HPLC

(High Performance Liquid Chromatography)

atau
KCKT
Presentton Subtitle

(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

Muhammad Faisal
I1021161015
 Apa itu
HPLC??? HPLC adalah teknik kromatografi dgn alat
yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah
kolom dari fase diam (partikel padatan yang
Presentton Subtitle
berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu
cairan) dengan memompa cairan (fase bergerak)
pada tekanan tinggi melalui kolom hingga 400
atm.
Yang paling membedakan HPLC dengan
kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan
tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak
 Kromatografi
Adsorbsi

Kromatografi
Kromatografi
Fase
Penukar Ion
Presentton Subtitle
Terikat

Jenis-jenis HPLC berdasarkan sifat fase

diam (mekanisme sorpsi solut)

Kromatografi Kromatografi
Pasangan Ion Afinitas

Kromatografi
Ekslusi Ukuran
SKEMA Presentton Subtitle

ALAT
HPLC
 1. Pompa (motor penggerak fasa gerak)
Pompa berfungsi untuk memompa baik eluen dan sampel yang disuntikan
melalui injektor.
FUNGSI a. Syarat :
- Tekanan hingga 6000 psi (400 atm)
ALAT, - tahan Presentton Subtitle
korosi & tahan terhadap fasa gerak

SYARAT, - Control laju alir yang akurat , hingga 20 mL/menit

- Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan
lebar
DAN - Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien
JENIS b. Jenis:
- Pompa reciprocating (torak) : aliran yang berdenyut dan teratur
(konstan), ada peredam udara vol kecil (35 –400 L), tekanan > 10.000 psi
- Pompa Displacement (semprit) : seperti siring, aliran konstan(teratur),
tak terbatas, dan tak berdenyut
- Pompa Pnematik : tekanan < 20.000 psi, aliran tidak teratur (konstan)
 2. Injector (Pemasukkan cuplikan)
tempat memasukkan cuplikan kedalam pangkal kolom (kepala
FUNGSI kolom), diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada
kemasan kolom.
ALAT, a. Syarat : tekanan tidak turun
Presentton Subtitle
b. Teknik :
SYARAT, - syringe/ septum : disuntikkan melalui septum, tahan hingga
tekanan 1500 psi/ 70 atm, tidak tahan dengan semua pelarut
DAN kromatografi cair, partikel kecil dari septum yang terkoyak
(akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan.
JENIS - stop-flow : aliran pelarut dihentikan sementara. Teknik ini
digunakan karena difusi di dalam cairan kecil.
- loop vaive (kran cuplikan) : cara automatis (dengan
menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil
dapat diinjeksikan secara manual).
 3. Kolom
Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan
FUNGSI kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom merupakan bagian
yang sangat penting dari disebut cartridge. Biasanya terbuat dari
ALAT, stainless steel.
Presentton Subtitle
a Fungsi :
SYARAT, - Menyaring kotoran
- Menjenuhkan fasa diam
DAN b. Jenis :
JENIS - Kolom analitik : d= 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada
jenis material pengisi kolom
- Kolom pengaman/guard kolom / preparatif : d= >6 mm, p =25 -
100 cm , dpt digunakan pada temperatur lebih tinggi dari
temperatur kamar.
 4. Detector
Digunakan untuk mendeteksi adanya komponen sampel (cuplikan) di dalam eluen
kolom (analisis kualitatif) dan menghitung jumlahnya (analisis kuantitatif).
FUNGSI a. Syarat :
- sangat peka (sensitifitasnya tinggi)
ALAT, - tidak banyak berderau (noise)
Presentton Subtitle
- kisar respons linier yang luas & waktu respon rendah
SYARAT, - memberi respons untuk semua tipe senyawa
- tidak merusak cuplikan
DAN b. jenis :
- UV/Vis untuk senyawa organik, biasanya 254 nm
JENIS - Retraktif indeks (RI) detector
- Konduktifitas penukar ion
- Elektrokimia detector
- Polarografi redoks
- Indeks bias
FUNGSI 5. Komputer (PC) dan Printer
ALAT, Komputer berisi
Presentton software pengolahan data yang
Subtitle
menampilkan grafik dari pembacaan absorbansi
SYARAT, sampel terhadap perubahan waktu. Grafik hasil
pembacaan disebut kromatogram.
DAN
JENIS
 Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah salah satu dari
variabel yang mempengaruhi pemisahan.
Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan fase bergerak.
Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu
FASE karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan
linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan
chromatogram. Presentton Subtitle
GERAK Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti methanol.
Fase gerak (eluen/pelarut)
DAN a. Syarat :

FASE - Murni, tanpa cemaran, tidak kental untuk menghindari penyumbatan dalam kolom
- Tidak bereaksi dengan kemasan

DIAM - Sesuai dengan detector

- Dapat melarutkan cuplikan
- Mempunyai viskositas rendah
- Mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun
- Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
 b. Jenis :
- interaktif
FASE - non interaktif
-kepolaran (berdasar polaritas senyawa)
Presentton Subtitle
GERAK a. Fase norrmal : Fasa gerak nonpolar & Fasa diam polar
b. Fasa Terbalik : Fasa gerak polar & Fasa diam nonpolar
DAN
Fase diam (zat padat)
FASE Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus diperkecil
sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan
DIAM lagi dan bening. fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki
ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga
keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.
PRINSIP Presentton Subtitle
KERJA
HPLC
Prinsip kerja dari HPLC :
1.sampel yang akan diuji diinjeksikan dg injector ke dalam kolom
2.Dari injector, memompa sampel ke kolom dengan tekanan tinggi. Kolom diisi dengan
partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang
berfungsi sebagai fasa diam. Presentton Subtitle
3.Dari kolom sampel kemudian akan terurai dan terpisah berdasarkan partisi antara fasa
diam dan fasa gerak yang satu sama lain tidak bercampur yang menjadi senyawa-
senyawa kimia (analit) sesuai dengan perbedaan kepolaran afinitasnya
4.Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
5.selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan
personal computer (PC) yang terhubung dengan alat HPLC.
 • untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap
senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan
fasa gerak tertentu
• banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
• Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai
KEGUNAAN polar dapatPresentton
dipisahkanSubtitle
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
• Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
KERJA dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
HPLC • Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin
Zipax-SAX.
• Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
• Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-
masalah biokimia.
• untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
 • Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya
memisah yang tinggi.
• Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
• Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
KELEBIHAN • Kolom dapatPresentton
digunakan Subtitle
kembali.
• Waktu analisa cukup singkat (cepat).
KERJA • HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat
yang tidak stabil.
HPLC • Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
• Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
• Lebih teliti dan mudah melaksanakannya sehingga tepat dan akurat
• Resolusinya baik
• Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas
 • Harganya cukup mahal sehingga penggunaannya dalam
lingkup penelitian yang terbatas
• Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
KEKURANGAN • Pada kolom dengan
Presentton Subtitlediameter rata-rata partikel fase diam
dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih
KERJA mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci
dan kemurnian larutan harus dijaga.
HPLC
• Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu
• Hanya bisa digunakan untuk asam organic
• Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara
pelarut, analit, dan gradien elusi.