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Químico e Farmacêutico. Universidade de Brasília - UnB, Brasil. Aluno da Pós-Graduação em Farmácia e
Química Forense, Universidade Católica de Goiás/IFAR. E-mail: charlley.silva18@gmail.com.
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Biólogo. Doutor em Biologia Animal pela Universidade de Brasília – UnB. Professor do IFAR/PUC-GO.
Endereço: IFAR – Instituto de Estudos Farmacêuticos. SHCGN 716 Bl B Lj 05 Brasília – DF CEP: 70770-732.
E-mail: pqsilva@uol.com.br.
Resumo
Nas últimas décadas, a genética molecular propiciou um grande avanço na capacidade de identificação humana.
No início, esse conhecimento era tratado de modo difuso, trabalhoso e com baixa credibilidade no meio forense.
Então, nos anos 1990, houve um movimento governamental e científico para padronizar procedimentos nos
laboratórios forenses, de modo a unificar a linguagem de troca de informações genéticas e facilitar a
interpretação dos resultados. Foi com esse afã que os marcadores microssatélites (STR's) de DNA foram eleitos
e tornaram-se uma espécie de “moeda” comum de troca de perfis de DNA até os dias de hoje, devido aos
quesitos: segurança, automatização, pequeno conjunto de loci e alto poder de discriminação. Com essa
motivação, o presente trabalho descreve a importância dos STR's como o principal meio de identificação humana
como prova forenses de DNA nos exames de vínculo genético, particularmente de paternidade. A revisão traz
um histórico sobre o marcador; define e aponta os tipos de STR's e os usados na esfera cível e criminal; destaca a
técnica de PCR e os kits comercias; descreve as principais ferramentas estatísticas forenses; e relaciona as
legislações brasileira relativas ao exame de DNA nos testes de paternidade.
Palavras-chave: Kit. STR. PCR. Teste de Paternidade. Legislação de paternidade.
Abstract
In recent decades, molecular genetics has provided a major breakthrough in the ability of human identification.
At first, this knowledge was treated so pervasive, intensive, and low credibility in forensics. Then, in 1990 there
was a government and scientific movement to standardize procedures in forensic laboratories in order to unify
the language of exchange genetic information to facilitate interpretation of results. It was with such zeal that the
microsatellite (STR) DNA were elected and became a kind of "currency" common exchange of DNA profiles to
the present day, due to requirements: security, automation, small set of loci and high discrimination power. With
this motivation, the current work describes the importance of STR's as the primary means of human
identification as evidence in forensic DNA testing genetic relationships, particularly fatherhood. The review
brings the historical about marker, defines and indicates the types of STR's and what is used in civil and criminal
sphere, highlights the use of PCR and commercial kits, describes the main statistical tools forensic; and lists the
Brazilian laws regarding the examination DNA paternity tests.
Keywords: Kit. STR. PCR. Paternity Test. Legislation Paternity.
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1 INTRODUÇÃO
O termo identidade deriva do latim idem que significa “o mesmo” e é definido como a
“qualidade do idêntico”. Fala-se de identidade a partir de conceitos filosóficos, psicológicos,
sociais, biológicos, jurídicos e médico-legais (GARCIA, 2009). Neste contexto podemos
afirmar que identidade é o conjunto de caracteres físicos, funcionais e psíquicos, natos ou
adquiridos, porém permanentes, que fazem com que uma pessoa seja ela mesma e não outra
(ALCÂNTARA, 1982). Por outro lado, a identificação é um processo pelo qual se determina
a identidade de algo ou alguma coisa. Para MARANHÃO (1998, p.53), identificação é
“exatamente o processo, método ou técnica, usado para evidenciar as propriedades
exclusivamente individuais”. Para tanto, os métodos de identificação precisam atender a
alguns requisitos para terem validade científica. Os requisitos de validação dos métodos de
identificação biológica são a unicidade, a imutabilidade (perenidade), a variabilidade
(classificabilidade) e a praticabilidade (GARCIA, 2009). Os dois primeiros são características
técnicas, já a variabilidade (classificabilidade) e a praticabilidade são requisitos técnicos dos
achados biológicos (MUSSE, 2009).
O sistema de identificação biométrico usa os princípios anteriormente descritos.
Define-se biometria como a ciência da determinação da identidade de um indivíduo nos
atributos físicos, químicos ou comportamentais da pessoa. Tem-se, como exemplo, a
datiloscopia (GARCIA, 2009). Em 1892, as impressões digitais (impressões papiloscópicas)
deixadas pelas extremidades dos dedos passaram a ter aplicações para fins de identificação
pessoal, em virtude de suas características singulares. Nem os gêmeos idênticos têm
impressões digitais iguais (BORÉM et al., 2001).
No entanto, a identidade biológica mais autêntica é a estrutura gênica que está
organizada na molécula do ácido desoxirribonucléico – DNA que compõe um indivíduo. A
combinação aleatória dos milhares de genes torna cada ser humano único (GARCIA, 2009).
Na espécie humana existem cerca de 50 mil genes que codificam o ácido ribonucléico - RNA
e proteínas. Estes genes codificadores de proteínas representam, aproximadamente, 10% do
genoma. O restante são sequências de DNA com funções diversas da síntese de proteínas. É a
variabilidade desse repertório de sequências de DNA, quais sejam as regiões hipervariáveis ou
polimórficas, que se utiliza nos exames forenses de DNA. Os polimorfismos mais conhecidos
são as regiões VNTR (Variable Number of Tandem Repeats), conhecidas como minissatélites
e as STR (Short Tandem Repeats), designadas por microssatélites (DOLINSKY, 2007).
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Os VNTR’s foram usados com sucesso para a tipagem do DNA por mais de 10 anos.
No entanto, como as análises de loci de VNTR requerem grandes quantidades de DNA, esta
metodologia não é tão eficiente para a tipagem de DNA degradado e amostras com pouca
quantidade de DNA como, por exemplo, os preparados de DNA a partir de amostras
biológicas coletadas do meio ambiente. Por outro lado, a análise de STR é uma metodologia
mais simples que funciona mesmo com DNA em pouca quantidade ou degradado (GÓES,
2002). Essa modalidade de determinação/exclusão de paternidade surgiu no final do século
passado. Os STR’s, por serem sequências de DNA menores, permitem a análise de DNA já
degradado, tais como, material biológico seco, em decomposição, decomposto ou carbonizado
que contém pouco DNA analisável (FILHO, 2007).
Os testes de vínculo biológico, também designados por testes de filiação biológica ou
testes de paternidade (sentido lato), são realizados em geral a dois indivíduos com a finalidade
de confirmar ou excluir uma relação genética de parentesco – normalmente de filiação –
podendo, por isso, ter consequências jurídicas. A maioria visa identificar o pai biológico
(testes de paternidade, em sentido restrito), mas existe também a possibilidade de se
identificar a mãe biológica (teste de maternidade) (SANTOS, 2010).
Desta forma, o objetivo desse trabalho foi descrever a importância dos marcadores
microssatélites como prova de DNA na investigação de vínculo genético.
2 METODOLGIA
Trata-se de um estudo qualitativo, descritivo, documental e retrospectivo de revisão
bibliográfica. Foram utilizados artigos científicos constantes em bases de dados, tais como,
Scielo, Science Direct e CAPES; portais de bibliotecas universitárias como da UnB e USP,
entre outros; sites de organizações nacionais e internacionais de referência que trabalham com
marcadores STR’s e livros especializados sobre o assunto. Foram consultados também sites,
legislações e livros jurídicos relativos ao tema.
3 DESENVOLVIMENTO
3.1 Definição de Microssatélite
O DNA genômico apresenta regiões de cópia única e outras com níveis variáveis de
repetições. Estas repetições podem ser longas (satélites), curtas (minissatélites) ou muito
curtas (microssatélites) (MUNIZ, 2010). Os microssatélites ou repetições curtas in tandem
(STR’s) ou repetições de sequências simples (Simple Sequence Repeats – SSR’s), são
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sequências de DNA contendo unidades básicas repetidas de dois a sete nucleotídeos de
comprimento. Essas unidades repetem-se várias vezes em um determinado trecho do genoma.
Embora o genoma humano contenha milhares de marcadores STR’s, apenas um pequeno
conjunto de loci base foi selecionado para uso em testes forenses de identificação humana
(BUTLER, 2007). Os STR’s de maior valor forense são aqueles que apresentam maior
polimorfismo (maior número de alelos), menor tamanho, maior frequência de heterozigotos
(maior que 90%) e baixa frequência de mutações (CARVALHO, 2009).
Os marcadores moleculares podem ser agrupados em polimorfismos de comprimento e
polimorfismos de sequência. Os primeiros incluem as regiões VNTR’s e STR’s. Dentre estes,
os marcadores STR’s são os mais utilizados. A chave da diversidade nessas regiões é baseada
na variação do número de repetições entre os indivíduos, podendo ser estudadas com sondas
de DNA, ou por meio de Reação em Cadeia de Polimerase - PCR. Já os polimorfismos de
sequências são compostos de diferentes nucleotídeos em um determinado locus do genoma.
Estas variações em sequências podem ser manifestadas como regiões de alelos alternativos ou
substituições, adições ou deleções de bases. Em geral, originam-se de mutações pontuais
(DOLINSKY, 2007).
Os microssatélites também são classificados de acordo com o tipo de sequência que se
repete: a) perfeito: a sequência das bases se repete e não ocorre interrupção; b) imperfeito: há
presença de nucleotídeo diferente da estrutura repetitiva; c) interrompido: pelo menos uma das
repetições apresenta nucleotídeos intercalados; d) ou composto: apresenta mais de um tipo de
repetição em série adjacente (BHARGAVA, 2009).
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TABELA 2 – Resumo dos principais kits comerciais de microssatélites comumente utilizados.
Nome dos kits Loci STR’s inclusos Probabilidade
Aleatória
Promega Corporation
PowerPlex 1.1 and 1.2 CSF1PO, TPOX, TH01, VWA, D16S539, D13S317, D7S820, D5S818 7.4 x 10-10
PowerPlex 2.1 D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, VWA, D8S1179, TPOX, FGA, Penta E 3.4 x 10-11
(Para Hitachi FMBIO)
PowerPlex ES FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11, SE33, amelogenina 1.3 x 10-10
PowerPlex 16 CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, 1.2 x 10-18
D16S539, D18S51, D21S11, Penta D, Penta E, amelogenina
PowerPlex 16 BIO CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, 1.2 x 10-18
(Para Hitachi FMBIO) D16S539, D18S51, D21S11, Penta D, Penta E, amelogenina
Applied Biosystems
AmpFlSTR Blue D3S1358, VWA, FGA 1.0 x 10-3
AmpFlSTR Green I TH01, TPOX, CSF1PO, Amelogenina 7.8 x 10-4
AmpFlSTR Cofiler (CO) D3S1358, TH01, TPOX, CSF1PO, D7S820, D16S539, Amelogenin 2.0 x 10-7
AmpFlSTR Profiler Plus (Pro) D3S1358, VWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, 2.4 x 10-11
Amelogenin.
AmpFlSTR Profiler Plus ID D3S1358, VWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, 2.4 x 10-11
Amelogenin, (extra unlabeled D8-R primer)
AmpFlSTR Profiler D3S1358, VWA, FGA, TH01, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, Amelogenin. 9.0 x 10-11
AmpFlSTR SGM Plus (SGM) D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01, FGA, 4.5 x 10-13
Amelogenin.
AmpFlSTR Sefiler (SE) FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D19S433, 5.1 x 10-15
SE33, amelogenina
AmpFlSTR Identifiler (ID) CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, 7.2 x 10-19
D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D19S433, amelogenina.
Fonte: BUTLER et al. (2006), com adaptações. *Frequências alélicas utilizadas para os cálculos de probabilidade aleatória (para indivíduos
sem parentesco) a partir de dados da população caucasiana dos EUA. Ajustamentos estruturais para subpopulações não foram calculados
(isto é, somente foram utilizados p² e 2pq).
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genotipagem. A Figura 1 mostra a escada alélica do kit Identifiler AmpFlSTR (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EUA). Este kit contém 205 alelos em 16 loci co-amplificáveis
sendo 15 STR’s mais a amelogenina. Os tamanhos dos produtos de PCR – de 100 a 500 pb
para os STR – são compatíveis com os fragmentos de DNA degradado encontrados nas cenas
de crime. A amplificação de múltiplos loci STR simultaneamente, ou multiplexação, é
possível devido à variação dos tamanhos e das emissões fluorescentes dos produtos da PCR.
O uso de múltiplos loci permite um alto poder de discriminação em um único teste com pouco
consumo de material (1 ng ou menos) (BUTLER, 2007).
Figura 1. Painéis separados por cores da escada alélica do kit Identifiler AmpFlSTR de calibração dos STR’s. A determinação do genótipo em
amostras processadas é realizada pela comparação do tamanho dos alelos em relação ao padrão interno. O pico do padrão GS500, em 250 pb,
normalmente não é utilizado devido à migração anômala. Fonte: BUTLER et al. (2006), com adaptações.
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Salienta-se que, atualmente, há vários programas computacionais desenvolvidos para
simplificar os cálculos de RV dos testes de paternidade e determinações de parentesco. Os
programas são construídos com base nos conceitos do Teorema de Bayes, probabilidade
condicional e análise de vínculo genético (FUNG, 2003).
Tabela 3. Frequência (%) dos genótipos DQA para populações negras e brancas.
Ge 1,1/1,1 1,1/1,2 1,1/1,3 1,1/2 1,1/3 1,1/4 1,2/1,2 1,2/1,3 1,2/2 1,2/3 1,2/4 1,3/1,3 1,3/2 1,3/3 1,3/4 2/2 2/3 2/4 3/3 3/4 4/4 THo THe
Ne 2,3 7,9 1,4 3,6 3,5 9,1 6,9 2,4 6,4 6,2 16 0,2 1,1 1,1 2,7 1,5 2,9 7,4 1,4 7,2 9,2 21,5 78,9
Br 1,9 5,4 2,3 3 5,5 7,4 3,9 3,4 4,3 7,9 10,7 0,7 1,9 3,4 4,6 1,2 4,4 5,9 4 10,9 7 19 81
Dados obtidos da obra de Moura Duarte, 2001, p. 105, com adaptações. Genótipos homozigoto em negrito. Ge – genótipos, Ne – negros, Br –
brancos, THo – total de homozigoto e THe - total de heterozigoto. DQA – genes pertencentes ao lócus do complexo de histocompatibilidade.
No entanto, se houver “n” loci, e a soma dos quadrados das frequências dos genótipos
no loco i for Pi, então o poder de exclusão acumulado será 1 – (P1.P2...Pn). Por exemplo, se
cinco loci com o poder de DQA for usado, dará um poder de exclusão de: 1 – (0,070)5 =
0,999998. Percentualmente é de 99,9998% (DUARTE, 2001).
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A prova judiciária civil está prevista no Capítulo VI – das provas – do Código de
Processo Civil, a partir do art. 332 até o art. 443. Há várias definições doutrinárias sobre prova
judiciária. Segundo BLIKSTEIN (2008, p.59): “provar resume-se na realização de uma
tarefa necessária e obrigatória, para constituir estado de convencimento no espírito do juiz,
este na condição de órgão julgador, a respeito de um fato alegado e sua efetiva ocorrência,
tal como foi descrito. Prova judiciária, por seu turno, é o meio demonstrativo de veracidade
entre o fato material (fato constitutivo do direito) e o fundamento jurídico do pedido”.
A nível federal, a Lei nº 1.060, de 5 de fevereiro de 1950, estabelece as normas para a
concessão de assistência judiciária gratuita aos necessitados. A Lei nº 10.317, de 6 de
dezembro de 2001, introduziu ao art. 3º da lei anterior o § VI. Este parágrafo prevê a isenção
das despesas com a realização do exame de código genético – DNA que for requisitado pela
autoridade judiciária nas ações de investigação de paternidade ou maternidade.
No âmbito do Distrito Federal, a Lei nº 1.097, de 4 de junho de 1996, trata da
realização de exames de DNA para instruir processos de reconhecimento de paternidade e
maternidade. Ela assegura, em seu art. 3º, a gratuidade dos exames de DNA às pessoas
reconhecidamente necessitadas, como previsto na lei 1.060/1950. O Decreto nº 18.314, de
junho de 1997, regulamentou a Lei 1.097/1996. Dispôs no art. 2º que os exames de DNA
serão realizados pela Divisão de Pesquisa de DNA Forense da Polícia Civil do Distrito
Federal (DPDNA/PCDF), atualmente conhecido como Instituto de Pesquisa de DNA Forense
(IPDNA). Caso os envolvidos nos exames de DNA não sejam amparados pelo benefício da
gratuidade, deverão restituir aos cofres da PCDF a quantia de R$ 1.674,00, a título de taxas de
serviços prestados (PCDF, 2011).
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A contribuição da ciência e tecnologia para o meio forense nas últimas décadas não
tem comparativos na história da humanidade. A participação da biologia molecular para o
progresso na capacidade de identificação humana é incontestável. Este avanço se deve à
percepção e aplicação do polimorfismo presente no DNA de cada ser vivo. A descoberta dos
marcadores moleculares, em especial os microssatélites, foi um marco na capacidade de
individualização biológica. Os STR’s detêm os requisitos essenciais de validação dos métodos
de identificação biológica, pois suas características técnicas de evidenciação da unicidade e da
imutabilidade (perenidade) do DNA são únicas e inigualáveis. Aliadas a estas, eles possuem
ainda os requisitos técnicos de classificabilidade e praticidade em virtude da automatização
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dos processos laboratoriais e do avanço da informática. Esse progresso foi possível pelos
aperfeiçoamentos dos métodos de PCR, dos sequenciadores e pelo surgimento dos kits
multiplex que juntos produzem perfis genéticos a partir de nanogramas de DNA, em pouco
tempo, totalmente informatizado e, muitas vezes, em uma única corrida reacional. Daí ser o
conjunto base de STR, que hoje está em torno de 18 marcadores, considerado uma “moeda”
de troca de informações gênicas no meio científico. Em termos judiciários, o laudo pericial
genético possui peso decisório, considerado por alguns juristas como a “rainha de todas as
provas” devido ao grau de confiança conferido a ele.
A técnica da PCR tem muitas vantagens, sendo decisiva para a comunidade científica
e judiciária na revelação dos perfis de STR’s entre indivíduos. Entretanto, devido à
sensibilidade é muito suscetível a contaminação pelos manipuladores e fontes gênicas alheias.
Os procedimentos baseados nessa técnica necessitam de uma rotina de boas práticas
laboratoriais que é fundamental para a qualidade dos laudos periciais. Esse quesito tem sido
argumento forte de defesa nos processos judiciais. No Brasil não há legislações específicas
que regulamentam as atividades nos laboratórios, muito menos fiscalização para averiguar a
qualidade dos laudos.
Seria interessante, no Brasil, se catalogar os vários estudos nas diversas regiões
brasileiras para se ter a percepção exata das frequências dos marcadores STR’s e se todas as
subpopulações regionais estão cobertas. Nos trabalhos analisados, os resultados dos 13 loci
CODIS foram comparados com outras regiões e muitos desses marcadores apresentaram
diferenças significativas.
Por fim, vislumbrando o intuito de modernização e de vanguarda do judiciário, à
semelhança dos julgamentos on line e dos processos digitais, considerando o avanço
tecnológico, a redução da complexidade dos exames de vínculo genético e a redução do valor
dos insumos para produção dos perfis de DNA, o judiciário brasileiro poderia ser o provedor
dos próprios laudos periciais genéticos para a esfera cível. Não há, a princípio, impedimentos
legais. Esse salto resolveria um problema procedimental recorrente de morosidade processual,
a ausência insistente do suposto pai na hora da coleta de material biológico nos laboratórios.
Com um laboratório institucional, o trio (mãe-filho-pai) já sairia da audiência e seria
conduzido a um posto de coleta. Isso possibilitaria julgamentos mais céleres. Além desse
ganho, os tribunais judiciários teriam um corpo qualificado de profissionais institucionais
capazes de assistir os juízes de forma imparcial, rápida e permanente.
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