Isolasi jamur

1. Inokulasi jaringan misellah ke dalam cawan pentri yang telah berisi mea Bc ( 2% + antibotik
chloramphenicol dan chlortetracycline 0,01% b / v) dan fungisida benomyl (1% b / v))-
Kiiskinen et al., 2004

2. Diinkubasi selama 7 hari 30

3. Strain dipertahankan pada 4 ◦C pada MEA miring dan dilakukan subkultur selama dua bulan
Subkultur adalah pemindahan sel-sel, jaringan, atau organ ke dalam medium baru.)

Inokulum kondisi kultur

 Preprarasi
Strain jamur diinkubasi dalam 2% MEA selama 5 hari pada suhu 30 ◦C

 Inokulasi pada media agar

Strain jamur yang telah diaktifkan diinokulasi pada cawan Petri (90 mm) yang berisi 20
mL MEA serta pewarna 100 mg L−1 yang ditambahkan secara aseptis. Kemudian
diinkubasi pada suhu 30◦C selama 7 hari.

 Inokulasi pada media cair

Kultur cair dibuat dari 100 ml MEB pada labu Erlenmeyer 250 mL. Pewarna dengan
konsentrasi 100 mg L−1 . media cair ini diinokulasi dengan tiga piringan agar yang
didapkan dari tepi aktif misilium
Di inkubasi selama 7 hari dengan suhu 30 dalam sheker 150 rpm
PH dibuat 5,5 sebelum disterilkan

3.2.3 Screening untuk aktivasi enzim lignolitik di media padat

 Semua strain yang terisolasi secara alami akan mengalami skrining kualitiatif primer
yang didasarkan pada kemampuan masing-masing jamur dalam menghasilkan enzim
lignolitik aktivitas tersebut dapat dilihat dari zona warna yang berkembang disekitar
mikroba yang sedang tumbuh

3.2.4 Uji enzim lignolitik dalam media cair).

 uji aktiivtas oksidase dan perioksidase digunakan varian cary 100
 3ml ali3ml aliquot dihilangkan secara aseptik dari kultur cair, disentrifugasi (5000 × g
untuk 10 menit) dan dilakukan penyaringan mikro
 Supernatan yang dihasilkan digunakan untuk uji enzimatis
 Uji aktivitas lac menggunakan metode wang, dengan memantau oksidasi ABTS pd 405
nm
  Reaksi terdiri dari aliquot dari ekstrak enzim kemudian ditambahakn dalam larutan
ABTS (1 mM ABTS dalam0,2 M larutan buffer natrium asetat (pH 4,5) )

3.3 Identifikasi morfologi dan molekuler strain SCS-10

Strain SCS-10 dikumpulkan dari cabang tumbuhan yang jatuh dan bersentuhan dengan tanah.
Basidiokar memiliki bentuk seperti spora yang terlindungi dan tanaman yang berumur panjang
. Pileus adalah bagian tudung jamur dan permuakaan atasnya memiliki tekstur lembut,
berdaging dan lembab. Konteksnya berwarna putih, halus dan homogen (Gambar 2a dan b).
Dalam kultur, pertumbuhan miselia menunjukkan perubahan konsentris dari inokulum.
Morfologi dari koloni tersebut menunjukkan warna putih, tebal, tekstur yang kuat dan memiliki
rupa seperti kapas (Gambar 2c). Hifa diperiksa secara mikroskopis untuk mengamati adanya
penjepit (clamp connection) , septa dan basidiospora (Gambar 2d), hasil menunjukkan jamur
tersebut termasuk basidiomycete yang dikonfonfirmasi berdasarkan sifat-sifat basidiomycete
yang telah ditunjukkan oleh Barrasa et al. (2014). Dilakukan analisis molekuler berdasarkan
sekuensing internal transcribed spacers (ITS 1 dan 2) dan pada daerah rDNA 5.8S digunakan
primer spesifik ITS5 / ITS4 yang memungkinkan mengidentifikasi strain SCS-10 sebagai T.
villosa, hasilnya 99% memperlihatkan bahwa T. villosa CBS334.49. Sequence dari T. villosa
SCS-10 disimpan dalam database GenBank dengan nomor aksesi KP872699.

3.4 Biodekolorasi pewarna kulit oleh kultur T. villosa SCS-10

 peajari grafik
 Keterlibatan laccase dan mangan peroksidase dalam mekanisme biodecolourisasi dapat
dipelajari dalam pengujian yang dilakukan dengan menggunakan inhibitor enzim

Bab 4

4.1 Isolasi dan skrining untuk aktivitas enzim ligninolitik dan dekolorasi pewarna
 Dari 40 jamur hanya 11 yang mengahsilkan enim lignolitik
 Dari 11 diambil 3 terbaik( sc02, sc10, sc11)
 Ketiga isolat menunjukkan warna coklat diarea GUA-MEA dan ungu ABTS
menunjukkan adanya proses oksidasi
 SC02 dan SC10 menunjukkan aktivitas laccase (SRY (a) dan SRY (b) bernilai +)
 SC11 aktivita LiP (SYR (b) - SYR (c) + ) karena katalase dapat menguraikan H2O2
 Sc10 dan 11 aktivitas MnP ( bintik coklat pada media MnCL2, bintik coklat ini
MnO2)
 Paling berpotensi Sc10 ( aktivita Lac & MnP) karena jamur ini adalah satu-satunya yang
paling berpotensi dalam mendokolorasi pewarna, yang ditunjukkan dengan pembentukan
daerah radial dekolorasi disekitar pertumbuhan miselium jika dibandingkan dengan pelat
kontrol
 Aktivitas enzim diuji dalam kondisi fermentasi terendam menunjukkan bahwa SCS-10
memiliki tingkat aktivitas Lac yang lebih tinggi (1544,44 ± 43,98 U L –
  Ketika Aktivitas enzim diuji dalam kondisi fermentasi terendam menunjukkan bahwa SCS-10
memiliki tingkat aktivitas Lac yang lebih tinggi (1544,44 ± 43,98 U L − 1), kemudian diikuti
oleh SCS-02 (473,62 ± 35,11 U L − 1), untuk aktivitas MnP Strain SCS-10 dan SCS-11
menunjukkan hasil masing-masing 115.47 ± 9.24 dan 573.49 ± 7.85 U L − 1. Pada uji kondisi
ini tidak ditemukan aktivitas enzim LiP (Tabel 1)

4.2 gjgk
 Aktivitas MnP dihambat oleh natrium azida pada konsentrasi lebih rendah dari 0,02 mM
(data tidak ditampilkan) dan kurang berperan dalam penghapusan warna
 Edta dan nan3 tidak menghambat secara signifikan jika digunakn kurang dari ≤50mM
<0.05mM
 Hasil ini menunjukkan bahwa yang bertanggung jawab dalam menghilangkan warna dalam
proses biodekolorasi enzimatik adalah laccase
 Pengujian menggunakan 0,1 mM NaN3 bertujuan untuk memastikan efesiensi laccase
dalam biodekolorasi menyebabkan nilai biodekolorasi dari AR357, AB210 dan AB161
sebesar 13,29 ± 0,93, 12,30 ± 0,46 dan 20,05 ± 2,08%,
 Jika konsentrasi EDTA dan NaN3 lebih tinggi dari 50 mM dan 0,1 mM dapat menimbulkan
efek negatif dalam produksi biomassa sehingga tidak dilakukan dalam analisis ini
 Aktivitas MnP dihambat oleh natrium azida pada konsentrasi lebih rendah dari 0,02 mM
(data tidak ditampilkan) dan kurang berperan dalam penghapusan warna.
 Hasil penelitian menunjukkan bagaimana biosorpsi AB161 lebih tinggi daripada pewarna
lainnya. ( diuji pewaran ab161 u morfologi)
 Mikroskop cahaya menunjukkan adsorpsi pewarna oleh biomassa jamur dan SEM
menunjukkan sifat amorf hifa setelah dekolorasi pewarna kulit. EDX mengungkapkan
adanya Cr, K dan S dan peningkatan kandungan N dalam biomassa jamur setelah perawatan
selama 48 jam.
 adsorpsi adalah mekanisme utama dalam biodecolourization pewarna tekstil (Remazol
Black, Novacron Red dan Turquoise Blue) pada waktu treatment pertama, dan katalisis
enzimatik merupakan mekanisme utama yang terlibat dalam proses selanjutnya.
 Dalam kultur, pertumbuhan miselia menunjukkan perubahan konsentris dari inokulum.

4.4. Biodecolization pewarna kulit dengan ekstrak mentah

 Hasil pengujian menunjukkan nilai tertinggi dalam penghapusan warna adalah AB161 (71,89
± 1,66%), diikuti oleh AR357 (57,94 ± 1,01%) dan AB210 (43,06 ± 1,61%)
 Efisiensi biodecolourization secara signifikan lebih rendah daripada yang dicapai dengan kultur
murni. Hal ini karena dalam kultur murni sel, miselia memberikan perlindungan dari faktor
eksternal (pH dan suhu) dan enzim dapat terus-menerus diisi ulang.
 Ektrask mentah harus dengan bantuan mediator ( HBT, ABTS, SYRDH, MnCl2 dan H2O2)
agar efesiensi biodekolorasi tinggi
 Biodekolorasi tertinggi terjadi ketika digunakannya HBT (1mM) sebagai mediator redoks,
dimana didapatkan nilai BE sebesar 85,45 ± 3,43, 76,96 ± 1,39 dan 90,17 ± 0,97% dalam 8 jam
perawatan untuk pewarna AB161, AR357 dan AB210.
 ABTS (1 mM) dan SYRDH (1mM) tidak meningkatkan efisiensi biodecolization. Bahkan
dengan digunakannya ABTS nilai biodekolorasi menjadi sedikit lebih rendah
 ABTS tidak sesuai dgn penulis lain karena jamur yang digunakan dari spesies yang berbeda
sehingga menghasilkan laccase yang berbeda pula, serta perbedaan stuktur dari pewarna yang
digunakan.
mediator dapat menghambat biodekolorasi karena toksisitas dari konsentrasi radikal yang tinggi
selama oksidasi lakase dari senyawa ini (ABTS)
 Penambahan kofaktor perioksidase H2O2 dan MnCl2 (0,1 mM) tidak terlalu berpengaruh
secara signifikan terhadap penghapusan warna dari pewarna yang diuji (data tidak ditampilkan)
 Hasil ini menegaskan bahwa kinerja biodekolorasi ekstrak mentah yang dihasilkan oleh T.
villosa SCS-10 berhubungan dengan aktivitas laccase ( u menguji aktivtas lac dgn inhibitor
nan3)
 perawatan dengan kultur murni yang tumbuh dalam enfluen mungkin lebih cocok untuk
perawatan industri karena tidak perlu menggunakan mediator yang dapat beracun dan mahal
(Li et al., 2014) ~ sehingga tdk perlu penggunaan ekstrak crude ~