalam literatur digunakan sebagai gantinya. Diuron
telah dihapus dari analisis kecenderungan membandingkan pKa dengan hasil toksisitas akut dan kronis
karena karakteristik netral. Dari tiga sifat kimia yang diselidiki (pKa, log Kow, dan berat molekul), ada
perbedaan yang lebih besar dalam nilai pKa di antara senyawa, sehingga membuatnya lebih mudah
untuk membedakan tren untuk hasil toksisitas akut dan kronis. Perbandingan nilai pKa dengan hasil
toksisitas akut (Gambar. 5a) menunjukkan tren berbentuk V untuk herbisida. Senyawa dengan nilai pKa
rendah memiliki toksisitas lebih rendah sampai titik (pKa sekitar 1) ketika senyawa dengan nilai pKa yang
lebih tinggi memiliki toksisitas yang lebih rendah. Fungisida menunjukkan kecenderungan senyawa yang
sama dengan pKa rendah memiliki nilai toksisitas yang lebih rendah, sementara tidak ada
kecenderungan diamati untuk neonicotinoids. Penurunan toksisitas sehubungan dengan senyawa yang
memiliki pKa rendah juga diamati untuk uji toksisitas kronis (Gambar. 5b), dengan pengecualian atrazin
dan tebukonazol. Penurunan toksisitas dengan penurunan nilai pKa adalah tren yang dilaporkan
sebelumnya saat menyelidiki aktivitas antibakteri dari produk transformasi sulfamethoxazole
menggunakan V. fscheri (Majewsky et al. 2014).

Satu-satunya kecenderungan untuk properti kimia log Kow dalam kaitannya dengan nilai-nilai EC50
diamati untuk uji toksisitas akut di mana ada pola berbentuk V secara keseluruhan untuk fungisida dan
herbisida, mirip dengan apa yang dijelaskan untuk perbandingan pKa (Gambar. 5c) . Tidak ada log Kow
tren diamati untuk senyawa neonicotinoid dalam tes akut atau kronis. Meskipun tidak ada tren
defended diamati untuk uji toksisitas kronis, itu dihipotesiskan bahwa zat dengan nilai log Kow tinggi
diharapkan memiliki toksisitas yang lebih tinggi pada paparan kronis, karena karakteristik fisikokimia ini
terkait dengan potensi bioakumulasi (Lee dan Chen 2009; Mei et al. 2016). Perbandingan berat molekul
senyawa dengan memperhatikan nilai EC50 mereka untuk uji toksisitas akut dan kronis menunjukkan
tidak ada tren yang menonjol; however, Fig. 5e highlighted the distribution of compounds according to
their mode of action. Secara umum, senyawa yang memiliki nilai EC50 lebih rendah memiliki mode aksi
tidak langsung. Hasil dari tiga deskriptor (log Kow, pKa, dan berat molekul) menunjukkan bahwa tidak
ada satupun dari sifat-sifat ini saja yang mampu menggambarkan toksisitas pestisida yang diinvestigasi
dalam penelitian ini, pengamatan serupa untuk asam benzoat menggunakan Pseudokirchneriella
subcapitata (Lee dan Chen 2009). ). Kecenderungan yang diamati mengenai korelasi toksisitas akut dan
kronis dengan sifat fisikokimia menunjukkan bahwa kedua log Kow dan pKa merupakan parameter
penting untuk dipertimbangkan sementara berat molekul kurang relevan. Tren yang disorot dalam
makalah ini adalah sesuai dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan perilaku yang sama dari
meningkatnya toksisitas dengan meningkatnya log Kow dan pKa, menunjukkan bahwa metode
throughput yang tinggi untuk toksisitas akut dan kronis menggunakan V. fscheri adalah alat skrining
yang berharga untuk CEC lain. Investigasi lebih lanjut diperlukan dengan menggunakan sejumlah besar
senyawa yang memiliki variasi luas pKa, log Kow, dan berat molekul, sehingga lebih mudah untuk
mengidentifikasi korelasi yang menonjol antara toksisitas dan sifat fisikokimia.
Kesimpulan

Selain mengidentifikasi toksisitas pestisida yang relatif baru, studi ini menyoroti kesenjangan data
penting yang mencegah penilaian risiko yang akurat terhadap organisme nontarget dari pestisida. Hasil
yang diperoleh dengan menggunakan metode toksisitas kronis mengungkapkan bahwa titik akhir
toksisitas akut konvensional untuk beberapa pestisida mungkin tidak memberikan perkiraan yang terlalu
rendah terhadap toksisitas. Selain itu, tes kronis memungkinkan penyelidikan risiko toksisitas yang lebih
mendalam terhadap V. fscheri dengan memperhatikan hubungan dinamis luminesensi dari waktu ke
waktu. Perbandingan hasil yang diperoleh dari dua tes toksisitas yang mengidentifikasi cara-cara
tindakan pestisida (langsung atau tidak langsung), dan dengan memplot data toksisitas di samping sifat
fisikokimia, itu menunjukkan bahwa paling sering pestisida dengan mode aksi tidak langsung memiliki
toksisitas yang lebih tinggi terhadap V. fscheri. Selain itu, korelasi toksisitas dengan sifat fisikokimia
diidentifikasi sehingga toksisitas meningkat dengan meningkatnya pKa dan log Kow. Berdasarkan hasil
yang disajikan dalam penelitian ini, penambahan toksisitas kronis pada tes toksisitas akut rutin
memberikan penilaian yang lebih komprehensif tentang risiko lingkungan dari pestisida dan KTK lainnya,
yang akan meminimalkan potensi untuk meremehkan toksisitas.

Selain mengidentifikasi toksisitas pestisida yang relatif baru, studi ini menyoroti kesenjangan data
penting yang mencegah penilaian risiko yang akurat terhadap organisme nontarget dari pestisida.
Hasil yang diperoleh dengan menggunakan metode toksisitas kronis mengungkapkan bahwa titik
akhir toksisitas akut konvensional untuk beberapa pestisida mungkin tidak memberikan perkiraan
yang terlalu rendah terhadap toksisitas. Selain itu, tes kronis memungkinkan penyelidikan risiko
toksisitas yang lebih mendalam terhadap V. fscheri dengan memperhatikan hubungan dinamis
luminesensi dari waktu ke waktu. Perbandingan hasil yang diperoleh dari dua tes toksisitas
mengidentifikasi mode tindakan pestisida (langsung atau tidak langsung), dan dengan memplot data
toksisitas di samping sifat fisikokimia,

ditunjukkan bahwa pestisida yang paling sering dengan mode aksi tidak langsung memiliki toksisitas
yang lebih tinggi terhadap V. fscheri. Selain itu, korelasi toksisitas dengan sifat fisikokimia
diidentifikasi sehingga toksisitas meningkat dengan meningkatnya pKa dan log Kow. Berdasarkan hasil
yang disajikan dalam penelitian ini, penambahan toksisitas kronis pada tes toksisitas akut rutin
memberikan penilaian yang lebih komprehensif terhadap risiko lingkungan dari pestisida dan KTK
lainnya, yang akan meminimalkan potensi untuk meremehkan toksisitas.