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FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO DE ENZIMOLOGÍA

Alumno: _____________________________________Código: _________________

Alumno: _____________________________________Código: _________________

Práctica 7: Análisis de datos enzimáticos

OBJETIVOS:

1. Calcular los parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina usando los datos de cinética
enzimática obtenidos previamente
2. Aprender a usar diferentes métodos para la determinación de parámetros cinéticos
3. Reforzar los conceptos de parámetros cinéticos y su utilidad en el estudio de las
enzimas

1. FUNDAMENTO TEORICO

Las enzimas son proteínas con actividad catalítica capaces de acelerar la velocidad de
reacciones químicas incluso en varios órdenes de magnitud. A nivel celular las enzimas
responden a las necesidades fisiológicas controladas por la traducción de los genes
que las codifican, por efectores alostéricos, por modificaciones covalentes como la
fosforilación y por la concentración de las moléculas que actúan como sustratos y
reactivos de las reacciones que ellas catalizan. La cinética enzimática se encarga de
estudiar la dependencia de la velocidad a la que una enzima cataliza una reacción
química con las condiciones de reacción como la temperatura, el pH, la presencia de
otros agentes químicos y la concentración de uno o varios sustratos.

Para muchas enzimas la cinética de la reacción observada cuando se varía la


concentración del sustrato es de saturación y se puede describir por la ecuación
derivada por Michalelis y Menten.

Vo: Vmax [S] / KM + [S]


La cual relaciona la velocidad inicial de la reacción con la concentración del sustrato.
Esta ecuación muestra que a concentraciones bajas de sustrato el incremento en la
velocidad es lineal con la concentración del sustrato y a concentraciones altas de
sustrato se llega a una constante llamada velocidad máxima. Para que esta ecuación
sea válida deben realizarse mediciones bajo ciertas condiciones experimentales que
garanticen la irreversibilidad de la reacción y la formación constante del complejo
enzima sustrato, por esta razón este tipo de mediciones se conocen como cinética del
estado estacionario.

En esta práctica de laboratorio vamos a llevar a cabo ensayos de cinética enzimática


para una enzima endógena del aparato digestivo de los mamíferos, la fosfatasa alcalina
la cual será aislada del intestino delgado de un cerdo.

2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA


2.1 Normas de seguridad:
Recuerde seguir las BPL que han sido inculcadas desde primer semestre
2.2 Equipos de protección personal:
Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:
 Bata de laboratorio
 Guantes de nitrilo
 Gafas de seguridad
Estos elementos son personales y cada estudiante debe tenerlos
2.3 Manejo de residuos químicos:
Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales están
debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.
Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no controladas y
potencialmente peligrosas. No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos
durante el desarrollo de la práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del
laboratorio, quien le indicará la forma correcta de hacerlo.
2.4 Riesgo Biológico:
 Todo material que haya estado en contacto con los cultivos o sus derivados debe ser descartado
en los recipientes de riesgo biológico para su posterior inactivación.
 No vierta cultivos o sus restos en el vertedero de agua.
 Evite cualquier contacto físico con el material biológico. En cuyo caso lave con abundante agua y
jabón.

3. METODOS

3.1 REACTIVOS:
Tabla 1. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.
ITEM CANTIDAD

3.2. MATERIALES

Tabla 2. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

ITEM CANTIDAD x equipo

3.3. EQUIPOS

ITEM CANTIDAD PARA EL SALÓN


Computador 1

3.4. PROCEDIMIENTO:

3.4.1 Tratamiento de datos de cinética enzimática

1. Usando los datos de Absorbancia y t obtenidos en la práctica anterior calcule las


velocidades iniciales para completar la siguiente tabla:
2. Coloque las unidades correctas bajo velocidad inicial

Tabla 1.
[Sustrato] Velocidad
inicial
3. Haga una gráfica de [Sustrato] vs Velocidad inicial
4. Examine los datos en los dos límites de la ecuación de Michaelis-Menten: A
concentraciones de sustrato muy bajas, que expresión matemática aplica?
5. Ajuste los datos a la expresión matemática según la respuesta 3. Qué parámetro(s)
cinético se obtiene en este caso?
6. Examine los datos en los dos límites de la ecuación de Michaelis-Menten: A
concentraciones de sustrato muy altas, que expresión matemática aplica?
7. Ajuste los datos a la expresión matemática según la respuesta 5. Qué parámetro
cinético se obtiene en este caso?
8. Complete la siguiente tabla con los parámetros cinéticos para la fosfatasa alcalina.
Escriba las unidades correctas en cada parámetro

Tabla 2
Parametros Cinéticos
Método de
cálculo KM Vmax Vmax / KM kcat

Análisis de
concentraciones
límite de Sustrato
Doble reciproco
Ajuste de
mínimos
cuadrados

9. Use la transformación matemática denominada doble reciproco para calcular los


parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina. Debe usar los datos de la tabla 1 y
transformarlos acorde. Consigne los resultados en la tabla 2.
10. Vaya a la página http://www.synergy.com/wordpress_650164087/kaleidagraph/free/
descargue el software kaleidagraph el cual es gratis. Use el tutorial allí presente para
entender su funcionamiento
11. Usando los datos de la tabla 1, genere una gráfica de [Sustrato] vs Velocidad inicial
en este programa, anexe una imagen de esta gráfica. La versión gratis no deja
guardar pero puede tomar pantallazo de lo que logró hacer en su computador.
12. Haga un fit o ajuste de los datos en la gráfica generada en el punto 11 usando la
ecuación de michaelis menten directamente en el programa. Consigne los datos
obtenidos en la tabla 2

4. Análisis de resultados

13. Cómo puede usar los datos de velocidad inicial para determinar la saturación de una
enzima?
14. Comente sobre la veracidad de la siguiente afirmación: Cuando una enzima está
saturada su velocidad disminuye.
15.

5. BIBLIOGRAFÍA.

Price, N. C., & Nairn, J. (2009). Exploring proteins: A student's guide to experimental
skills and methods. Oxford: Oxford University Press.

KaleidaGraph:  Graphing and Data Analysis. Version 3.5 for Windows Synergy Software,
2457 Perkiomen Ave., Reading, PA 19606-2049. www.Synergy.com. $155.00 Paul D.
Kirsch and and John G. Ekerdt Journal of the American Chemical Society 2000 122
(47), 11755-11755 DOI: 10.1021/ja004775j

Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Stryer, L., & Gumport, R. I. (2006). Biochemistry.
Basingstoke: W.H. Freeman & Co.