Anda di halaman 1dari 29

LAPORAN PRAKTIKUM BIOFARMASETIKA

PERCOBAAN I

OPTIMASI METODE ANALISA OBAT

Disusun Oleh :

1. Ade Vinska Rahmawati 1041411001


2. Anisa Diniarti 1041411020
3. Dewi Sukmasari 1041411163
4. Dara Camelia 1041511036
KELOMPOK G-6

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI “YAYASAN PHARMASI”

SEMARANG

2016
PERCOBAAN 1

OPTIMASI METODE ANALISA OBAT

A. Tujuan Praktikum
1. Memahami langkah-langkah analisa obat di dalam tubuh
2. Mampu melakukan validasi metode analisis obat di dalam tubuh

B. Dasar Teori
Biofarmasetika adalah pengkajian faktor-faktor fisiologis dan farmasetik yang
mempengaruhi pelepasan obat dan absorbansi dari bentuk sediaan. Sifat fisika kimia obat
dan bahan-bahan penambah menetapkan laju pelepasan obat dari bentuk sediaan dan
transport berikutnya melewati membran-membran biologis. Sedangkan fisiologis dan
kenyataan biokimia menentukan nasib obat dalam tubuh. (Lachman dkk, 2007)
Dalam proses terapi, terdapat beberapa faktor yang menentukan yaitu: diagnosa
penyakit secara akurat, status klinik jelas, dan penentuan obat tepat. Di sinilah pokok
pentingnya biofarmasetika yang erat hubungannya dengan penentuan obat yang tepat.
Biofarmasetika adalah ilmu yang mempelajari tentang hubungan antara sifat fisikokimia
formulasi dengan bioavailabilitas obat. (Shargel, 2005)
Evaluasi dan interprestasi dari studi biofarmasetika merupakan bagian yang
integral dari pengembangan obat obat (“drug-product-design”). Penelitian-penelitian di
bidang biofarmasetika mencakup:
- Pengaruh dan interaksi antara formulasi obat dan teknologi. Pembuatan dalam
berbagai bentuk sediaan yang akhirnya sangat menentukan kerja obat sesuai dengan
sifat fisiko kimianya.
- Pengaruh dan interaksi antara obat dan lingkungan biologik pada penyerapan dan cara
pemberian obat yang akhirnya menentukan disposisi zat aktif dalam tubuh.
-
Pengaruh dan interaksi dari zat aktif dengan organisme menentukan ketersediaan obat
secara biologis. (Joenoes, 2006)
Analisa obat biasanya dilakukan oleh laboratorium kimia klinik atau laboratorium
farmakokinetik klinik. Metode yang digunakan oleh laboratorium analitik bergantung pada
beberapa faktor seperti fisikokimia obat, konsentrasi yang diukur, jumlah dan sifat contoh
biologis (serum dan urin). Laboratorium hendaknya mempunyai suatu standar prosedur
penyelenggaraan untuk tiap teknik analisis obat dan mengikuti cara-cara pelaksanaan
laboratorium yang baik. Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kadar obat
dalam serum hendaknya lebih sahih, berkenaan dengan hal-hal berikut: spesifitas,
linearitas, kepekaan, ketepatan, ketelitian dan stabilitas. (Shargel, 2005)
Spektrofotometri adalah salah satu metode tradisional yang masih digunakan untuk
obat yang memiliki spektrum absorbsi khas. Banyak obat baru yang kompleks dengan sifat
dan ikatan-ikatan kimiawi tidak lazim yang sering dapat diukur dengan spektrofotometri
setelah ekstraksi dari serum atau cairan biologis lain. Obat kemudian dimasukkan ke
dalam suatu pelarut, diderivatkan atau diturunkan sedemikian rupa sehingga puncak
absorbsi menjadi maksimum. (Sacher, 2004)
Validasi metode analisis merupakan tahapan penting dalam penjaminan mutu
analisis kuantitatif. Validasi menurut United State Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk
menjamin bahwa metode analisis yang digunakan bersifat akurat, spesifik, reproduksibel,
dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Sementara itu menurut ISO/IEC: 17025
tahun 2005, validasi adalah metode analisis yang ditujukan untuk menjamin bahwa
metode analisis memenuhi spesifikasi yang dapat diterima sesuai dengan tujuan yang
diharapkan. Tujuan akhir validasi metode analisa adalah untuk menjamin bahwa tiap
pengukuran dalam suatu analisis rutin harus cukup dekat dengan nilai kandungan analitik
yang sebenarnya dalam sampel. (Gholib, 2012)
Prosedur analisis memberikan dekrispsi yang tepat bagaimana suatu analisis
dilakukan. Tahap-tahap penting untuk melakukan tiap uji analisis harus dijelaskan secara
terperinci. Metode lengkap harus menjelaskan:
1. Mutu dan sumber baku pembanding untuk senyawa yang sedang dianalisis.
2. Prosedur yang digunakan untuk menyiapkan larutan baku pembanding.
3. Mutu semua pereaksi yang digunakan dalam penetapan kadar dan metode
pembuatannya.
4. Prosedur dan keadaan yang digunakan untuk pengoperasian semua perlengkapan yang
diperlukan dalam penetapan kadar tersebut.
5. Metodologi yang digunakan untuk kalibrasi penetapan kadar dan metodologi yang
digunakan untuk pemrosesan sampel tersebut sebelum analisis. (David, 2007)
Validasi ditujukan untuk menjamin bahwa metode analisis memenuhi spesifikasi
yang dapat diterima sesuai dengan tujuan yang diharapkan. Hal ini dilakukan untuk
menjamin setiap pengukuran serupa dengan yang dilakukan di masa yang akan datang
dengan menghasilkan nilai terhitung yang cukup dekat atau sama dekat dengan nilai
sebenarnya dari jumlah analit dalam sampel.
Tahapan metode validasi:
1. Presisi
Merupakan ukuran keterulangan metode analisis. Biasanya diekspresikan
sebagai simpangan baku relatif atau relative standard deviation (RSD) dari sejumlah
sampel. Presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang berbeda yaitu:
a. Keterulangan (Repeatability) yaitu presisi pada kondisi percobaan yang sama
(berulang) baik orang, peralatan, tempat, maupun waktunya.
b. Presisi antara (Intermediate Precison) yakni presisi pada kondisi percobaan yang
salah satunya berbeda, baik orang, peralatan, tempat, maupun waktunya.
Banyaknya presisi antara yang dilakukan tergantung pada keadaan yang mana
suatu prosedur akan diperluas. Parameter-parameter yang diamati untuk presisi
antara meliputi: variasi antar hari, variasi analisis, dan variasi peralatan.
c. Ketertiruan (Reproducibility) mengukur presisi antara laboratorium sebagaimana
dalam studi uji banding antar laboratorium dan atau uji profisiensi. Parameter ini
harus dipertimbangkan dalam standarisasi prosedur analisis (termasuk juga
prosedur-prosedur dalam Farmakope dan transfer metode antar laboratorium yang
berbeda).
2. Ketepatan (akurasi)
Akurasi merupakan ketepatan metode analisis atau kedekatan antara nilai
terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai
rujukan. Untuk pengujian senyawa obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan
hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar (standard reference material).
3. Batas Deteksi (Limit of Detection, LOD)
Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel
yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD (Limit
of Detection) merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan bahwa analit di
atas atau dibawah nilai tertentu. Definisi batas deteksi yang paling umum digunakan
pada kimia analisis adalah bahwa batas deteksi merupakan kadar analit yang
memberikan respon blanko (yb) ditambah dengan 3 simpangan baku blanko (3Sb).
4. Batas Kuantifikasi (Limit of Quantification, LOQ)
Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam
sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada
kondisi operasional metode yang digunakan.
5. Spesifisitas dan selektifitas
Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat
dan spesifik dengan adanya komponen lain dalam matriks sampel seperti
ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen matriks. Untuk tujuan identifikasi,
spesifisitas ditunjukkan dengan kemampuan suatu metode analisis untuk membedakan
antar senyawa yang mempunyai struktur molekul yang hampir sama. Untuk tujuan uji
kemurnian dan tujuan pengukuran kadar, spesifisitas ditunjukkan oleh daya pisah 2
senyawa yang berdekatan (sebagaimana dalam kromatografi). Senyawa-senyawa
tersebut biasanya merupakan komponen utama atau komponen aktif dan atau suatu
pengotor. Jika dalam suatu uji terdapat suatu pengotor maka metode uji harus tidak
terpengaruh oleh adanya pengotor.
Selektifitas adalah suatu level yang mana suatu metode analisis dapat
mengkuantifikasi analit secara akurat dengan adanya pengganggu dibawah kondisi uji
yang telah ditentukan untuk matriks sampel yang akan dianalisis.
6. Linearitas
Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji
yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang
diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi
yang menghubungkan antara respon dengan konsentrasi (x). Linearitas dapat diukur
dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data
yang diperoleh selanjutnya di proses dengan metode kuadrat terkecil, untuk
selanjutnya ditentukan nilai kemiringannya (slope), intersep, dan koefisien korelasi
(r). (Gholib, 2012)

Spektrofotometer adalah alat yang terdiri atas spektrometer dan fotometer.


Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan
fotometer adalah alat untuk mengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau
diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika
energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang
gelombang. (Khopkar, 1990)
Dalam mempelajari analisis kuantitatif dan absorbsi, berkas radiasi dikenakan pada
sampel, kemudian intensitas radiasi yang diteruskan atau ditransmisikan diukur. Radiasi
yang diabsorbsi oleh sampel ditentukan dengan membandingkan intensitas dari berkas
radiasi yang diteruskan bila ada zat penyerap. Jika radiasi mengenai sampel memiliki
energi sesuai yang dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan energi, maka
terjadi absorbsi. (Sudarmadji dkk, 1996)
Tahapan-tahapan dalam analisis spektrofotometri secara garis besar adalah :
a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-VIS
Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah
tersebut. Caranya dengan merubah menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan
reaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu :
• Reaksinya selektif dan sensitif
• Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reproduksibel
• Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama.
b. Waktu operasional (operating time)
Cara ini digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna.
Tujuannya untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional
ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi.
(Gandjar dan Rohman, 2007)
Pengukuran pada operating time akan diperoleh hasil pembacaan serapan yang
stabil karena dimungkinkan setelah operating time kompleks warna yang terbentuk
telah stabil. Penentuan operating time akan mempengaruhi hasil pengukuran secara
keseluruhan. (Mulja, 1995)
c. Pemilihan panjang gelombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang
gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih panjang gelombang
maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan
panjang gelombang dari larutan baku pada panjang gelombang tertentu. (Gandjar dan
Rohman, 2007)

Paracetamol

N-(4-Hydroxyphenyl) acetamide
C8H9NO2
BM = 151,2
Pemerian: Serbuk hablur, putih; tidak berbau; rasa sedikit pahit.
Kelarutan: Sangat sukar larut dalam air dingin, tetapi mudah larut dalam air hangat; larut
dalam etanol, metanol, dimetilformamida, etilen klorida, aseton, dan etil
asetat; sangat sukar larut dalam kloroform; sukar larut dalam eter; praktis tidak
larut dalam petroleum eter, pentana, dan benzene. (Moffat, Anthony C dkk,
2003)
pH : 3,8 - 6,1
pKa : 9,5 (Sweetman and Sean C, 2009)

Heparin

Heparin adalah sediaan steril mengandung polisakaridosulfat seperti yang


terdapat dalam jaringan hewan yang menyusui, mempunyai sifat khas pembekuan
darah. Potensi tiap mg tidak kurang dari 110 UI, dihitung terhadap zat yang telah
dikeringkan dan tidak kurang dari 90% dan tidak lebih dari 110% dari jumlah yang
tertera pada etiket.
Pemerian: Serbuk; putih atau putih kuning gading; agak higroskopis.
Kelarutan : Larut dalam 2,5 bagian air.
Khasiat : Anti koagulan (Depkes RI, 1979)
Asam salisilat
BM: 138,12
Asam salisilat mengandung tidak kurang dari 99,5% dan tidak lebih dari 101,0 %
C7H6O3 dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan.
Pemerian: Hablur putih; biasanya berbentuk jarum halus atau serbuk hablur halus
putih; rasa agak manis; tajam dan stabil di udara.
Kelarutan : Sukar larut dalam air dan benzena; mudah larut dalam etanol dan dalam
eter; larut dalam air mendidih; agak sukar larut dalam kloroform.
(Depkes RI, 1979)

C. Alat dan Bahan


Alat :
1. Labu takar 9. Pipet volume
2. Mikropipet 10. Pipet ukur
3. Tabung sentrifuge 11. Filler
4. Evendrop 12. Scalpel
5. Vortex-mixer 13. Holder
6. Sentrifuge 14. Tissue lensa
7. Spektrofotometer 15. Bekerglass
8. Kuvet

Bahan:
1. Asam Salisilat 9. HCl 6N
2. Paracetamol 10. NaOH 0,1%
3. Asam trikloroasetat (TCA) 5% 11. NaOH 10%
4. Asam trikloroasetat (TCA) 20% 12. FeCl3
5. Natrium nitrit 0,1% 13. Aquadest
6. Natrium nitrit 10% 14. Darah Tikus
7. Asam sulfamat 0,5% 15. Heparin
8. Asam sulfamat 15% 16. Aqua pro injeksi

D. SKEMA KERJA
ASAM SALISILAT
1. Pembuatan Larutan Stok Asam Salisilat

Ditimbang 100 mg Asam Salisilat

Ditambahkan aqua pro injeksi ad 50,0 ml

Diperoleh kadar 1mg/ml atau 1000µg/ml


2. Pencarian λ maks dan OT Asam Salisilat

Dihitung volume larutan stok Asam Salisilat dan volume darah yang
digunakan untuk membuat konsentrasi 50 dan 100 μg/ml sebanyak 500 μl

Diukur larutan stok Asam Salisilat dan volume darah yang dibutuhkan tiap
konsentrasi, campur homogen

Ditambah 1,0 ml TCA 5% dengan vortexing

Disentrifuge (10 menit, 2500 rpm), diambil 0,5 ml beningan + FeCl3 4,5 ml

Pindahkan larutan ke dalam kuvet

Dicari λ maks Asam Salisilat yang memberikan absorbansi maksimal


(λ 400-600 nm) & waktu Asam Salisilat yang memberikan absorbansi tetap
3. Pemrosesan Sampel Darah

500 µl darah yang mengandung Heparin dalam tabung sentrifuge

Ditambahkan 4,5 ml FeCl3 dengan vortexing

Campuran disentrifuge 500 rpm selama 10 menit; diambil 0,5 beningan

Dalam tiap tabung ditambahkan:


NaOH 0,1% ; 0,2 ml NaNO2 0,1% dan 0,2 Asam Sulfamat 0,5%

Pindahkan ke dalam kuvet, diukur serapan pada λ maks

4. Pembuatan Kurva Baku Asam Salisilat

Diukur absorbansi semua larutan Asam Salisilat pada λ maks

Dibuat kurva hubungan antara resapan terhadap kadar masing-masing

Dibuat persamaan menggunakan kuadrat terkecil y= bx+a dan hitung nilai r


dari grafik

5. Menentukan Perolehan Kembali, Kesalahan Acak , Kesalahan Sistematik

Ditetapkan kadar Asam Salisilat dari masing-masing deret baku dengan kurva
baku yang diperoleh sebelumnya

Ditetapkan recovery, kesalahan acak dan kesalahan sistemik


PARACETAMOL

1. Pembuatan Larutan Stok Paracetamol

Ditimbang 100,0 mg Paracetamol

Dilarutkan aquadest panas ad 100,0 ml

Diperoleh kadar 1mg/ml atau 1000µg/ml

2. Pencarian λ maks dan OT Paracetamol

Dihitung volume larutan stok Paracetamol dan volume darah yang digunakan
untuk membuat konsentrasi 100, 300 dan 500 μg/ml sebanyak 500 μl

Diukur larutan stok Paracetamol dan volume darah yang dibutuhkan tiap
konsentrasi, campur homogen

Ditambah 2,0 ml TCA 20% dengan vortexing

Disentrifuge (10 menit, 2500 rpm), diambil 1,5 ml beningan

Dalam tiap labu takar ditambahkan: 0,5 ml HCl dan 1,0 NaNO2 10%
Diamkan di tempat dingin (suhu <150 C)
Ditambah 1,0 ml Asam Sulfamat 15% melalui dinding tabung dan 3,5 ml
NaOH 10% di ad dengan aquadest, dipindah ke kuvet

Diukur panjang gelombang maksimal


(λ 380-580 nm) & waktu Paracetamol yang memberikan absorbansi tetap

3. Pemrosesan Sampel Darah

250 µl darah yang mengandung Heparin, ditambah larutan stok hingga kadar
0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 µg/ml dalam tabung sentrifuge

Ditambahkan 2,0 ml TCA 20% dengan vortexing

Campuran disentrifuge 500 rpm selama 10 menit; diambil 1,5 beningan

Dalam tiap labu takar ditambahkan:


0,5 ml HCl 6N dan 1,0 ml NaNO2 campur homogen, diamkan 15 menit di
tempat dingin

Ditambah 1,0 ml Asam Sulfamat 15% melalui dinding tabung dan 3,5 ml
NaOH 10% di ad dengan aquadest

Diukur absorbansi pada panjang gelombang maksimal


4. Pembuatan Kurva Baku Paracetamol

Diukur absorbansi semua larutan Paracetamol pada λ maks

Dibuat kurva hubungan antara resapan terhadap kadar masing-masing

Dibuat persamaan menggunakan kuadrat terkecil y= bx+a dan hitung nilai r


dari grafik

5. Menentukan Perolehan Kembali, Kesalahan Acak , Kesalahan Sistematik

Ditetapkan kadar Paracetamol dari masing-masing deret baku dengan kurva


baku yang diperoleh sebelumnya

Ditetapkan recovery, kesalahan acak dan kesalahan sistemik


E. Data Pengamatan

 λ maks DAN OT
Asam Salisilat Paracetamol (PCT)
λmaks : 428 nm λmaks : 416,5 nm
OT : 8 menit OT : 7 menit

 Hasil Absorbansi
1. Absorbansi Baku Asam Salisilat
Konsentrasi Absorbansi
24,94 2,466
49,88 2,466
74,82 2,466
100,19 2,498
124,7 2,591
Regresi linier
A : 2,41299
B : 1,12684 x 10-3
r : 0,82236
y = bx+a
y = 1,12684 x 10-3 X+ 2,41299

Kurva Baku Konsentrasi (μg/ml) VS


Absorbansi Asam Salisilat
2.6
2.58
2.56
Absorbansi

2.54
2.52
2.5
2.48
2.46
2.44
0 20 40 60 80 100 120 140

Konsentrasi (ppm)
2. Absorbansi Baku Paracetamol
Konsentrasi Absorbansi
0 0
104,4 0,197
208,8 0,338
313,2 0,229
417,6 0,421
522 0,452
626,4 0,480
730,8 0,547
Regresi linier
a = 0,09225
b = 6,5887 x 10-4
r = 0,9304
y=bx+a
y=6,5887 x 10-4 X + 0,09225

Kurva Baku Konsentrasi (μg/ml) VS


Absorbansi PCT
0.6
0.5
0.4
Absorbansi

0.3
0.2
0.1
0
0 200 400 600 800

Konsentrasi (ppm)
F. Perhitungan
1. Asam salisilat
50 𝑚𝑔 1 𝑚𝑔
Larutan Asam Salisilat= = = 1000μg/ml = 1000 ppm
50 𝑚𝑙 1 𝑚𝑙

Penimbangan Asam Salisilat :


Kertas + zat = 0,6141 g
Kertas + sisa = 0,5064 g
Zat = 0,1077 g
= 107,7 mg
107,7 𝑚𝑔 𝑚𝑔 μg
Koreksi Kadar = = 2,15 = 2150 = 2150 ppm
50 𝑚𝑙 𝑚𝑙 ml

Pembuatan Deret Baku Asam Salisilat


Konsentrasi Perhitungan Koreksi kadar
25 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2
V1.2150μg/ml = 5000μL.25μg/ml 58μl.2150 μg/ml = 5000 μl.C2
V1 = 58,14μL C2 = 24,94μg/ml
Darah = 500μL- 58μL= 442μL
50 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2
V1.2150μg/ml = 5000μL.50μg/ml 116μl.2150 μg/ml = 5000
V1 = 116,28μL μl.C2
Darah = 500μL- 116μL= 384 μL C2 = 49,88μg/ml
75 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2
V1.2150μg/ml = 5000μL.75μg/ml 174μl.2150 μg/ml = 5000
V1 = 174,42μL μl.C2
Darah = 500μL- 174μL= 326 μL C2 = 174,82μg/ml
100 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2
V1.2150μg/ml = 233μl.2150 μg/ml = 5000
5000μL.100μg/ml μl.C2
V1 = 232,56μL C2 = 100,19μg/ml
Darah = 500μL- 233μL= 267 μL

125 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2


V1.2150μg/ml = 290μl.2150 μg/ml = 5000
5000μL.125μg/ml μl.C2
V1 = 290,70μL C2 = 124,7μg/ml
Darah = 500μL- 290μL= 210 μL

Perhitungan recovery, kesalahan sistematik, kesalahan acak Asam Salisilat


1. Recovery
Replikasi I
Konsentrasi Absorbansi Recovery
𝑥̂ =75,4411 𝜇g/ml
40 (49,88) 2,498 75,4411 𝜇g/ml
%P = 𝑥 100% = 151,24%
49,88 𝜇g/ml

𝑥̂ = 123,3627 𝜇g/ml
123,3627𝜇g/ml
75 (74,82) 2,552 %P = 𝑥 100% = 164,88%
74,82 𝜇g/ml

𝑥̂ = 157,9727 𝜇g/ml
100 (100,19) 2,591 157,9727𝜇g/ml
%P = 𝑥 100% = 157,67%
100,19 𝜇g/ml

Replikasi II
Konsentrasi Absorbansi Recovery
𝑥̂ =75,4411 𝜇g/ml
40 (49,88) 2,498 %P =
75,4411 𝜇g/ml
𝑥 100% = 151,24%
49,88 𝜇g/ml

𝑥̂ = 47,0431 𝜇g/ml
47,0431𝜇g/ml
75 (74,82) 2,466 %P = 𝑥 100% = 62%
74,82 𝜇g/ml

𝑥̂ = 75,4411 𝜇g/ml
100 (100,19) 2,498 75,4411 𝜇g/ml
%P = 𝑥 100% = 75,30%
100,19 𝜇g/ml
2. Kesalahan Sistematik
Replikasi I
Konsentrasi P% Kesalahan Sistematik
100% − 𝑃%
40 (49,88)
100%-151,24% = -51,24%
151,24
100% − 𝑃%
75 (74,82)
100% − 164,88% = −64,88%
164,88
100% − 𝑃%
100 (100,19)
100% − 157,67% = −57,67%
157,67

Replikasi II
Konsentrasi P% Kesalahan Sistematik
100% − 𝑃%
40 (49,88)
100%-151,24% = -51,24%
151,24
100% − 𝑃%
75 (74,82)
100% − 62% = 38%
62
100% − 𝑃%
100 (100,19)
100% − 75,30% = −24,70%
75,30

3. Kesalahan acak
a). Konsentrasi 49,88 μg/ml
Rata-rata = 75,4411
SD= 0
𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢
KA= ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑋 100%
0
= 75,4411 𝑋 100% = 0 %

b). Konsentrasi 74,82 μg/ml


Rata-rata = 85,2029
SD= 53,9661
𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢
KA= ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑋 100%
53,9661
= 𝑋 100% = 63,34 %
85,2029

c). Konsentrasi 100,19 μg/ml


Rata-rata = 116,7069
SD= 58,3586
𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢
KA= ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑋 100%
58,3586
= 116,7069 𝑋 100% = 50 %

2. Paracetamol
100 𝑚𝑔 𝑚𝑔
Konsentrasi stok = 1 𝑚𝑙 = 1000 𝜇g/ml
100 𝑚𝑙

Penimbangan PCT :
Kertas + zat = 0,6062 g
Kertas + sisa = 0,5018 g
Zat = 0,1044 g
= 104,4 mg
104,4 𝑚𝑔 𝑚𝑔 μg
Koreksi Kadar = = 1,044 𝑚𝑙 = 1044 ml = 1044 ppm
100 𝑚𝑙

Pembuatan deret baku Paracetamol


Konsentrasi Perhitungan Koreksi kadar
100 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2
V1.1000μg/ml = 500μg.100μg/ml 50μl.1044 μg/ml = 500 μl.C2
V1 = 50μL C2 = 104,4 μg/ml
Darah = 500μL- 50μL= 450 μL
200 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2
V1.1000μg/ml = 500μg.200μg/ml 100μl.1044 μg/ml=500 μl.C2
V1 = 100μL C2 = 208,8 μg /ml
Darah = 500μL- 100μL= 400 μL
300 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2
V1.1000μg/ml = 500μg.300μg/ml 150μl.1044.μg/ml=500 μl.C2
V1 = 150μL C2 = 313,2 μg /ml
Darah = 500μL- 150μL= 350 μL
400 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2
V1.1000μg/ml = 500μg.400μg/ml 200μl.1044μg/ml =500 μl.C2
V1 = 200μL C2 = 417,6 μg /ml
Darah = 500μL- 200μL= 300 μL
500 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2
V1.1000μg/ml = 500μg.500μg/ml 250μl.1044 μg/ml=500 μl.C2
V1 = 250μL C2 = 522 μg /ml
Darah = 500μL- 250μL= 250 μL
600 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2
V1.1000μg/ml = 500μg.600μg/ml 300μl.1044 μg/ml=500 μl.C2
V1 = 300μL C2 = 626,4 μg /ml
Darah = 500μL- 300μL= 200 μL
700 𝝁g/ml V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2
V1.1000μg/ml = 500μg.700μg/ml 350μl.1044 μg/ml=500 μl.C2
V1 = 350μL C2 = 730,8 μg /ml
Darah = 500μL- 350μL= 150 μL

Perhitungan recovery, kesalahan sistematik, kesalahan acak Paracetamol


1. Recovery
Konsentrasi Absorbansi Recovery
104,4 𝝁g/ml 0,381 𝑥̂ = 418,4104 𝜇g/ml
418,4104𝜇g/ml
%P = 𝑥 100% = 400,78%
104,4 𝜇g/ml

0,358 𝑥̂ = 375,2288𝜇g/ml
375,2288𝜇g/ml
%P = 𝑥 100% = 359,41%
104,4 𝜇g/ml

313,2 𝝁g/ml 0,256 𝑥̂ = 183,7281𝜇g/ml


183,7281𝜇g/ml
%P = 𝑥 100% = 58,66%
313,2 𝜇g/ml

0,302 𝑥̂ = 270,0912 𝜇g/ml


270,0912 𝜇g/ml
%P = 𝑥 100% = 86,24%
313,2𝜇g/ml

522 𝝁g/ml 0,399 𝑥̂ = 452,2046𝜇g/ml


452,2046𝜇g/ml
%P = 𝑥 100% = 86,63%
522 𝜇g/ml

0,541 𝑥̂ = 714,8037 𝜇g/ml


714,8037 𝜇g/ml
%P = 𝑥 100% = 136,94%
522 𝜇g/ml
2. Kesalahan Sistematik
Konsentrasi P% Kesalahan Sistematik
100% − 𝑃%
100% −400,78% = −300,78%
100 (104,4) 400,78
100% − 𝑃%
100% − 359,41% = −259,41%
359,41
100% − 𝑃%
100% − 58,66% = 41,34%
58,66
300 (313,2)
86,24 100% − 𝑃%
100% − 86,24% = 13,76%
86,63 100% − 𝑃%
100% − 86,63% = 13,37%
500 (522)
136,94 100% − 𝑃%
100% − 136,94% = −36,94%

3. Kesalahan Acak
a). Konsentrasi 104,4 μg/ml
Rata-rata = 396,8196
SD = 30,534
𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢
KA = ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑋 100%
30,534
= 396,8196 𝑋 100% = 7,69 %

b). Konsentrasi 313,2 μg/ml


Rata-rata = 227,2096
SD= 61,4922
𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢
KA= 𝑋 100%
ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎
61,4922
= 227,2096 𝑋 100% = 27,06 %

c). Konsentrasi 517,5 μg/ml


Rata-rata = 583,5042
SD= 185,6856
𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢
KA= ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑋 100%
185,6856
= 583,5042 𝑋 100% = 31,82 %
G. Pembahasan
Percobaan kali ini adalah Optimasi Metode Analisa Obat yang bertujuan
untuk memahami langkah-langkah analisa obat di dalam darah dan untuk
mengetahui kevalidan dari suatu metode yang digunakan dalam menetapkan kadar
suatu obat dalam darah. Jika suatu metoda telah dinyatakan valid, maka parameter-
parameter farmakokinetik yang diperoleh dari metode tersebut juga dapat
dipercaya.

Suatu metode dapat dikatakan valid apabila memenuhi beberapa kriteria


diantaranya sensitivitas, spesifitas, akurat, presisi, dan praktis. Sensitivitas artinya
bahwa metode yang digunakan dapat menetapkan kadar senyawa dalam
konsentrasi yang kecil. Spesifisitas artinya bahwa metode tersebut hanya dapat
digunakan untuk menetapkan kadar dari senyawa yang kita inginkan. Akurat yaitu
dari pengukuran menggunakan metode tertentu dapat dihasilkan nilai rata-rata yang
mendekati nilai sesungguhnya. Presisi adalah dari suatu seri pengukuran didapat
hasil satu sama lain yang hamper sama. Praktis yaitu metode yang akan dilakukan
mudah,tidak memerlukan waktu pengerjaan yang lama dan dilihat dari segi
ekonomi metode tersebut tidak memerlukan biaya yang banyak.

Adapun obat yang digunakan saat praktikum adalah Paracetamol dan Asam
salisilat. Hewan uji yang digunakan adalah tikus. Langkah awal yang dilakukan
adalah pengambilan darah tikus, yang berfungsi media dalam pengukuran kadar
obat dalam tubuh tikus. Pada praktikum ini obat tidak dimasukkan dalam tubuh
tikus, melainkan ditambahkan diluar tubuh tikus. Pengambilan darah pada tikus
diambil dari ekor tikus caranya dengan melukai ekor tikus menggunakan scalpel.
Darah yang sudah diperhitungkan kebutuhannya kemudian ditapung dalam
evendrop yang didalamnya telah diberi heparin.

Heparin merupakan antikoagulan yang diberikan secara parenteral. Fungsi


dari heparin ini adalah untuk mencegah terjadinya penggumpalan darah atau
sebagai zat antikoagulan. Jika sampel darah yang diambil mengalami koagulasi
atau menggumpal maka yang akan keluar adalah serumnya, sedangkan yang
digunakan untuk pemeriksaan adalah plasma darah karena obat akan berinteraksi
dengan protein plasma untuk membentuk suatu kompleks obat-makromolekul yang
sering disebut ikatan obat-protein. Dengan kata lain maka percobaan tidak dapat
dilakukan bila darah mengalami penggumpalan. Efek antikoagulan heparin timbul
karena ikatannya dengan AT-III berfungsi menghambat protease faktor pembekuan
termasuk faktor IIa (thrombin), Xa dan IXa, dengan cara membentuk komplek
yang stabil dengan protease pembekuan. Heparin yang terikat dengan AT-III
mempercepat pembekuan kompleks sampai 100 kali. Bila kompleks AT-
III protease sudah terbentuk, heparin dilepaskan untuk selanjutnya membentuk
ikatan baru dengan membentuk antitrombin.

Asam Salisilat

Asam salisilat berbentuk jarum halus atau serbuk hablur putih. Memiliki
berat molekul sebesar 138,12 g/mol. Sukar larut dalam air dan benzena; mudah
larut dalam etanol dan dalam eter; larut dalam air mendidih; agak sukar larut dalam
kloroform. Sampel darah yang telah diambil dan diberi heparin, kemudian
divortex. Diambil sejumlah darah dan larutan stok Asam salisilat yang dibutuhkan,
dibuat dengan kadar 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm dan 125 ppm dalam 500 μl.
Ditambah TCA 5% sebanyak 1,0 ml. Larutan disentrifuge 2500 rpm selama
10 menit. Diambil supernatan 0,5 ml dan ditambahkan 4,5 ml Pereaksi Trinder.
Pereaksi yang digunakan yaitu FeCl3. Fungsinya untuk pembentukan kompleks
warna ungu dan digunakan untuk mengendapkan protein. Dipindahkan ke kuvet
dan dilakukan pengukuran menggunakan spektrofotometer UV karena range
resapan asam salisilat adalah 400 –600 nm.
Pada penentuan panjang gelombang maksimal, diperoleh panjang
gelombang untuk Natrium salisilat yaitu 428 nm dengan OT 8 menit. Tujuan
penentuan panjang gelombang maksimal antara lain pada panjang gelombang yang
maksimal kepekaannya juga akan maksimal. Disekitar panjang gelombang
maksimal bentuk kurva serapan datar dan pada kondisi tersebut akan memenuhi
hukum lambert-beer. Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang
disebabkan oleh pengukuran ulang panjang gelombang akan kecil.
Penentuan kurva baku dari asam salisilat, pada pembuatan digunakan kurva
baku internal. Fungsi utama dari pembuatan kurva baku adalah untuk
menggambarkan hubungan antara konsentrasi dan absorbansi terhadap masing-
masing kadar. Persamaan kurva baku yang diperoleh y = 1,12684.10-3x+2,41299.
Hal ini dikarenakan kurang ketelitian praktikan dalam melakukan percobaan,
dimana uji yang dilakukan adalah uji kuantitatif sehingga perlu ketelitian dalam
menjalankan prosedur yang ada, seperti ketepatan dalam pemipetan dan ketepatan
penambahan reagen.
Data recovery pada konsentrasi 49,88 μg/ml diperoleh persen yang sama
pada 2 replikasi yaitu 151,24%. Pada konsentrasi 74,82 μg/ml data recovery yang
didapat yaitu 164,88% dan 62%. Dan pada konsentrasi 100,19 μg/ml data recovery
yang didapat yaitu 157,67% dan 75,30%. Berdasar data recovery metode analisa
pada analisis asam salisilat tidak valid karena diatas persyaratan 75-90%. Pada
konsentrasi 74,82 μg/ml data recovery belum memnuhi persyaratan, karena kurang
dari 75%. Untuk kesalahan sistematik diperoleh hasil negatif pada tiap konsentrasi.
Sedangkan untuk kesalahan acak persen semua hasilnya melebihi persyaratan 10%.

Paraetamol

Parasetamol memiliki sebuah cincin benzena, tersubstitusi oleh satu gugus


hidroksil dan atomnitrogen dari gugus amida pada posisi para (1,4). Senyawa ini
dapat disintesis dari senyawa asal fenol yang dinitrasikan menggunakan asam
sulfat dan natrium nitrat.
Langkah awal pada analisis obat paracetamol sama dengan analisis pada asa
salisilat. Awalnya dilakukan pengambilan darah tikus, yang berfungsi media dalam
pengukuran kadar obat dalam tubuh tikus. Kemudian dilakukan pembuatan kurva
baku dengan konsentrasi 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 μg/ml dengan
masing-masing konsentrasi membutuhkan volume darah hingga 500 µl. Untuk
penetapan panjang gelombang maksimal didapat pada 416,5 nm dan operating time
parasetamol 8 menit.
Darah yang sebelumnya ditambah heparin dan baku induk parasetamol
dicampur homogen kemudian divortexing. Ditambah dengan 2,0 ml TCA 20%,
kemudian di vortexing lagi. Penambahan TCA berfungsi sebagai senyawa yang
dapat menghentikan kerja enzim yang dapat memetabolisme obat sekaligus akan
menyebabkan denaturasi protein plasma. Campuran tadi dimasukkan dalam alat
sentrifuge untuk mengendapkan darah dan didapatkan plasmanya. TCA akan
mengikat protein dan mengendapkannya saat sentrifugasi sehingga keberadaan
protein tidak mengganggu pembacaan absorbansi.
Endapan akan terpisah pada bagian bawah dan pada supernatan terdapat
cairan bening yaitu plasma darah. Kemudian supernatannya diambil 1,5 ml dan
dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 ml. Setelah itu ditambahkan HCl 6 N
sebanyak 0,5 ml dan 1,0 ml NaNO2 10%. Penambahan HCl ini dimaksudkan untuk
memberikan suasana asam dalam pembentukan reaksi diazotasi antara parasetamol
dengan NaNO2. Penambahan HCl dan NaNO2 akan membentuk reaksi diazotasi
yang tidak tahan terhadap suhu kamar. Karena pada suhu kamar garam diazonium
akan dengan mudah terdegradasi menjadi senyawa fenol dan gas nitrogen. Oleh
sebab itu, perlu dilakukan perendaman selama 15 menit ditempat dingin (suhu
<15oC) dengan merendamnya dalam es.
Kemudian ditambahkan 1,0 ml asam sulfamat 15% melalui dinding tabung.
Tujuan dari perlakuan ini adalah menghilangkan HNO2 yang berlebih. Asam
sulfamat juga akan menghilangkan gas N2 secara perlahan dengan diberikan
getaran ultrasonik pada larutan. Gas N2 hilang ditandai dengan berkurangnya
gelembung gas yang terbentuk. Apabila gas N2 ini tidak hilang, maka akan
mengganggu pengukuran absorbansi. Kemudian ditambahkan NaOH 10%
sebanyak 3,5ml kedalamnya. Hal ini bertujuan untuk memperpanjang gugus
kromofor (pembentukan kompleks) yang ditandai dengan terbentuknya warna
kuning.
Pembuatan kurva baku paracetamol ini dilakukan dengan membaca
absorbansi larutan paracetamol dari konsentrasi 100-700 μg/ml pada panjang
gelombang maksimal 416,5 nm. Dan didapatkan persamaan kurva baku y =
6,5887.10-4x+0,09225. Persamaan kurva baku ini digunakan untuk menghitung
perolehan kembali atau recovery.
Data recovery pada konsentrasi 104,4 μg/ml yaitu 400,78% dan 359,41%
Pada konsentrasi 313,2 μg/ml data recovery yang didapat yaitu 58,66% dan
86,24%. Dan pada konsentrasi 522 μg/ml data recovery yang didapat yaitu 86,63%
dan 136,94%. Berdasar data recovery metode analisa pada analisis paracetamol
tidak valid karena diatas persyaratan 75-90%. Hasil kesalahan sistematis dan acak
menunjukkan hasil melebihi persyaratan 10%. Pada kesalahan sistematis diperoleh
nilai persen negatif pada konsentrasi 104,4 μg/ml.
H. Kesimpulan
a. Panjang gelombang maksimum Asam Salisilat 428 nm & Paracetamol 416,5 nm.
b. Operating time Asam salisilat 8 menit & Paracetamol 7 menit.
c. Persamaan garis pada Asam Salisilat y = 1,12684 .10-3 x + 2,41299.
d. Persamaan garis pada Paracetamol y = 6,5887.10-4 x + 0,09225.
e. Nilai recovery pada Asam Salisilat konsentrasi 74,82 μg/ml replikasi kedua
<75%.
f. Nilai recovery pada Paracetamol konsentrasi 313,2 μg/ml replikasi pertama
<75%.
g. Nilai kesalahan sistematis pada Asam Salisilat konsentrasi 74,82 μg/ml replikasi
kedua >10%.
h. Nilai kesalahan sistematis pada Paracetamol konsentrasi 313,2 μg/ml pada kedua
replikasi dan 522 μg/ml replikasi pertama >10%.
i. Kesalahan acak pada Asam Salisilat yaitu 0%; 63,34%; dan 50%.
j. Kesalahan acak pada Paracetamol yaitu 7,69%; 27,06%; dan 31,82%.

I. Daftar Pustaka
Shargel. Leon dan B.C.Andrew.2005.Biofarmasetika dan Farmakokinetika
Terapan.. Surabaya: Airlangga University Press
Gholib Gandjar, Ibnu, Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:
Pustaka Pelajar
Joenoes, N. Zaman. 2006. Ars Prescribendi Resep yang Rasional Edisi ke-3.
Surabaya:Airlangga University Press
Lachman, L, H.A Liebermen., Joseph L.K. 2007. Teori dan Praktek Farmasi
Industri 2 Edisi Ke-3. Jakarta:UI Press
Sudarmadji, dkk. 1996. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta:
Penerbit Liberty
Mulja, M., Suharman. 1995. Analisis Instrumental. Surabaya:Airlangga University
Press
Semarang, 16 September 2016

Dosen Pembimbing Praktikan

Kyky Herliyanti, M. Sc., Apt. Ade Vinska Rahmawati (1041411001)

Mutmainah, M. Sc., Apt. Anisa Diniarti (1041411020)

Dewi Sukmasari (1041411163)

Dara Camelia (1041511036)


LAMPIRAN PIKET

1. HCl 6N 50 ml
% ×𝐵𝐽 ×𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑠𝑖 ×1000
N= 𝑀𝑟

32 ×1,18 ×1 ×1000
= 36,46

= 10,3566 N

V1 . N1 = V2 . N2

V1 . 10,3566 N = 50 ml . 6

V1 = 28,97 ml

Cara pembuatan :

1) Diukur HCl(p) 28,97 ml, dimasukkan ke dalam beakerglass 50 ml yang berisi 1/3
bagian aquadest.
2) Ditambah dengan aqudest ad 50 ml, dihomogenkan.

2. NaNO2 10% 50 ml
10 𝑔
NaNO2 = 100 𝑚𝑙 × 50 ml = 5 g

Cara pembuatan :

1) Ditimbang NaNO2 5 gram, dimasukkan ke dalam beakerglass 50 ml.


2) Ditambah dengan aqudest ad 50 ml, dihomogenkan.

3. Asam sulfamat 15% 50 ml


15 𝑔
Asam sulfamat = 100 𝑚𝑙 × 50 ml =7,5 g

Cara pembuatan :

1) Ditimbang Asam sulfamat 7,5 gram, dimasukkan ke dalam beakerglass 50 ml.


2) Ditambah dengan aqudest ad 50 ml, dihomogenkan.
4. NaOH 10% 100 ml
10 𝑔
NaOH = 100 𝑚𝑙 × 100 ml = 10 g

Cara pembuatan :

1) Ditimbang NaOH 10 gram, dimasukkan ke dalam beakerglass 100 ml.


2) Ditambah dengan aqudest ad 100 ml, dihomogenkan.

5. Asam Trikloroasetat (TCA) 20% 100 ml


20 𝑔
TCA = 100 𝑚𝑙 × 100 ml = 20 g

Cara pembuatan :

1) Ditimbang TCA 20 gram, dimasukkan ke dalam beakerglass 100 ml.


2) Ditambah dengan aqudest ad 100 ml, dihomogenkan.

6. FeCl3 5% 100 ml
5𝑔
FeCl3 = 100 𝑚𝑙 × 100 ml = 5 g

Cara pembuatan :

1) Ditimbang FeCl3 5 gram, dimasukkan ke dalam beakerglass 100 ml.


2) Ditambah dengan aqudest ad 100 ml, dihomogenkan.

Anda mungkin juga menyukai