CD133 es un modificador de las frecuencias progenitoras hematopoyéticas, pero es prescindible

para el mantenimiento de células madre hematopoyéticas de ratón.

Resumen
La glucoproteína prominina-1 de pentatransmembrana (CD133) se expresa en la superficie celular de
múltiples células madre somáticas, y se usa ampliamente como marcador de superficie celular para el
aislamiento y caracterización de células madre hematopoyéticas humanas (HSC) y células madre de
cáncer. CD133 se ha vinculado sobre una base biológica celular a las decisiones sobre el destino de
las células madre en las HSC humanas y surge como un importante regulador fisiológico del
mantenimiento y la expansión de las células madre. Su expresión y relevancia fisiológica en el sistema
hematopoyético murino es, sin embargo, difícil de alcanzar. Aquí mostramos que CD133 se expresa
por HSC murinas residentes en la médula ósea y células precursoras mieloides con la propensión al
desarrollo para dar lugar a granulocitos y monocitos. Sin embargo, CD133 es prescindible para el
tamaño de la piscina y la función de las HSC durante la hematopoyesis en estado estable y después
del trasplante, lo que demuestra una diferencia sustancial de especies entre el ratón y el hombre. Los
números de células sanguíneas en la periferia son normales; sin embargo, CD133 parece ser un
modificador para el desarrollo de células precursoras mielo eritroides sensibles al factor de crecimiento
en la médula ósea en estado estable y en los glóbulos rojos maduros después del estrés
hematopoyético. En conjunto, estos estudios muestran que CD133 no es un regulador crítico de la
función de las células madre hematopoyéticas en el ratón, sino que modifica las frecuencias de las
células progenitoras hematopoyéticas sensibles al factor de crecimiento durante el estado de equilibrio
y después del estrés mielo tóxico in vivo.
INTRODUCCION
Las células madre hematopoyéticas (HSC) proporcionan continuamente suministro de células
sanguíneas maduras recién generadas por células asimétricas división a través de una serie de
intermediarios celulares (revisado en árbitro. 1). A nivel biológico celular, pérdida de proliferación /
diferenciación. Opciones en una célula hija es el sello funcional de división asimétrica, y se sugirió
que se asocie con distribución no homogénea de proteínas durante la división celular, para por
ejemplo, en células madre neurales de mamíferos (2, 3), línea germinal masculina células madre de
la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (4), y humana HSCs (5).
Prominin-1 (CD133) es un enlace de colesterol que abarca cinco transmembranas proteína
expresada en numerosas células madre somáticas, en particular las HSC humanas y las células
progenitoras hematopoyéticas (HPC) (6-10) (revisadas en las referencias 11, 12). De hecho, CD133
se usa ampliamente como un antígeno de la superficie celular para aislar prospectivamente las HSC
humanas que pueden reconstituir la hematopoyesis tras el trasplante en ratones (13,14), ovejas (9) y
humanos (15). Además de las HSC derivadas de la sangre del cordón umbilical, la médula ósea y
los productos de aféresis (13, 14, 16), se detecta CD133 en células cancerosas de diversas
enfermedades hematopoyéticas malignas, incluidas leucemias mieloides y linfoblásticas agudas y
crónicas (revisadas en la ref. 17) y sólidos. cánceres (18).
Desde un punto de vista biológico celular, CD133 es un marcador único de ambos plasma
protuberancias de membrana (6, 8) y micro dominios de membrana basados en colesterol (19, 20) y
podrían heredarse diferencialmente a células hijas tras la división celular como se demostró en
células madre neurales murinas (2), HSC humanas (11, 12) y humanos Células de cáncer de pulmón
y cerebro (21, 22). Además, un enlace entre la distribución de células asimétricas de CD133 y el
destino celular se ha demostrado elegantemente en las células madre neurales (2). El nivel de
complejidad para comprender el papel biológico de CD133 en células madre ha sido recientemente
incrementado por el hallazgo de que pequeñas células de membrana que contienen CD133 pueden
ser liberadas de HSCs humanas y células madre neurales durante el proceso de diferenciación (23).
Independientemente de los mecanismos celulares subyacentes a la disminución o pérdida de CD133
(24), se ha propuesto que los microdominios de membrana que contienen CD133 podrían actuar
como plataformas de transducción de señales específicas de células madre, y su reducción
conducirá de alguna manera a la diferenciación celular (23, 25). En estos contextos, aún se
desconoce si el CD133 en sí mismo es importante para las decisiones de destino del HSC y / o para
la hematopoyesis en el ratón.
En el presente estudio, hemos investigado la influencia de CD133 en el mantenimiento de HSC y la
hematopoyesis utilizando ratones knockout (KO) de tipo salvaje y CD133 (26). Los últimos animales
son viables y fértiles, pero se ven afectados por una degeneración de la retina que conduce a la
ceguera (26). No se informaron defectos hematopoyéticos obvios en ratones CD133 KO, aunque
este problema no se investigó enérgicamente (26). Aquí, demostramos que CD133 es expresado por
HPC de ratón pero que la purificación de HSC basada en la proteína CD133 no es posible, lo que
sugiere una diferencia sustancial de especies para el papel de CD133 en HSCs. Además, la función
de HSC en estado estable y después del trasplante es independiente de la expresión de CD133. Sin
embargo, CD133 es un modificador para el desarrollo adecuado de las células progenitoras
mieloides sensibles al factor de crecimiento durante el estado estacionario y de los glóbulos rojos
maduros después del estrés mielo tóxico in vivo.
Figura 1.
Expresión de CD133 en HSCs / HPCs de
ratón y sus efectos en el número de células
madre o progenitoras. ( A ) Análisis de
expresión cuantitativa de CD133 por las
poblaciones de células purificadas indicadas
(KSL, LT-HSC, ST-HSC, MPP, MP, MEP,
CMP, GMP) o células de médula ósea total
(BM) de ratones de tipo salvaje. Los
resultados muestran la media ± SD de la
expresión de transcripción de CD133 en
relación con las transcripciones de β-actina
( Actb ) ( n = 2). ( B ) Los gráficos de puntos
muestran la expresión de CD133 en KSL
( Upper ) o MP ( Lower ) de ratones de tipo
salvaje (wt) ( Izquierda ) y CD133 KO (KO)
( Centro ). Se representa la tinción del
anticuerpo de control de isotipo en células de
tipo salvaje ( derecha ). La población de KSL también se resuelve discriminando entre MPP y ST-
HSCs (ST) más LT-HSCs (LT) ( Superior ), y la población de MP se resuelve aún más discriminando
entre GMP y MEP más CMP ( Inferior). Los datos son representativos de ocho ratones KO de tipo
salvaje y ocho CD133 analizados en dos experimentos independientes. En todos los ratones de tipo
salvaje, la expresión de la superficie celular CD133 solo se detectó en una fracción de GMP (2.7 ±
0.9%, n = 8). ( C ) Los gráficos de puntos muestran la expresión de Kit frente a Sca-1 en células de
linaje negativo (Lin - ) ( izquierda ), CD135 frente a CD34 en células KSL (Centro ) y CD16 / 32 frente
a CD34 en parlamentarios de tipo salvaje (wt ) ( Superior ) y CD133 KO (KO) ( Inferior ) ratones. Los
datos son representativos de 15 ratones por genotipo analizados en tres experimentos
independientes para KSL, y 11 ratones de tipo salvaje y 9 CD133 KO analizados en dos
experimentos independientes para el análisis de MP. Los datos se cuantifican en D. ( D ) Las
gráficas muestran los números de células BM y las frecuencias de LT-HSCs (LT), ST-HSCs (ST) y
MPPs o progenitores linfoides comunes (CLPs) y MPs separados en MEPs, CMPs y GMPs en tipo
salvaje ratones (wt) (círculos cerrados) y CD133 KO ratones (KO) (círculos abiertos) como se
muestra en C. Los datos se agrupan de tres experimentos independientes que utilizan 20 ratones
por genotipo para los números de células BM, 15 ratones por genotipo para el análisis KSL, y 11
ratones KO de tipo salvaje y 9 CD133 para el análisis de CLP y MP. Los resultados representan
medias ± SD. ns, no significativo.
Resultados

CD133 se expresa mediante HSC murino y monocitos de granulocitos células progenitoras.

Descifrar el papel del CD133 en el mouse HSC biología y hematopoyesis documentamos por
primera vez su expresión génica por PCR cuantitativa en células progenitoras. Transcripciones
CD133 fueron expresado fuertemente en células de la médula ósea total y, a un nivel más bajo,
en células Kit + Sca-1 + Lineage– (KSL) que contienen HSC (Fig. 1A).
Los fraccionamientos de células KSL en largo plazo (LT) y corto plazo (ST) HSC y células
progenitoras multipotentes (MPP) (Fig. S1) (27–29) reveló que todos los subconjuntos contenían
bajos niveles de transcripciones de CD133 (Fig. 1A). Asimismo, las células precursoras restringidas
para diferenciarse en células mieloides, progenitores mieloides (MP), se separaron en progenitores
eritroides de megacariocitos (MPE), parlamentarios comunes (CMPs), y progenitores de monocitos
de granulocitos (GMPs) (30), fuera de los cuales CD133 se expresó principalmente en GMP y en un
nivel bajo en CMPs y MEPs. De acuerdo con la expresión del ARNm niveles, detectamos la
expresión en la superficie celular de la proteína CD133 principalmente en células GMP (Fig. 1B).
Para investigar un papel potencial de CD133 en la función de tallo hematopoyético y progenitor
Células, analizamos frecuencias y números de HSCs / HPCs en ratones deficientes para CD133 (26)
y controles de tipo salvaje (Fig. 1 C y RE). Frecuencias de células KSL y otras subpoblaciones, y las
células progenitoras mieloides o linfoides eran idénticas en el tipo salvaje y ratones CD133 KO. En
conclusión, la expresión de la superficie celular de CD133 se detectó exclusivamente en GMP pero
no parecía requerido para el desarrollo de sus números de células normales.

La funcionalidad de los LT-HSC es independiente de la expresión de CD133.

Determinar si la falta de proteína CD133 tiene consecuencias funcionales en compartimentos
hematopoyéticos, realizamos una serie de experimentos de trasplante. Primero, CD133 KO o tipo
salvaje células de la médula ósea empobrecidas en el linaje se trasplantaron juntas con las células
de la médula ósea Lin− de tipo salvaje competidoras en cinco ratones receptores consecutivos, y se
monitorizó su injerto con el tiempo (fig. 2). La composición de la célula donante en los puntos de
tiempo tardíos (15–18 semanas) después del trasplante fue la misma de CD133KO o de tipo salvaje
HSC en todo el injerto en primaria, secundaria, ratones receptores terciarios y cuaternarios (Fig. 2A).
Además, aporte de células donadoras de CD133 KO a neutrófilos en sangre, un compartimento Con
una alta tasa de rotación que refleja estrechamente el celular composición del compartimiento HSC
(31) se mantuvo constante durante la serie de los cuatro trasplantes sucesivos (fig. 2B). Análisis del
compartimento HSC en los destinatarios en el momento de El análisis confirmó la relación constante
de células de tipo salvaje y CD133KO (Fig. 2C), lo que indica que la falta de CD133 es prescindible
para la normal Función y expansión del HSC después del trasplante.

En segundo lugar, nos propusimos determinar si la falta de CD133 afecta la funcionalidad del nicho
de células madre porque los humanos se sugirieron células estromales positivas para CD133 para
apoyar a humanos mantenimiento HSC (32). Para ello, trasplantamos de tipo salvaje. Células de la
médula ósea en CD133 KO letalmente irradiado o de tipo salvaje ratones y analizaron la calidad y
cantidad de reconstitución hematopoyética. (Resumido en la Fig. 3A, izquierda). Composición de la
célula donante no se vio afectado por la falta de CD133 en los ratones receptores (Fig. 3A,
Derecha), y el injerto de HSC de tipo salvaje fue comparable en ratones de tipo salvaje o receptores
CD133 (Fig. S2 A y B). Consecuentemente, contribución de las células donantes después de un
trasplante competitivo en los receptores secundarios no revelaron ningún efecto negativo por el paso
de células de tipo salvaje a través de un entorno deficiente en CD133 en el ratón receptor primario
(Fig. S2C).

En tercer lugar, para evaluar un papel potencial de CD133 en la regeneración de HSC,

trasplantamos números titulados de CD133 KO o células de tipo salvaje en ratones de tipo salvaje
irradiados letalmente y seguimos la reconstitución de los tipos de células T, B y mieloides a lo largo
del tiempo (Fig. 3B). Nuestro análisis no reveló evidencia de ningún defecto funcional en las HSC
deficientes en CD133, incluso cuando se utilizó un número menor de células donantes (Fig. 3B).
Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que la expresión de CD133 es prescindible para
la función normal de LT-HSC. De acuerdo con el homing apropiado de trasplantado CD133KO las
células en el nicho de la médula ósea, CD133 derribado en HSCs primarias humanas / HPCs no
revelaron ningún deterioro en su comportamiento migratorio. De acuerdo con el análisis anterior (33),
la eliminación mediada por interferencia de ARN de CD133 en HSC humanas (h) mostró que CD133
es prescindible tanto para la polarización morfológica como para la migración de estas células (Fig.
S3). Tras la caída de CD133, las hHSC aún exhibían varios tipos de protuberancias de la membrana
plasmática, incluidos un uropodo y un borde de ataque, dos estructuras típicas observadas en las
HSC migratorias (Fig. S3) (34). Funcionalmente, su migración es indistinguible para las muestras de
control, según lo monitoreado por la microscopía de video de lapso de tiempo. Por lo tanto, en
humanos, al igual que en el mouse, la migración de HSC no se basó en CD133.

La falta de resultados de CD133 en frecuencias reducidas de células precursoras mielo

eritroides sensibles al factor de crecimiento in vitro.
Para evaluar si la falta de expresión de CD133 en GMP afecta las frecuencias de las células
progenitoras mieloides funcionales en la médula ósea, analizamos la formación de colonias in vitro
en respuesta a GM-CSF, IL-3 más eritropoyetina (Epo), G-CSF más M-CSF más IL-3 con y sin factor
de células madre (SCF), e IL-3 o Epo solo (Fig. 4A). Encontramos una disminución de las
frecuencias progenitoras en la médula ósea de ratones CD133 KO en respuesta a IL-3 más Epo,
pero no después de la estimulación con otras citoquinas o combinaciones de las mismas (Fig. 4A), lo
que sugiere ese CD133 es un modificador de la función de los primeros progenitores de mielo
eritiroides. La falta de CD133 no tuvo efecto en la frecuencia y densidad de la expresión del receptor
de IL-3 o Epo en células de médula ósea en condiciones de estado estable o en las vías de
señalización o inducción de genes diana después de la estimulación in vitro con Epo o IL-3 (Fig. S4).
Para abordar si la falta de CD133 tiene efectos sobre las respuestas in vivo a la estimulación con
citocinas, inyectamos complejos de IL-3 y analizamos las frecuencias de progenitores
hematopoyéticos en la médula ósea. Un mayor número de basófilos maduros y progenitores de
basófilos, GMP y CMP confirmaron la efectividad de las inyecciones de complejo IL-3 (Fig. S5). Sin
embargo, la respuesta de estos tipos de células fue idéntica en ratones de tipo salvaje y CD133 KO.
En contraste, encontramos un aumento en la frecuencia de los progenitores de la médula ósea que
expresaron altos niveles de receptor de IL-3 (Fig. 4B y Fig. S4C) y, además, un aumento de la
densidad de receptores de IL-3 por célula en células de ratones CD133 KO (Fig. 4C).
Estos hallazgos sugieren que el funcionamiento incorrecto del sinergismo entre el receptor de IL-3 y
Epo causa una formación reducida de colonias in vitro y, en consecuencia, una acumulación de
células precursoras que expresan el receptor de IL-3 en la médula ósea.

Figura 2.
Las HSC deficientes en CD133 pueden
reconstituir de forma competitiva y en serie las
células inmunitarias y el compartimiento HSC de
ratones receptores irradiados. ( A ) Las barras
muestran la composición de los leucocitos
derivados de injerto (células T CD3 + , células B
B220 + y células mieloides CD11b + ) en la
sangre de primaria (1 °), secundaria (2 °),
terciaria (3 °) , y ratones receptores cuaternarios
(4 °) 15, 15.5, 16 y 17.5 semanas después del
trasplante, respectivamente. Lin - células de
médula ósea de CD133 KO o ratones de tipo
salvaje se mezclaron con Lin - células
competidoras de tipo salvaje y se trasplantaron a
ratones receptores de tipo salvaje
irradiados. Todos los genotipos se identificaron
utilizando anticuerpos específicos para diferentes
isotipos CD45. Se analizaron cinco ratones
receptores replicados para cada condición. Los
resultados representan medias ± SD. Se encontró una diferencia significativa entre las frecuencias
de células T en receptores cuaternarios ( P = 0.014). ( B ) Las gráficas muestran la diferencia de la
proporción de la contribución relativa de CD133 KO y células de tipo salvaje a neutrófilos en sangre
(PMN). Los datos se presentan como diferencia de pliegue con la mezcla inicialmente trasplantada
de HSC de tipo salvaje y CD133 KO a lo largo del tiempo. Los resultados muestran medias ± SD de
cinco ratones replicados. No se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas. ( C ) Las
gráficas muestran la diferencia de la proporción de la contribución relativa de CD133 KO o células
competidoras de tipo salvaje al compartimiento de HSC (KSL) en la médula ósea en el momento del
análisis. Se muestran los datos de todos los ratones replicados. Los puntos temporales del análisis
después del trasplante fueron los siguientes: destinatarios primarios, 24 semanas; recipientes
secundarios, 20 semanas; receptores terciarios, 16 semanas; Receptores cuaternarios, 17.5
semanas.

Fig. 3.
La composición del injerto es independiente de CD133
en células donantes o receptoras. (A) Esquema del
experimento (izquierda): los números titulados de células
de médula ósea de tipo salvaje se trasplantaron a
ratones de tipo salvaje o CD133 KO irradiados y se
controló la composición de los leucocitos del donante a lo
largo del tiempo (derecha). Los porcentajes de células T
derivadas de tipo salvaje (círculos cerrados) o CD133
derivadas de KO (círculos abiertos) (gráfica izquierda),
células B (gráfica central) y células mieloides (gráfica
derecha) se representan a lo largo del tiempo para cada
número de célula donante .En cada punto de tiempo, se
agruparon los datos de dos ratones receptores (número
de células del donante: 2 × 10 5 ) o tres (número de
células del donante: 1 × 10 6 y 5 × 10 6 ). Se indicaron
diferencias significativas. * P = 0.05-0.01; ** P = 0.01–0.001. (B) Los números titulados de células de
médula ósea de tipo salvaje o CD133 KO se trasplantaron en recipientes de tipo salvaje
irradiados. La composición de las células donantes en ratones receptores que habían recibido 2 ×
10 5 (superior) o 5 × 10 5 (inferior) células de la médula ósea se describe como se describe en A. En
cada punto temporal, los datos de cuatro receptores de células de tipo salvaje y dos receptores de
células KO CD133 (2 × 10 5 células donantes) o los datos de tres receptores de células de tipo
salvaje y cuatro receptores de células KO CD133 (5 × 10 Se muestran 5 células donantes. Las
diferencias significativas indicadas como se describe en A.

La función de LT-HSC fue independiente de la expresión del gen prominin-1 (Prom1, CD133) y, por
lo tanto, intentamos analizar la funcionalidad de las células precursoras hematopoyéticas tempranas
más allá de la etapa de HSC que precede a la etapa de GMP. La capacidad de formar colonias de
bazo visibles macroscópicamente después de la inyección en ratones de tipo salvaje irradiados
[unidad formadora de colonias (CFU-S)] se asignó principalmente a estas etapas de desarrollo (28,
35, 36) y, por lo tanto, comparó la formación de CFU-S a partir de CD133 KO y células de médula
ósea de tipo salvaje (Fig. 4D). No encontramos diferencias en la formación de colonias entre los
ratones de prueba y de control y llegamos a la conclusión de que la expresión de CD133 es
prescindible para la función de las células progenitoras hematopoyéticas tempranas.
Consistentemente, CD133 KO y ratones de tipo salvaje no mostraron diferencias en la velocidad y la
cinética de la muerte después de la irradiación letal (radio sensibilidad; Fig. 4E).
Para analizar si los mecanismos de adaptación compensan la pérdida de CD133 en el ratón adulto,
analizamos la hematopoyesis fetal en el día 14.5 embrionario (Fig. S6). Analizamos la celularidad
hepática fetal, las frecuencias de las células madre y progenitoras hematopoyéticas, la formación de
colonias in vitro y la expresión de genes clave en el desarrollo de glóbulos rojos, pero no
encontramos evidencia de un efecto de la deficiencia de CD133 en la hematopoyesis fetal.

Para analizar más a fondo si el knockout constitutivo suprime la relevancia biológica de CD133,
eliminamos CD133 en HSCs / HPCs primarios murinos. Sorprendentemente, al utilizar tres de los
cuatro ARNsh, la eliminación de CD133 en HSCs / HPCs murinos reveló un aumento en las
frecuencias de formación de colonias (Fig. S7), lo que sugiere que una manipulación aguda de la
expresión de CD133 interfiere con la capacidad de respuesta de las células precursoras. En un
nocaut completo, un mecanismo de adaptación puede funcionar como también se sugiere para
discrepancias experimentales similares encontradas para el papel de la N-cadherina en la regulación
de HSC (37, 38). Concluimos que la expresión de CD133 modifica la función normal de las células
precursoras de eritro miloide en la médula ósea murina adulta en estado estable. Sin embargo,
CD133 es prescindible para la hematopoyesis fetal y para los números y la función de las células
progenitoras adultas que preceden a la etapa de GMP.

Fig. 4.
Cambios en la formación de colonias in vitro y en la
expresión del receptor de IL-3, pero sin efecto en la
formación de CFU-S, sensibilidad a la irradiación γ y
tamaño de la agrupación de poblaciones mieloides
maduras. ( A ) Las gráficas muestran la formación de
colonias in vitro después del cultivo de células de
médula ósea KO de tipo salvaje o CD133 con GM-
CSF, IL-3 más eritropoyetina (Epo), G-CSF más M-
CSF más IL-3 con y sin SCF , IL-3, o Epo (de izquierda
a derecha). Las gráficas muestran las medias ± SD de
nueve ratones por genotipo (GM-CSF, IL-3 + Epo), seis
ratones por genotipo (Epo) y cinco ratones por
genotipo (G-CSF + M-CSF + IL-3 ± SCF, IL-3). Se
indicaron diferencias significativas. * P = 0.05-
0.01; ** P = 0.01–0.001. ( B ) El gráfico muestra la
frecuencia de las células CD123 hi en Lin - Sca-
1 - células de la médula ósea con o sin estimulación in
vivo con complejos de IL-3 (IL-3C). Los resultados muestran medias ± SD de 11 o 5 ratones por
genotipo para control de PBS o inyecciones de complejo de IL-3, respectivamente. ( C ) El gráfico
muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la expresión de CD123 en células
CD123 hi . Presentación de los datos como se describe en B. ( D ) Las colonias visibles
macroscópicamente en el bazo de los ratones receptores se contaron 8 d [(CFU-S día 8 (CFU-S d8 )]
después del trasplante de células CD133 KO o de médula ósea de tipo salvaje (BM). Las fotografías
muestran un representante Bazo receptor de cada donante. ( E ) Curva de supervivencia de ratones
de tipo salvaje (línea continua) y CD133 KO (línea discontinua) después de la irradiación letal. Los
datos se agruparon de tres experimentos independientes utilizando un total de 25 ratones de tipo
salvaje o CD133 KO. ( F ) Los gráficos de puntos muestran la expresión de CD11b vs. Gr-1, PDCA1
vs. CD11c, MHCII vs. CD11c, CD11b vs. F4 / 80, y dispersión lateral (SSC) vs. dispersión frontal
(FCS) (desde la izquierda a la derecha) en células de bazo de ratones de tipo salvaje ( superior ) y
CD133 KO ( inferior ) en células negativas para CD3, B220 y Ter119. Las flechas indican la
población que se resolvió aún más en el siguiente gráfico de puntos. cDC, convencional células
dendríticas; Eo, eosinófilos; Mono / Mp, monocitos / macrófagos; pDC, células plasmocitoides
dendríticas; PMN, neutrófilos; RP-Mp, macrófagos de pulpa roja. Da ta se resumen en e . ( G ) Los
gráficos muestran el número de células de las células del bazo, PMN, cDC, pDC, RP-Mps,
eosinófilos y monocitos / macrófagos (de izquierda a derecha) en ratones de tipo salvaje (barra
cerrada) y CD133 KO (barra abierta) identificado como se muestra en C. Se dan medias ± SD ( n = 6
ratones por genotipo).

Números normales de células mieloides maduras en el bazo de ratones CD133 KO.

A continuación, analizamos si las frecuencias reducidas de células progenitoras sensibles a IL-3 más
Epo resultan en una producción disminuida de células mieloides y eritroides maduras en condiciones
de estado estable. Frecuencias y números absolutos de mieloide maduro. Las poblaciones
(neutrófilos, eosinófilos, células dendríticas convencionales, células dendríticas plasmacitoides,
macrófagos de pulpa roja y monocitos) fueron normales en el bazo (Fig. 4F y G) de ratones CD133
KO en comparación con ratones de tipo salvaje. Además, los parámetros de leucocitos y glóbulos
rojos fueron comparables entre los de tipo salvaje y ratones CD133 KO (Tabla S1). Deducimos que
las diferencias funcionales entre las células progenitoras GMP de ratones KO de tipo salvaje y
CD133 se compensan in vivo y que CD133 tiene funciones redundantes durante la hematopoyesis
en estado estable.

Recuperación comprometida de un insulto hematopoyético en ausencia de CD133.

Las frecuencias reducidas de células precursoras mieloides sensibles al factor de crecimiento

sugieren que CD133 puede desempeñar un papel durante la hematopoyesis por estrés y, por lo
tanto, en situaciones en las que se genera un gran número de células hematopoyéticas en respuesta
a un agotamiento masivo de progenitores o células maduras (39). Para analizar el papel potencial de
CD133 en la respuesta al estrés hematopoyético, se inyectó 5-fluorouracilo (5-FU) y se analizó la
cinética de recuperación (Fig. 5).
Las células progenitoras en ciclo se agotan mediante el tratamiento con 5-FU y la hematopoyesis se
restaura a partir de LT-HSC no en ciclo (39) que pierden de forma transitoria la expresión del
receptor Kit en la superficie celular (40). La recuperación de células de médula ósea Kit-positivas se
vio afectada levemente en ausencia de CD133 en comparación con los ratones de tipo salvaje (Fig.
5A). Ocho días después de la inyección de 5-FU, aproximadamente el 17% de todas las células
inmaduras de la médula ósea expresaron el kit del receptor en ratones de tipo salvaje, mientras que
solo el 3% del compartimento con linaje negativo en el kit expresado en CD133KO sugirió que la
recuperación de las células precursoras fue retrasado (Fig. 5B). Para evaluar si las frecuencias de
los progenitores sensibles al factor de crecimiento también se alteraron en condiciones de estrés,
analizamos el crecimiento de colonias en respuesta a IL-3 más Epo en diferentes días después de la
inyección de 5-FU y encontramos que la escasez de células Lin − Kit + en el día 8 no estuvo
acompañada por frecuencias reducidas de células progenitoras mieloides (Fig. 5C). Sin embargo, las
frecuencias reducidas de células de médula ósea inmaduras tuvieron una consecuencia funcional en
la cinética de recuperación de los glóbulos rojos que muestra la recuperación retardada del
hematocrito en ratones CD133 KO en comparación con los controles (Fig. 5D). La cinética de
recuperación de las células mieloides maduras no se vio afectada (Fig. S8). En conclusión, CD133
retrasa la recuperación normal de la lesión hematopoyética después de la mieloablación.

Discusión

Las caracterizaciones moleculares y celulares del antígeno CD133 murino en el compartimiento de

la médula ósea hematopoyética destacan cuatro hallazgos. Primero, la expresión de CD133 en tipos
de células progenitoras hematopoyéticas murinas es detectable en niveles bajos, pero
aparentemente es más altamente expresada en GMP. En segundo lugar, la expresión de CD133 es
prescindible para la función de HSC durante el estado estable y durante la hematopoyesis por
estrés. En tercer lugar, se requiere CD133 para la generación de frecuencias normales de células
sensibles al factor de crecimiento en condiciones de estado estable. Cuarto, la falta de CD133 en las
células hematopoyéticas da como resultado una recuperación retardada de las células precursoras
y, como consecuencia funcional, también de los glóbulos rojos maduros en respuesta al estrés
mielotóxico.

Si bien se reconoce la expresión de CD133 por humanHSCs, incluida la relevancia terapéutica de

las células positivas a CD133 derivadas de bonemarrow, se sabe muy poco acerca de su
contraparte en el sistema de temina (8, 41). Aquí mostramos que CD133 se expresa mediante HSC
de ratón y HPC. Sin embargo, las funciones del HSC, incluido el injerto al nicho de médula ósea y
las opciones de destino entre la auto-renovación y las divisiones de diferenciación, parecen ser
independientes de CD133. De hecho, para aumentar la selección y la presión de proliferación para
una evaluación rigurosa del potencial de HSC, hemos realizado (i) experimentos de trasplante
competitivo en serie en cuatro ratones receptores consecutivos y (ii) trasplantes con números
titulados de CD133 KO y células donantes de tipo salvaje; Para evaluar el papel de CD133 en el
microambiente HSC, hemos utilizado ratones deficientes en CD133 como receptores de células de
tipo salvaje que posteriormente se trasplantaron a ratones receptores secundarios.
Sorprendentemente, las HSC deficientes en CD133 mostraron la misma capacidad de reconstitución
en comparación con las de tipo salvaje y el paso a través de un microambiente deficiente en CD133
no tuvo ningún efecto en la funcionalidad de las HSC, lo que sugiere que el mantenimiento y la
función de las LT-HSC es independiente de CD133.
Esta conclusión está en línea con el hecho de que no se observa ningún defecto hematopoyético
obvio en individuos afectados con mutaciones recesivas o dominantes en el gen PROM1 (42-44) y
también con los resultados obtenidos por los métodos de desactivación de CD133 en las HPC
humanas, lo que indica que CD133 es no es totalmente necesario para su migración, por lo tanto, su
hogar y formación de colonias [nuestros datos (33)].
La hematopoyesis normal en ratones CD133 KO podría explicarse simplemente por la falta de
expresión de la proteína CD133 en la superficie celular de las HSC normales. Sin embargo, tal
conclusión debe interpretarse con cautela. Aunque la expresión de Prom1 el gen se observa a nivel
transcripcional mediante un método sensible como la PCR, la ausencia de la proteína CD133
monitorizada mediante citometría de flujo podría reflejar numerosos fenómenos que no son
mutuamente excluyentes. Además de un bajo nivel de expresión y / o incluso la falta de traducción,
no pudimos excluir, por ejemplo, una localización intracelular (por ejemplo, compartimento
endosomal) de CD133 como se informó recientemente en HSCs y HPCs humanas (23). Aunque el
epítopo 13A4 del CD133 de ratón es independiente de los restos de azúcares con enlace N (6), en
contraste con el epítopo AC133 del CD133 humano (45), no se pudo descartar que se incrustara en
micro dominios de membrana basados en colesterol que impiden su inmuno detección ( revisado en
la ref. 46). La interacción directa de ratón y humano CD133 con colesterol de membrana es
consistente con tal escenario (19, 47). De manera similar, una rápida rotación de CD133 en la
superficie celular también podría dar lugar a falsos negativos, o su translocación a un conjunto
interno y / o liberación por medio de pequeñas vesículas de membrana podría explicar esta situación
(23). Independientemente de sus razones biológicas, la falta de proteína CD133 en la superficie
celular de las HSC murinas y la ausencia de consecuencias funcionales sobre la hematopoyesis
murina en su ausencia, marca una diferencia sustancial de especies entre el ratón y el humano y
agrega CD133 a la lista de marcadores de superficie celular y reguladores del destino celular que no
son conservado entre especies (revisado en la ref. 48).
El estrés mielo tóxico inducido, por ejemplo, por la inyección de 5-FU aumenta la velocidad y la
frecuencia de división de las HSC / HPC, lo que resulta en una reacción de rebote excesiva (39). La
inyección de 5-FU en ratones CD133 KO dio como resultado después de 8 días una reducción
significativa de las HPC fenotípicas en la médula ósea en comparación con los animales de control
de tipo salvaje. Como consecuencia, la recuperación de los glóbulos rojos maduros se retrasó en
ratones CD133 KO. Dicha información destaca la posibilidad de que CD133 sea de hecho un
modulador discreto de HSCs / HPCs, que se revela bajo la hematopoyesis provocada donde las
células madre y progenitoras en división se convirtieron repentinamente activo. Además, y en línea
con esta interpretación, encontramos diferencias aparentes en las respuestas proliferativas entre
células adultas de tipo salvaje donde CD133 fue derribado y en las mismas células de un animal
constitutivo deficiente en CD133. Las discrepancias entre los fenotipos de eliminación y los enfoques
de eliminación constitutiva se han informado anteriormente (37, 38) y pueden explicarse por otras
moléculas compensatorias que pueden haber enmascarado los efectos de la deficiencia de CD133
in vivo. En nuestro caso, el hallazgo también sugiere que un umbral de los niveles de expresión de
CD133 podría influir en el equilibrio de la división celular, como se informó anteriormente en las
células ES (49). Parece existir un cierto vínculo entre la expresión de CD133 y el estado de la
proliferación celular y puede explicar la expresión general de CD133 en numerosas células madre
cancerosas que se originan en diversos sistemas orgánicos.

Fig. 5.
Los ratones CD133 KO tienen una recuperación comprometida después del estrés mielo tóxico in
vivo. ( A ) Los gráficos de puntos muestran la frecuencia de la expresión de la superficie de las
células Kit y Sca-1 en células de médula ósea Lin de ratones de tipo salvaje ( Upper ) y CD133 KO
( Lower ) en el momento indicado después de la inyección de 5-FU.Los datos son representativos de
2 (día 0, 5 y 12) y 13 (día 8) ratones por genotipo. Se realizaron tres experimentos independientes, y
los datos de todos los ratones se resumen en B. ( B ) El gráfico muestra la frecuencia de células Kit +
de médula ósea en el compartimiento Lin de ratones de tipo salvaje (barras sólidas) y CD133 KO
 (barras abiertas) en los puntos de tiempo indicados
después de la inyección de 5-FU. La media y la SD
se proporcionan [ n = 2 (día 0, 2, 5, 12 y 14) o n =
13 (día 8) ratones por genotipo]. * P = 0.05-
0.01; ** P = 0.01–0.001. Los datos se agrupan a
partir de tres experimentos independientes como
se describe en A. ( C ) Se muestran los números de
colonias por dos fémures de ratones de tipo salvaje
(barras cerradas) o CD133 KO (barras abiertas) en
medio que contiene metil celulosa suplementado
con IL-3 y Epo en los puntos de tiempo indicados
después de la inyección de 5-FU. La presentación
de los datos y los ratones analizados se describen
en B. ( D ) El gráfico representa el hematocrito
(Hct) calculado como el porcentaje del Hct
promedio de ratones de tipo salvaje sin 5-FU en los
puntos de tiempo indicados después de la
inyección de 5-FU. Se agruparon los datos de
ratones de tipo salvaje (barras cerradas) o CD133
KO (barras abiertas) de dos experimentos
independientes. Las medias ± SD se dan [ n = 9
(día 0 y 8), n = 4 (día 2 y 5), y n = 5 ratones de tipo
salvaje y n = 4 CD133 KO (día 12 y 14) por
genotipo].

En conclusión, el ratón CD133 modifica específicamente la cinética de la recuperación de los

glóbulos rojos después de los ataques hematopoyéticos. A pesar de la reducción de las frecuencias
precursoras en la médula ósea, las frecuencias y los números absolutos de los tipos de células
mieloides maduras en el bazo fueron normales durante el estado estacionario, lo que sugiere que el
déficit en la generación del número de células Progenitoras se puede superar en momentos
posteriores durante La diferenciación y que otras vías regulan Las últimas etapas de la formación de
células mieloides maduras pueden compensar la falta de CD133. Por lo tanto, CD133 desempeña un
papel redundante en la diferenciación de los compartimientos de células mieloides maduras durante
la hematopoyesis estable del ratón, pero es importante para la recuperación normal de los glóbulos
rojos bajo estrés hematopoyético.

Materiales y métodos
Se adquirieron ratones C57BL / 6 (B6) y B6.SJL-PtprcaPep3b / BoyJ (B6.SJL).
(Jackson Laboratory) y CD133 KO ratones se generaron y se hicieron congénicos en el fondo C57BL
/ 6JOlaHsd (N11) como se describe (26). Los ratones se mantuvieron bajo condiciones específicas
libres de patógenos en las instalaciones para animales del Centro Médico Teórico de la Universidad
de Tecnología de Dresde.
Los experimentos se realizaron de acuerdo con la legislación alemana sobre bienestar animal y
fueron aprobados por las autoridades pertinentes, Landesdirektion Dresden. Detalles de
procedimientos de trasplante, tratamiento con 5-FU, análisis de colonias y citometría de flujo, análisis
de expresión y análisis estadístico se proporcionan en Materiales y métodos de SI.