LABORATORIO DE ENZIMOLOGÍA
OBJETIVOS:
1. Calcular los parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina usando los datos de cinética
enzimática obtenidos previamente
2. Aprender a usar diferentes métodos para la determinación de parámetros cinéticos
3. Reforzar los conceptos de parámetros cinéticos y su utilidad en el estudio de las
enzimas
1. FUNDAMENTO TEORICO
Las enzimas son proteínas con actividad catalítica capaces de acelerar la velocidad de
reacciones químicas incluso en varios órdenes de magnitud. A nivel celular las enzimas
responden a las necesidades fisiológicas controladas por la traducción de los genes
que las codifican, por efectores alostéricos, por modificaciones covalentes como la
fosforilación y por la concentración de las moléculas que actúan como sustratos y
reactivos de las reacciones que ellas catalizan. La cinética enzimática se encarga de
estudiar la dependencia de la velocidad a la que una enzima cataliza una reacción
química con las condiciones de reacción como la temperatura, el pH, la presencia de
otros agentes químicos y la concentración de uno o varios sustratos.
3. METODOS
3.1 REACTIVOS:
Tabla 1. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.
ITEM CANTIDAD
3.2. MATERIALES
3.3. EQUIPOS
3.4. PROCEDIMIENTO:
Tabla 1.
[Sustrato] Velocidad
inicial
3. Haga una gráfica de [Sustrato] vs Velocidad inicial
4. Examine los datos en los dos límites de la ecuación de Michaelis-Menten: A
concentraciones de sustrato muy bajas, que expresión matemática aplica?
5. Ajuste los datos a la expresión matemática según la respuesta 3. Qué parámetro(s)
cinético se obtiene en este caso?
6. Examine los datos en los dos límites de la ecuación de Michaelis-Menten: A
concentraciones de sustrato muy altas, que expresión matemática aplica?
7. Ajuste los datos a la expresión matemática según la respuesta 5. Qué parámetro
cinético se obtiene en este caso?
8. Complete la siguiente tabla con los parámetros cinéticos para la fosfatasa alcalina.
Escriba las unidades correctas en cada parámetro
Tabla 2
Parametros Cinéticos
Método de
cálculo KM Vmax Vmax / KM kcat
Análisis de
concentraciones
límite de Sustrato
Doble reciproco
Ajuste de
mínimos
cuadrados
4. Análisis de resultados
13. Cómo puede usar los datos de velocidad inicial para determinar la saturación de una
enzima?
14. Comente sobre la veracidad de la siguiente afirmación: Cuando una enzima está
saturada su velocidad disminuye.
15.
5. BIBLIOGRAFÍA.
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skills and methods. Oxford: Oxford University Press.
KaleidaGraph: Graphing and Data Analysis. Version 3.5 for Windows Synergy Software,
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