JURNAL 3

Natural Product Analysis over the last decades

Analisis Produk Alam selama beberapa dekade terakhir
Kemajuan dalam kimia produk alami erat kaitannya dengan inovasi dalam teknologi analitik.
Karakterisasi metabolit dalam campuran kompleks membutuhkan teknik canggih, yang harus
memberikan sensitivitas dan selektivitas yang baik serta informasi komponen struktural.

Jurnal ini menguraikan teknik kromatografi dan spektral di bidang produk alami. Meskipun
terjadi evolusi metode yang sangat cepat selama 50 tahun terakhir, pengenalan program
skrining throughput tinggi memerlukan metodologi yang lebih efisien dan sensitif yang
menghasilkan informasi on-line yang memadai untuk penentuan struktur metabolit.

Hingga abad kedua puluh, tanaman menjadi sumber dari sebagian besar obat-obatan,
pengamatan karakteristik struktural tanaman di bawah mikroskop adalah metode utama yang
digunakan untuk kontrol kualitas tanaman, namun sedikit yang mengarah pada analisis
kandungan kimia.

Karena pentingnya peranan produk alami pada individu menghasilkan efek farmakologis dan
aktivitas biologis dari organisme, maka dibutuhkan peningkatan metode analisis kualitatif
dan kuantitatif yang sesuai. Awalnya, tidak ada metode yang memadai untuk analisis
campuran yang sangat kompleks, misalnya pada ekstrak tumbuhan. Namun pada tahun 1950-
an, mulai terdapat terobosan dalam analisis produk alami yang dikenal metode pemisahan
kromatografi dan identifikasi spektroskopi dan teknik elusidasi struktur.

Strategi untuk analisis flavonoid dalam cairan biologis, minuman, tanaman dan makanan.
Singkatan: LLE, ekstraksi cair-cair; SE, ekstraksi pelarut; MSPD, matriks ekstraksi fase
padat; SPME, ekstraksi mikro fase padat; SPE, ekstraksi fase padat; GC, kromatografi gas;
LC, kromatografi cair; MS, spektrometri massa; MS / MS, tandem spektrometri massa; CE,
elektroforesis kapiler; KLT, kromatografi lapis tipis; FID, deteksi ionisasi nyala; ECD,
pendeteksian tangkapan elektron; Q, quadrupole; QqQ, triple quadrupole; TI, perangkap ion,
FLU, fluoresensi; NMR, resonansi magnetik nuklir; TOF, time-of-flight dan ED, deteksi
elektrokimia (dicetak ulang dengan izin dari ref.

Kromatografi telah dikembangkan dari alat yang belum sempurna, diperkenalkan pada awal
abad ke-20 untuk pemisahan pigmen ke dalam berbagai teknik yang mampu menangani
masalah analitik dan pemurnian yang paling kompleks dari produk alami. Perkembangan
pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga landmark penting: pengenalan pertama
kromatografi; kontribusi yang dimainkan oleh Martin pada 1950-an; dan pengenalan
peralatan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) yang tersedia secara komersial pada tahun
1970-an. Tswett memperkenalkan kolom kromatografi adsorpsi pada awal abad ke-20,
awalnya untuk pemisahan pigmen tumbuhan. Deskripsi cetak pertama dari metode ini datang
dengan kuliah pada tahun 1903 di theWarsaw Society of Natural Sciences berjudul "Pada
kategori baru fenomena adsorpsi dan aplikasi mereka untuk analisis biokimia". Ini adalah
titik awal kromatografi cair dan, dalam makalah yang diterbitkan pada tahun 1906, Tswett
mengambil subjek lebih jauh dengan gagasan kromatogram dan perkembangannya dengan
menggunakan eluen yang berbeda. Pada akhir 1930-an, kolom kromatografi adsorpsi
(sekarang dikenal sebagai kromatografi fase normal) telah menjadi teknik pemisahan yang
banyak digunakan untuk ekstrak tumbuhan dan produk alami.

Meskipun metode ini memberikan akses ke banyak senyawa, resolusi rendah dan kesulitan
dialami dengan sampel yang larut dalam air. Itu tidak sampai karya Martin dan rekan kerja
yang lebih lanjut dibuat dalam kromatografi produk alami, dengan penemuan kromatografi
partisi (kromatografi cair-cair, LLC). Martin dijelaskan kromatografi partisi, di mana fase
diam cair diimobilisasi pada dukungan yang solid, sebagai perkawinan antara kromatografi
berbasis adsorpsi Tswett dan ekstraksi pelarut arus. Dalam kertas 1941, kromatografi gas-cair
(GLC) juga diantisipasi: “fase gerak tidak perlu menjadi cairan tetapi mungkin uap. Oleh
karena itu, pemisahan yang sangat halus dari zat yang mudah menguap harus dimungkinkan
dalam kolom di mana gas permanen dibuat mengalir melalui gel yang diresapi dengan pelarut
yang tidak mudah menguap ”. Pengembangan kromatografi partisi menghasilkan Martin dan
Synge the 1952 Nobel Prize dalam bidang kimia.

Martin dan rekan kerja juga memperkenalkan kromatografi kertas menggunakan lembaran
kertas saring yang diresapi air atau cairan lainnya; ini menjadi teknik microanalytical
kromatografi pertama. Namun, tingkat migrasi lambat kromatografi kertas telah
mengakibatkan teknik ini dikalahkan oleh kromatografi lapis tipis (TLC), di mana aplikasi
lapisan tipis adsorben pada pelat kaca berasal dari Rusia. Akhirnya, GLC diperkenalkan pada
tahun 1952 dan menjadi tersedia secara luas pada 1960-an. Sangat cocok untuk senyawa kecil
yang mudah menguap. Deteksi universal yang sensitif diberikan oleh flame ionisation (FID).
GLC (atau GC) sangat ideal untuk analisis campuran kompleks seperti yang ditemukan dalam
minyak esensial. Dalam satu kali, dimungkinkan untuk memisahkan ratusan konstituen dan
mengidentifikasi perbandingan dengan basis data. Kuantifikasi dilakukan dengan
menggunakan FID atau GC-MS, meskipun banyak operator lebih memilih data FID untuk
data tanggapan total ion saat ini (TIC), karena faktor respons MS untuk analit yang berbeda
sering bervariasi.

Teknik kromatografi planar

TLC: Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah satu-satunya metode kromatografi yang hasilnya
berupa gambar. Selanjutnya, TLC adalah teknik tunggal di mana semua komponen sampel
termasuk dalam kromatogram. Sebaliknya, HPLC dan GC bersifat selektif dan tidak semua
senyawa dalam sampel termasuk dalam tampilan. Terobosan nyata dalam TLC datang
melalui karya Stahl, yang memperkenalkan penggunaan kalsium sulfat sebagai pengikat, dan
ketebalan lapisan standar dan pengembangan kromatografi. Teknik ini tidak hanya
memberikan hasil visual tetapi juga unggul dalam kesederhanaannya dan rendah biaya.
Analisis paralel sampel dimungkinkan, kapasitas sampel tinggi dan hasilnya diperoleh
dengan cepat. TLC bersifat fleksibel dan dimungkinkan deteksi ganda. Ini adalah metode
skrining yang ideal dalam analisis biologi dan kimia, memberikan identifikasi dan hasil
kualitatif, penentuan pemalsuan, bersama dengan penentuan kuantitatif dan semikuantitatif.
Dalam hubungannya dengan mikroorganisme dan agen biologis lainnya, bioautografi TLC
dapat digunakan untuk menyaring bioaktifitas. Kerugian TLC adalah kurangnya otomatisasi,
masalah reproduktifitas yang kadang terjadi dan kurangnya akurasi dalam kuantisasi. Namun
demikian, TLC akan tetap menjadi mikro-teknik kromatografi yang cepat dan sederhana.
Dalam HPTLC, lempengan-lempengan tersebut diawali dengan fase diam dengan ukuran
partikel rata-rata 5 μm. Piring memberikan pemisahan yang lebih baik dan reproduktifitas
dari plat TLC precoated biasa (ukuran partikel rata-rata 12 μm) dan mereka juga
memungkinkan deteksi lebih sensitif. Diperlukan jarak pengembangan yang lebih pendek.
Jumlah pelat teoritis dalam kisaran 5000, sedangkan untuk HPLC kisarannya adalah 6-10000.
Kekuatan pemisahan HPTLC masih lebih rendah daripada HPLC dan yang terakhir lebih
disukai untuk penentuan kuantitatif. Merck juga menawarkan pelat HPTLC dengan partikel
bulat, yang memberikan kromatografi lebih cepat dan daya pemisahan yang lebih baik.
Lapisan kedap air tersedia dari Merck dan untuk pelat RP-18, 100% air dapat digunakan
dengan pelat ini. Untuk ekstrak herbal, badan pengatur sering merekomendasikan
kromatografi sidik jari untuk tujuan identifikasi yang tepat. HPTLC sangat ideal dalam hal ini
dan contoh yang sangat baik dapat ditemukan dalam literatur. HPTLC juga cocok untuk
penyaringan awal ekstrak tanaman sebelum analisis HPLC.

Teknik kromatografi planar lainnya

Tak satu pun dari teknik planar lainnya memiliki dampak TLC. Dalam kromatografi lapisan
berlebih (OPLC), pelat kromatografi lapis tipis horizontal ditutupi oleh bantalan elastis.
Tekanan diterapkan pada bantalan sehingga pemisahan dilakukan pada pelat TLC dengan
tidak adanya fase uap. Pengembangan sampel cepat dan efisiensi tinggi dapat dicapai.
Automated multiple development (AMD) memungkinkan pemisahan gradient-driven dalam
TLC dan dapat menghasilkan pemisahan kompleks campuran yang luar biasa.

Teknik kromatografi kolom

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC): Hingga munculnya HPLC, sebagian besar
pemisahan produk alami dilakukan dengan kromatografi kolom terbuka, kertas atau lapis
tipis. Kromatografi kolom terbuka memakan waktu dan melelahkan, seringkali membutuhkan
sejumlah besar sampel. Dengan kromatografi kertas dan TLC, sampel yang sangat kecil dapat
dianalisis dan resolusi dan reproduktifitas ditingkatkan, namun kuantitasi masih tidak
memadai dan resolusi senyawa yang sama sulit, kromatografi gas memberikan resolusi yang
sangat baik tetapi pembatasan terhadap sampel yang mudah menguap (kurang dari 20% dari
senyawa organik dapat dipisahkan dengan kromatografi gas) berarti bahwa derivatisasi sering
diperlukan. Teknik yang diperlukan yang dapat memisahkan larut dalam air, secara termal
empedu, senyawa non-volatile dengan kecepatan, presisi dan resolusi tinggi. HPLC
memenuhi kriteria ini dan sekarang menjadi salah satu alat yang paling kuat dalam kimia
analitik, dengan kemampuan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan menghitung jumlah
senyawa yang ada dalam sampel yang dapat dilarutkan dalam cairan. Viskositas cairan lebih
tinggi daripada gas dengan faktor 100 - maka kebutuhan untuk tekanan dalam kolom dan
nama asli "kromatografi cair tekanan tinggi". Tapi "tekanan" digantikan oleh "kinerja"
sebagai partikel semakin kecil dan kolom menjadi lebih pendek.
HPLC analitis: Aplikasi HPLC ditemukan di ratusan area. Salah satu yang paling penting dari
ini adalah bidang kontrol kualitas dalam industri farmasi.

Dalam dekade terakhir, kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) telah menjadi salah satu
teknik yang paling sering digunakan untuk pemisahan produk alami dalam matriks biologis
kompleks seperti ekstrak tanaman mentah. Untuk tujuan kemotaksonomi, hubungan botani
antara spesies yang berbeda dapat ditunjukkan dengan perbandingan kromatografi komposisi
kimianya. Kromatogram, yang digunakan sebagai sidik jari, dibandingkan dengan sampel
otentik dan zat yang tidak diketahui untuk memungkinkan identifikasi obat dan / atau
mencari pemalsuan. HPLC adalah teknik yang paling cocok untuk pemisahan ekstrak mentah
yang efisien, seperti yang ditunjukkan oleh Sakakibara et al.yang mengklaim telah
menemukan metode yang mampu mengukur setiap polifenol dalam sayuran, buah dan teh.
Untuk tujuan ini mereka menggunakan kolom Capcell pak C18 UG120 (250 × 4,6 mm, S-5,
5 μm) dan elusi gradien dengan natrium fosfat (pH 3,3) dan 10% metanol, dan 70% metanol.
Metode ini memungkinkan penentuan aglikon secara terpisah dari glikosida. Informasi juga
dapat diperoleh tentang polifenol sederhana dengan adanya polifenol polisiklik yang lebih
kompleks. Penentuan kuantitatif dicapai untuk total 63 sampel makanan yang berbeda.

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) digunakan secara rutin dalam fitokimia untuk
"menguji" isolasi produk alami preparatif (optimalisasi kondisi eksperimental, pengecekan
fraksi yang berbeda sepanjang pemisahan) dan untuk mengontrol kemurnian akhir senyawa
yang diisolasi. Tingkat informasi struktural yang dapat diperoleh telah dibatasi oleh detektor
LC yang tersedia. Detektor berdasarkan UV, fluoresensi, indeks bias, hamburan cahaya atau
elektrokimia memberikan deteksi dan kepekaan yang baik tetapi tanpa kemungkinan
informasi rinci struktural. Pengenalan teknik ditulis dgn tanda penghubung seperti LC / UV
dengan deteksi array fotodioda (LC / UV-DAD) dan LC digabungkan dengan spektrometri
massa (LC / MS) telah memberikan kemajuan nyata dalam penentuan struktur metabolit on-
line.

Kromatografi cair ultra-tekanan tinggi (UHPLC):

Dalam ultra-performance liquid chromatography (UPLC), merek dagang sistem Acquity
Waters, diperkenalkan pada tahun 2004, ukuran partikel sekitar 1,7 μm digunakan, pada
tekanan 15000 psi (1000 bar). Aplikasi dalam pemisahan produk alami mulai muncul, seperti
dalam penyelidikan konstituen dari akar ginseng mentah dan dikukus, Panax notoginseng,
Araliaceae. UPLC dilakukan pada sistem Waters Acquity dengan kolom 100 × 2.1mm C18
1.7 μm dan gradien fase bergerak yang terdiri dari (A) 0,1% asam format dalam air dan (B)
asetonitril yang mengandung 0,1% asam format. Sistem UPLC terhubung ke spektrometer
massa akselerasi ortogonal TOF dan dibandingkan dengan analisis LC / UV klasik.
Identifikasi puncak dicapai dengan perbandingan dengan basis data internal yang
mengandung 96 jenis protopanaxadiol-ginsenosides. Kromatografi ultra-cepat menunjukkan
reproduktifitas yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan HPLC tradisional.
Elektroforesis kapiler (CE): Elektroforesis kapiler adalah teknik analitik yang memberikan
efisiensi pemisahan yang tinggi dan jangka waktu singkat. Beberapa mode CE tersedia: (1)
elektroforesis zona kapiler (CZE), (2) kromatografi elektrokinetik mikellar (MEKC), (3)
elektroforesis gel kapiler (CGE), (4) fokus isoelektrik kapiler, (5) isotachophoresis kapiler,
(6) elektrokromatografi kapiler (KTK) dan (7) CE tidak berair. Modus CE paling sederhana
dan paling serbaguna adalah CZE, di mana pemisahan didasarkan pada perbedaan rasio
muatan-ke-massa dan analit bermigrasi ke zona diskrit pada kecepatan yang berbeda. Anion
dan kation dipisahkan dalam CZE oleh migrasi elektroforetik dan aliran elektro-osmotik
(EOF), sementara spesies netral co-elute dengan EOF. Aplikasi CE untuk analisis produk
alami telah didokumentasikan. CE sangat cocok untuk pemisahan flavonoid karena mereka
bermuatan negatif pada nilai pH yang lebih tinggi [28].

Kromatografi lapis tipis, HPLC, GC dan elektroforesis kapiler (CE) adalah semua metode
yang berguna untuk sidik jari dan menganalisis obat tanaman. Sementara HPLC memiliki
presisi, kepekaan, dan reproduktifitas tinggi, ini membutuhkan pra-perlakuan sampel yang
lama untuk menghilangkan material padat yang tersisa dan menghilangkan kerugian adsorpsi
yang tidak dapat diubah pada matriks padat. Elektroforesis kapiler menjadi semakin dikenal
sebagai teknik pemisahan analitik yang cepat dan efisien tetapi reproduktifitas dan
selektivitas lebih rendah daripada HPLC.

Kromatografi arus balik: Teknik kromatografi arus balik (CCC) pada dasarnya melibatkan
pemisahan sampel antara dua fase cairan yang tidak dapat larut. Salah satu fase ini disimpan
stasioner dalam kolom digulung atau ruang oleh gaya sentrifugal, sedangkan fase lain (fase
gerak) dipompa dari satu ekstremitas kolom ke yang lain. Sebagai contoh dilewatkan melalui
sistem, ia memisah antara dua fase. Retensi solute hanya bergantung pada koefisien partisi:
adsorpsi dihalangi oleh tidak adanya fase padat. Instrumen dengan kolom melingkar berputar
sering dibangun sedemikian rupa sehingga mereka menghasilkan gerakan planet, disertai
dengan keseimbangan hidrodinamik antara dua fase pelarut. Ini membantu partisi sampel
antara dua fase. Dengan CCC, fase diam menempati 50-80% dari total volume, sedangkan di
HPLC, angka ini sekitar 5%. Ini menyiratkan bahwa kapasitas CCC lebih tinggi. Keuntungan
lain dari HPLC adalah bahwa lebih sedikit pelat teoritis diperlukan di CCC untuk mencapai
resolusi yang diberikan. Meskipun HPLC umumnya dianggap lebih cepat daripada CCC, ini
diimbangi dengan waktu yang diperlukan untuk membersihkan kolom HPLC dan kerusakan
cepat kolom HPLC, yang mengharuskan penggantian mahal.

Kromatografi arus balik adalah kemajuan lain dari abad ke-20. Ini pada dasarnya adalah
pengembangan dari distribusi arus berlawanan (CCD), sebuah metode yang dikembangkan
pada tahun 1940-an dan 1950-an untuk distribusi batchwise (distribusi Craig) atau kontinyu
(OʼKeefe) fraksinasi campuran. Kromatografi countercurrent modern menemukan asal-
usulnya dalam karya perintis oleh Y. Ito di NIH di Amerika Serikat [30].

Efisiensi yang dilaporkan dalam CCC skala analitik jelas menunjukkan bahwa metode ini
tidak akan bersaing dengan teknik HPLC analitis di mana-mana tetapi memiliki beberapa
kegunaan penting dalam pengembangan metode, dalam pemisahan skala mikro dan dalam
penyaringan untuk senyawa bioaktif baru dalam ekstrak mentah. Analytical HSCCC juga
merupakan metode yang menarik untuk berinteraksi dengan spektrometer massa karena laju
aliran berkurang.

Teknik spektroskopi

Ultraviolet (UV)
Elusidasi struktur oleh spektroskopi ultraviolet sangat penting karena ini adalah yang paling
sensitif dari semua teknik spektroskopi. Dan sejak pengenalan spektroskopi derivatif,
kepekaan telah meningkat lebih jauh, sehingga spektroskopi UV sempurna untuk analisis
jejak.

Inframerah (IR)
Spektroskopi fourrier-transforminfrared (FT ‑ IR) memiliki sensitivitas yang jauh lebih besar
daripada IR klasik dan memungkinkan pengukuran yang jauh lebih cepat. Dengan scan
lengkap yang tersedia dalam 0,1 hingga 1 detik, dimungkinkan untuk menggabungkan FT-IR
dengan GC (bahkan kolom kapiler). Dalam kombinasi dengan databanks spektral, metode ini
sangat kuat untuk identifikasi tidak diketahui dalam campuran.

Spektrometri Massa (MS)

Di bidang ini, perkembangannya luar biasa banyak. Dimulai dengan spektrum dampak
elektron (EI), seluruh rangkaian teknik ionisasi telah dikembangkan, dimulai dengan ionisasi
kimia (CI) dan melewati bidang desorpsi (FD), pengeboman atom cepat (FAB) dan
termospray (TSP), ke atmosfer tekanan ionisasi (API) teknik electrospray ionisation (ESI)
dan ionisasi kimia tekanan atmosfer (APCI). Dalam teknik laser desorpsi / ionisasi (MALDI)
matriks-dibantu, ion sampel biasanya dianalisis oleh penganalisis massa waktu-of-flight
(TOF). MALDI ‑ TOF ‑ MS memiliki kelebihan dibandingkan metode lain, termasuk
kecepatan analisis yang tinggi, sensitivitas yang baik (dengan kemampuan untuk menentukan
massa dengan akurasi yang lebih baik dari 1 bagian per juta) dan toleransi yang baik terhadap
kontaminan.

Nuclear magnetic resonance (NMR)

Metode yang paling kuat untuk analisis struktural produk alami berasal dari pengamatan
resonansi magnetik nuklir (NMR) pada tahun 1945 oleh Felix Bloch di Stanford University
dan Edward Purcell di Harvard University. Seluruh rangkaian eksperimen korelasi 2D,
seperti COZY, HMBC, HSQC sekarang banyak digunakan dalam elusidasi struktur oleh
NMR. Kuantitatif NMR (qNMR) memiliki sejarah panjang, hampir sejak penemuan NMR.
qHNMR memiliki potensi besar dalam identifikasi, karakterisasi dan penemuan produk alami
bioaktif dan di bidang analisis metabolom.

Capillary NMR (CapNMR): Teknologi probe baru telah meningkatkan sensitivitas NMR.
Dengan probe kapiler (volume total 5 μL dan volume aktif 1,5 μL) dan lilitan koil RF ke
konfigurasi solenoid, shimming lebih mudah dan jumlah menit pelarut terdeuterasi
dikonsumsi. Dengan sampel 10 μg, 1D spektrum proton dapat diperoleh dalam 5 menit dan
gradien 2D spektra COZY NMR dalam 1,5 jam. Eksperimen HSQC dan HMQC diperoleh
pada 30 μg sampel dalam waktu 5 jam dan percobaan HMBC dengan 70 μg dalam 10 hingga
15 jam [36].

Teknik Hyphenated

Teknik hyphenated didefinisikan sebagai metode menggabungkan dua atau lebih teknik
analitik (biasanya pemisahan dan teknik spektroskopi) menjadi satu teknik terpadu. Yang
pertama digunakan adalah HPLC digabungkan dengan spektroskopi UV (LC-UV) dan GC
dikombinasikan dengan MS, yang akan diikuti kemudian oleh HPLC digabungkan dengan
MS. Namun, GC terbatas pada konstituen yang mudah menguap dan teknik ionisasi yang
digunakan dalam LC-MS umumnya hanya memberikan informasi tentang ion molekuler dan
fragmen-fragmen dasar. Hanya NMR, dengan berbagai eksperimen yang dimasukkan, yang
paling jauh menuju penentuan struktur dan, dengan demikian dengan HPLC, menjadi
kombinasi yang sangat baik.

LC ‑ UV
Sebuah detektor photodiode array (PDA) yang dikendalikan komputer untuk kromatografi
cair dilaporkan pada tahun 1976 [38] tetapi butuh beberapa tahun sampai detektor array
fotodioda komersial pertama menjadi tersedia pada awal tahun 1980. Hal ini memungkinkan
berjalannya pemisahan kromatografi dengan deteksi simultan pada panjang gelombang yang
berbeda.Potensi PDA dalam bidang analisis produk alami dengan cepat dikenali.Model awal
yang terkenal termasuk identifikasi senyawa fenolik oleh penggunaan bersamaan dari on-line
UV-vis. Namun, informasi struktural yang disediakan oleh spektrum elektronik sangat
terbatas.

LC ‑ MS
HPLC digabungkan dengan spektrometri massa adalah teknik analisis yang memiliki dampak
paling besar dari semua metode penggabungan. Karena ketidaksesuaian yang melekat pada
fase gerak cair dan penganalisis massa vakum tinggi, LC-MS awalnya dieksploitasi oleh
sangat sedikit kelompok. Dalam LC ‑ MS, ada tiga masalah umum: jumlah eluen kolom yang
harus dimasukkan dalam sistem vakum MS, komposisi eluen dan jenis senyawa yang akan
dianalisis. Banyak antarmuka telah dikembangkan untuk mengatasi faktor-faktor ini.
Antarmuka harus menyelesaikan nebulisasi dan vaporisasi cairan, ionisasi sampel,
penghilangan uap pelarut berlebih dan ekstraksi ion ke dalam analisa massa. Sampai saat ini,
tidak ada antarmuka universal yang telah dibangun; setiap antarmuka memiliki karakteristik
yang sangat bergantung pada sifat dari senyawa yang digunakan. Namun, dengan pengenalan
ionisasi tekanan atmosfer (API), ion dapat dihasilkan di luar bagian vakum tinggi dari
spektrometer massa. Antarmuka ionisation kimia tekanan atmosfer (APCI) pertama kali
dilaporkan pada tahun 1983, segera diikuti oleh antarmuka electrospray pada tahun 1985.
Potensi API-MS untuk dereplikasi produk alami telah dipelajari secara ekstensif. Hari ini, LC
‑ MS adalah alat rutin yang kuat di banyak laboratorium produk alami di seluruh dunia.

LC ‑ NMR
Spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) adalah teknik yang paling kuat dan
serbaguna untuk elusidasi struktur produk alami. Analisis struktur NMR yang komprehensif
dari senyawa individu dalam ekstrak telah menjadi layak pada skala HPLC. Teknik LC ‑
NMR diilustrasikan dengan baik oleh penentuan struktur dua nepthoyquinones meroterpenoid
isomer dari Cordia linnaei (Boraginaceae). Ini adalah fraksi yang diperoleh dari ekstrak
diklorometana dari akar tetapi tidak dapat dipisahkan oleh HPLC semi-preparatif. On-flow
LC-1H ‑ NMR dikombinasikan dengan eksperimen pulse selektif TOCSY dan eksperimen
COZY, memungkinkan atribusi sinyal pada C-21 hingga C-24 dalam rantai samping dan
karenanya diferensiasi dua isomer Volume-kecil (30–120 μL) flow-probe menawarkan
sensitivitas massa (rasio signal-to-noise per satuan massa) yang jauh lebih besar daripada
probe NMR tradisional. Menggunakan magnet 600 MHz, batas deteksi 1H senyawa dengan
MW 500 kira-kira 100 ng Aliran kontinu LC ‑ NMR: Eksperimen aliran kontinu (atau aliran)
adalah percobaan LC ‑ NMR pertama yang akan diperkenalkan. Kerugiannya adalah waktu
tinggal yang terbatas dari analit dalam sel-sel aliran NMR dan akibatnya jumlah analit yang
dapat dideteksi dibatasi hingga sekitar 10 ug. Aliran berhenti LC ‑ NMR: Dalam varian LC ‑
NMR, analit bunga ( diamati dalam kromatogram HPLC) disimpan dalam aliran-sel dengan
menghentikan pemompaan eluent. Semakin lama waktu tinggal di sel-aliran memungkinkan
lebih lama kali akuisisi dan akibatnya spektra 2D NMR dapat dijalankan.

LC ‑ SPE ‑ NMR
Dalam LC ‑ SPE ‑ NMR, puncak kromatografi yang dielusi dari kolom HPLC terbalik
dilewatkan satu per satu melalui solidphase kecil.
kolom ekstraksi (kartrid SPE) untuk menghapus analit dari fase gerak HPLC. Kartrid SPE
kemudian dikeringkan dengan gas nitrogen dan analitnya diserap dengan pelarut terdeuterasi
untuk spektroskopi NMR. LC ‑ SPE ‑ NMR adalah langkah terbaru dalam rangkaian panjang
pengembangan spektroskopi online berbasis LC. Pendahulunya menggunakan off-line LC-
NMR dapat ditemukan pada akhir 1980-an tetapi pendekatan awal ini penggunaan terbatas
karena sensitivitas rendah dari probe NMR saat ini. Konsep ini dihidupkan kembali dengan
munculnya sel-sel aliran NMR yang lebih baru dan sekarang probe aliran
cryogenicallycooled dan pengumpulan puncak dengan antarmuka SPE yang canggih
digunakan. Alternatif lain adalah menggunakan kombinasi off-line HPLC-SPE dengan
CapNMR untuk analisis campuran yang kompleks
seperti ekstrak produk alami, seperti yang dilaporkan untuk identifikasi cepat lakton
sesquiterpene dan fenilpropanoid esterifikasi dari Thapsia garganica (Apiaceae) buah.
HPLC ‑ CD
Produk alami sering mengandung stereocentres yang dapat dipelajari dengan metode
chiroptical seperti circular dichroism (CD). Stereoanalisis chiroptical dari senyawa individu
dalam ekstrak telah menjadi layak dengan pengenalan detektor LC-CD.

Teknik gabungan lainnya

Ini termasuk SFC ‑ NMR, kiral LC ‑ NMR, kromatografi pertukaran ion-NMR, CCC ‑
NMR, kromatografi permeasi gel-NMR.

Dereplikasi

Dalam mencari konstituen bioaktif dari tumbuhan atau dari sumber-sumber alam lainnya,
pendekatan hanya terdiri dari fraksi bioaktif dari fraksi mentah. Penemuan kembali senyawa
yang diketahui menimbulkan tantangan yang signifikan dalam penelitian produk alami dan
panggilan untuk strategi dereplication yaitu, cara menghindari isolasi yang memakan waktu
dari konstituen yang dikenal. Ini dapat dicapai dengan aplikasi teknik hyphernated seperti
LC‑MS atau LC‑UV dan LC‑NMR pada tahap pemisahan paling awal. Analisis ini untuk
mendeteksi senyawa dengan fitur struktural yang menarik dan untuk menargetkan isolasi
senyawa.

Bioanalisis

Terlepas dari kenyataan bahwa sejumlah besar obat dalam penggunaan klinis berasal dari
alam, sedikit yang diketahui tentang mekanisme kerja mereka
dan sifat farmakokinetiknya. Metode bioanalisis sesuai untuk mendeteksi produk alami dalam
matriks biologis, untuk karakterisasi struktural dan analisis kuantitatif dari metabolitnya
diperlukan. LC-MS adalah salah satu yang paling kuat untuk bioanalisis.

Bioassay sebagai Alat Analisis

Metode penyaringan biologis ini merupakan pelengkap penting untuk metode penyaringan
kimia yang disebutkan sebelumnya. Untuk mendapatkan hasil yang cepat dan dengan
pengeluaran minimum dalam hal biaya dan bahan, sederhana yang disebut “bioassays
benchtop” dapat digunakan. Sejumlah tertentu dari bioassay sederhana melibatkan
penggunaan kromatografi thinlayer karena ini adalah cara yang murah, dapat direproduksi
dan sederhana dengan cepat menyaring ekstrak dan fraksi tanaman.

Salah satu tes berbasis TLC pertama dikembangkan oleh Homans dan Fuchs pada tahun
1970. Ini berlaku untuk mikroorganisme yang dapat tumbuh langsung di piring TLC dan
menggunakan jamur penghasil spora Cladosporium cucumerinum. Pertumbuhan jamur dilihat
sebagai warna abu-abu di piring, sementara zona penghambatan berwarna putih. Tes
bioautografi TLC telah diperkenalkan ke ekstrak tanaman dan sampel lain untuk menghambat
aktivitas asetilkolinesterase dan untuk membantu dalam mencari obat anti-Alzheimer
potensial baru. Tes ini bergantung pada reaksi pembelahan acetylcholinesterase pada 1-
naphthyl acetate, untuk membentuk 1-naphthol, yang pada gilirannya bereaksi dengan Fast
Blue B Salt untuk memberikan pewarna diazonium berwarna ungu kecuali di daerah yang
mengandung inhibitor acetylcholinesterase yang muncul sebagai bintik-bintik putih, alkaloid
yang berasal dari tumbuhan galanthamine dan physostigmine digunakan sebagai senyawa
referensi. Untuk penyaringan cepat ekstrak tumbuhan, menggabungkan HPLC dengan
bioassay adalah mungkin. Contohnya adalah kopling HPLC dengan skrining DPPH untuk
menangkap radikal. Sampel dipisahkan atas kolom HPLC dan komponen terpisah yang
dideteksi oleh UV. Pada saat yang sama, bagian dari eluen dipisahkan dan bereaksi dengan
larutan DPPH. Penangkap radikal diamati sebagai puncak negatif pada 517 nm. Dengan
demikian mungkin untuk mengkorelasikan puncak dalam kromatogram dengan aktivitas dan
untuk mengukur aktivitas. Penggabungan bio-assays dengan HPLC ‑ SPE ‑ NMR
kemungkinan adalah hal menarik lainnya.