“DETERMINACIÓN DE ANTOCIANINAS MEDIANTE

ESPECTROCOPIA DEL PH DIFERENCIAL DEL EXTRACTO

ETANÓLICO DE LA ZARZAMORA (Rubus ulmifolius)”
Cubas Sharon1; Sánchez, Elaine Yuribeth2, González, Zury3
CIP: 4-782-2072 4-779-2008 4-781-1928

Curso de Química de Productos Naturales (QM-460), Escuela de Química, Facultad de Ciencias

Naturales y Exactas, Universidad Autónoma de Chiriquí. David, Chiriquí, Republica de Panamá.
Email:
1sharyanc.18@gmail.com, 2yuribeth-0330@hotmail.com,3 zury192521@gmail.com

Resumen:

Esta experiencia se basó en el estudio del contenido de antocianinas presentes en el extracto del
concentrado de la zarzamora, Rubus ulmifolius. El extracto se preparó pesando 115.85 g del
concentrado de zarzamora al cual se le añadió etanol acidificado con HCl 0.2 N en proporción de 10:1
para llevar a cabo la extracción de dicho metabolito secundario. Posteriormente, se le realizó una
filtración para eliminar algún residuo vegetal remanente y poder hacer las diluciones para la lectura en
el espectrofotómetro UV-Vis. La metodología empleada fue por medio del pH diferencial del extracto
utilizando como buffer el cloruro de potasio y el acetato de sodio para obtener un pH de 1.0 y de 4.5
respectivamente para evidenciar la presencia de las antocianinas en el extracto en su forma oxium y
hemicetal que pueden visualizarse debido al cambio en la absorbancia de la muestra a 515 nm cuando
se encuentra a un pH de 1.0 y a 700 nm cuando se encuentra a pH de 4.5. La concentración era
expresada como cianina-3-glucósido la cual presenta un peso molecular de 449.2 g/mol y un
coeficiente de extinción molar 26900, lo que permitiría determinar la concentración de antocianinas
totales en el extracto de la Rubus ulmifolius. También, se realizó el tamizaje fitoquímico al extracto
obteniéndose la presencia de compuestos fenólico y flavonoides como era de esperarse ya que las
antocianinas tienen grupos fenólicos en su estructura y son flavonoides. Las antocianinas son
responsables del color atractivo de muchas frutas y verduras; su intensa coloración la hacen ser una
fuente atractiva de colorante de alimentos naturales para la industria alimentaria y textil, constituyendo
una alternativa a los colorantes alimentarios sintéticos. Sin embargo, podemos inferir que aparte de su
utilidad tintórea, los frutos del género Rubus, son fuente de metabolitos secundarios con actividad
terapéutica como lo son las antocianinas lo que las hacen tener un valor potencial en el desarrollo de
medicamentos. Y así no solo basarnos en el interés de los pigmentos antociánicos sino también en su
probable papel en la reducción de las enfermedades coronarias, cáncer, diabetes y a sus efectos
antiinflamatorios y antioxidante.
Palabras claves: Flavonoides, hemiacetal, Marco teórico:
oxium, pH diferencial, espectroscopia UV-Vis
Las antocianinas son glucósidos de
Objetivos: antocianidinas, pertenecientes a la familia de
los flavonoides, compuestos por dos anillos
 Determinar el contenido de antocianinas aromáticos A y B unidos por una cadena de 3
presente en el extracto metanólico de la carbonos. Variaciones estructurales del anillo B
Rubus ulmifolius. resultan en seis antocianidinas conocidas
 Comprender el principio y utilidad de la (cianidina, malvidina, pelargonidina, petunidina,
técnica de lectura en espectroscópica delfinidina y peonidina).
por pH diferencial para la determinación
de antocianinas. Muchas de las propiedades atribuidas a las
 Inferir en la importancia de las antocianinas para mejorar la salud están
antocianinas como metabolitos asociadas a esta capacidad de actuar como
secundarios flavonoicos. antioxidantes y secuestrar radicales libres en
sistemas biológicos. Pueden donar hidrógenos carbinol incolora. Entre pH 4 y 5.5 habrá poco
o electrones a los radicales libres o bien color, debido a que las dos formas coloreadas
atraparlos y desplazarlos en su estructura estarán en bajas concentraciones y el equilibrio
aromática. Se ha demostrado que frutos ricos se desplazará a las formas Incoloras. Por lo
en antocianinas evidencian una alta actividad tanto, la forma chalcona es la más susceptible
antioxidante contra el peróxido de hidrógeno a la degradación, y la forma iónica flavilio es la
(H2O2) y contra radicales peróxidos, (ROO),
más estable (Wesche-Ebeling & Montgomery,
superóxido (O2), hidroxilo (-OH) y oxígeno
2000).
singulete. El interés en los pigmentos de
antocianina también se ha incrementado por su
color, ya que se podrían utilizar como
colorantes naturales, (Cosavalente, Ruiz &
Ganoza, 2016).

(Martínez, 2011), explica que Rubus es uno de

los géneros más diversos de plantas y se
distribuye en todo el mundo, la diversidad de
este género se manifiesta en la gran variedad
de frutos y su pigmentación. Los frutos de las
especies del género Rubus contienen
compuestos fenólicos a los cuales se les
reconoce como agente quimiopreventivo, las
antocianinas entran en este grupo, se ha Figura 1. Estructura de antocianinas a diferentes pH.
encontrado una gran variación en el contenido
de antocianinas, así como en la capacidad Es por tanto que, para la obtención de la
antioxidante. Diversos estudios concentración de la antocianina se utiliza el
epidemiológicos indican que el consumo de método de pH diferencial. (Quintero, 2013),
productos vegetales como frutas y verduras, explica que la antocianina experimenta una
con altos contenidos de compuestos fenólicos, transformación reversible con los cambios de
reducen la propensión a enfermedades pH produciendo un cambio en la absorbancia.
cardiacas, cerebrovasculares y disminuyen la La forma oxium predomina a pH 1.0 y el
tasa de mortalidad por cáncer. Genotipos de hemiacetal a pH 4.5.
Rubus de origen mexicano han sido reportados
con actividad antioxidante y antiinflamatoria. En Materiales y Reactivos:
la actualidad hay un interés creciente en los Nombre Cantidad capacidad
antioxidantes, en particular en aquellos que Vasos químicos 5 100mL
previenen los efectos nocivos de los radicales 250mL
Balanza 1 250 gr
libres en el cuerpo humano, existe preferencia
Probeta 3 100mL, 10mL
por los antioxidantes naturales y no de fuentes 50mL
sintéticas. Espectrofotómetro 1 100mL
250mL
Uno de los principales factores del medio que Celdas 6 1.0 mL
afecta la estabilidad del color de las Goteros 2 -
antocianinas es el pH. Dependiendo del pH las Policial 2 -
antocianinas pueden existir en cuatro especies Cuadro 1. Materiales.
diferentes: base quinoidal, catión flavilio,
pseudobase carbinol y chalcona. En soluciones Cuadro 2. Reactivos.
muy ácidas (pH < 0.5) el catión flavilio rojo es la Reactivos Toxicidad
única estructura. Con incrementos de pH la Inhalación: Irritación en
concentración del catión decrece al mismo el tracto respiratorio,
tiempo que la hidratación da lugar a la base de Etanol náuseas, vómito.
 Piel: resequedad y B. Preparación del extracto y diluciones de la
agrietamiento. Rubus ulmifolius.
Ojos: irritación.
se le añadieron 150 mL
Inhalación: Corrosivo, Se pesaron 115. 45 g
de etanol acidificado
del concentrado
irritación nasal, comercial de la
con HCl 0.2N en
proporción 10:1 y se
sofocación, zarzamora
dejo es reposo
HCl concentrado quemaduras.
Ingestión: vómito,
diarrea quemadura en
la boca, colapso y
muerte luego se filtro mediante
del filtrado obtenido se
una malla de fieltro y
Piel: Inflamación, realizaron diversas
posteriormente con
diluciones
enrojecimiento, dolor. papel filtro
Ojos: lagrimeo
excesivo, dolor.

Puede causar se utilizando como

Acetato de sodio irritación a la piel, ojos disolvente las las diluciones fueron de
y aparato respiratorio. soluciones buffer pH 1:4 y 1:6 para el pH 1.0
1.0 y 4.5 dejando en y 5:5, 3:7, 1:9 pH 4.5
Altamente reposo en cada caso
Cloruro de sodio higroscópico, Puede
afectar el sistema
respiratorio. C. Lectura en el espectofotometro UV-Vis.
Inhalación: Irrita las
mucosas nasales y Luego de obtener la
oculares. se preparon un blanco:
diluciones de las muestras
etanol acidificado y el
Ingestión: Disturbios del extracto se
buffer empleado
visuales, dolor procedieron a leer su abs

CH3OH abdominal, diarrea,

vómito
Ojos: Irritación, dolor,
lagrimeo, sensación de a la muestra más y posteriormente, se
quemadura y visión concentrada se le realizo procedió a leer a la
borrosa un barrido para obtener longitud de onda de máx.
Piel: Produce su máxima abs abs para cada muestra
resequedad,
enrojecimiento y dolor.

Flujograma: tras obtener los datos se

pudo determinar la
A. Preparación de soluciones amortiguadoras. concentración de
antocionaninas mg/mL

Buffer pH 4,5: se
Se prepararon las
preparo agregando Resultados:
soluciones de HCl 1 N,
40mL de acetato de
HCl 0.2 N, acetato de
sodio 1N más 24 mL de
sodio 1 N y cloruro de I. Pruebas Fitoquímicas
HCl 1N y 36 mL de agua
sodio 0.2 N
destilada.
Cuadro 3. Pruebas de tamizajes realizadas al
extracto de zarzamora.

El pH de los buffers fue

Buffer pH 1,0: se
verificado con tiras
prepraró añadiendo 12, 5
reactivas para obtener
mL de NaCl 0.2 N más
valores de pH final de
38, 5 mL de HCl 0,2N
1,0 y 4,5
 de etanol 95% y 15 mL de HCl 0,2 ml), luego se
esperó cierto tiempo y se filtró la muestra
concentrada de la cual luego se tomó 10mL de
y se llevó en una proporción de 1:4 (13,5 de
etanol y 1,5 mL de HCl), de la proporción 1:4 se
tomó 10 mL y se llevó a una proporción 1:6.
Posterior a esto se tomó 1 mL de cada
proporción y se le añadió 4 mL de buffer pH 1
(Cloruro de potasio) y pH 4,5 ( acetato de
plomo). Estas disoluciones se leyeron a una
absorbancia de 514 nm. Luego se hicieron otras
Figura 2. Resultados de las pruebas de promociones de 1:9,3:7 y 5:5 a un pH 4.5 y
identificación. estas se leyeron a una longitud de 770nm.
Según Martínez Cruz (2011), la palabra
Cuadro 4. Resultados del buffer a pH=4.5 del
antiocianina deriva del griego anthos (flor) y
extracto de zarzamora (Rubus ulmifolius).
kyanos (azul oscuro). Las antocianinas son las
Lectura a 770nm
responsables de los colores rojos, azulados o
Dilución Absorbancia
violetas de la mayoría de las frutas y flores. Es
Concentrada 0.571
el pigmento más importante, después de la
5:5 0.223
clorofila, que es visible al ojo humano. Las
3:7 0.185
1:9 0.083 antocianinas son derivadas del catión 2-
*Blanco buffer pH=4.5 fenilbenzopirilo y debido a la poca solubilidad de
éstas en agua, no se encuentran de manera
Cuadro 5. Resultados del buffer a pH=1.0 del libre en la naturaleza, sino en su forma
extracto de zarzamora (Rubus ulmifolius). glucosilada siendo una de las más abundantes
Lectura a 510nm la cianidina-3-glucosido. Las antocianinas son
Dilución Absorbancia compuestos lábiles y su estabilidad es muy
Concentrada 1.483 variable en función de su estructura y la
1:4 0.673 composición de la matriz en la que se
1:6 0.119 encuentran. Su estabilidad se ve afectada por el
*Blanco buffer pH=1.0
pH (como en el caso de nuestro laboratorio),
Para la obtención de la concentración de temperatura de almacenamiento, presencia de
antocianina se utilizó la fórmula de pH enzimas, luz, oxígeno, estructura y
diferencial: concentración de antocianinas, y la presencia
de otros compuestos tales como otros
A= (Aλvis-max-Aλ700)pH1-(Aλvis-max-Aλ700)pH4.5
flavonoides, proteínas y minerales.
A= (1.483-¿)pH1-(¿-0.571)pH4.5
A= En el experimento se utilizó una extracción de
-En donde Aλvis-max es la lectura del pico mas alto antocianinas de la zarzamora usando etanol
a pH=1 y pH=4.5. acidificado, hidrolizadas en HCl en la cual el
- Aλ700 es la lectura nm, tanto para pH=1 como objetivo de este método es obtener los
pH=4.5. aglicones, por separación de los azúcares y
Discusión: otras sustancias como ácidos ligados a la
estructura antociánica, con el único propósito
La experiencia consistió en medir la cantidad de de identificar las antocianinas presentes en el
antocianinas presente en una muestra se pigmento. De acuerdo con Santacruz (2011),
zarzamora por el método de pH diferencial. En las antocianinas son compuestos solubles en
donde se pesó 115,85 g de zarzamora y se le solventes polares y comúnmente se extraen de
adiciono 150 mL de etanol acidificado (135 mL
sus fuentes naturales usando metanol o etanol
con pocas cantidades de algunos ácidos como
ácido clorhídrico, acético y fórmico, ya que el
ácido mantiene el pH ácido lo que previene el
desplazamiento de los equilibrios químicos de
hidratación y formación de chalconas.
Adicionalmente el uso de ácidos débiles
previene la degradación de las antocianinas no
aciladas las cuales presentan mayor labilidad.
También se ha demostrado que las
antocianinas relativamente simples son más
estables en un medio ácido que en un medio
neutro o alcalino. En medio ácido la forma
predominante es la del ión flavilio, el cual da el
color rojo; a medida que el pH se eleva, las
antocianinas se transforman en una base
quinónica de color azulado.
Para la cuantificación de antocianinas
monoméricas se utilizó el método de pH
diferencial en la cual la muestra se sometió a
diferentes pH como 1,0 (cloruro de potasio y
HCl 0,2 M) y 4.5 (acetato de plomo y HCl), se
utilizó este método ya que permite la estimación
alternativa del contenido de antocianinas
totales, incluso la presencia de pigmentos
polimerizados y otras interferencias mediante el
uso de un sistema tampón. También porque el
pH es uno de los principales factores del medio
que afecta la estabilidad del color de las
antocianinas, los espectros de UV-Vis a
diferentes valores de pH también varían y nos
ayudan a determinar si las antocianinas están o
no polimerizadas. La concentración de
antocianinas entonces se determina con la
absorbancia a un pH diferencial. La antocianina
experimenta una transformación reversible con
los cambios de pH manifestado por un llamativo
cambio en la absorbancia. La forma
oxoanionica predomina a pH=1,0 y el hemicetal
a pH= 4,5. El empleo de 2 tipos de pH nos
ayuda para que la muestra no se valla ni por
arriba ni por abajo del pH donde se encuentre
(Rivera, 2015).
Para medir las absorbancias es necesario diluir
la muestra con soluciones amortiguadoras. La
dilución debe ser tal, que al medir la
absorbancia a un pH=1.0 se obtenga una
absorbancia menos que 1.0 o preferentemente
en un rango de en un rango de (0.4-0.6). Esta
misma dilución se debe utilizar para la muestra
pH=4.5. (Martínez-Cruz, 2011).
Otras consideraciones que debemos tomar en
cuenta es que las diluciones deben ser claras y
no contener sedimentos o turbidez, si fuese así
debemos ya sea centrifugar o filtrar la muestra.
(Según Leyva,2009) es recomendable que
antes de llevar acabo las mediciones se haga
una lectura para ver si la muestra no se desvía
de la ley de Lambert y Beer. Si esto ocurre se
debe variar el factor de dilución de la muestra,
hasta obtener un rango que vaya de (0-1.0), ya
que la ley de Lambert y Beer no se cumplen a
concentraciones muy bajas o altas. La relación
entre la absorbancia y la concentración deben
dar un gráfico de línea recta.
En esta experiencia no llegamos a cuantificar la
presencia de antocianinas que había en el
extracto de zarzamora que utilizamos debido a
que no se leyeron todas las diluciones en las
dos longitudes de ondas a las que trabajamos
(514-770) nm. Más si por los datos obtenidos a
las longitudes de ondas registradas en los
cuadro 1 y 2 podemos deducir que si había
presencia de las mismas dentro de nuestros
resultados.
Existen seis tipos de antocianinas conocidas
(cianidinas, malvidina, perargonidina,
pertunidina, delfinidina y peonidina), según
(Burgos, Ruiz y Ganoza, 2016), las cuales se
encuentran debido a la variación estructural del
anillo B del esqueleto básico del cual derivan las
antocianinas. (Ver figura No 4).
Figura 3. Estructura molecular de las antocianinas
y longitudes de onda a las que se presentan sus
sustituyentes.

Figura 4. Estructura molecular de los diferentes
tipos de antocianinas más conocidas.
También se realizó un tamizaje fitoquímico a la
muestra de zarzamora pura (Ver cuadro No.3
e Imagen No.2, dando como resultado positivo
en cloruro férrico con una coloración negruzca
y NaOH 5 % dando una coloración verde
violáceo, en donde la prueba en cloruro férrico
positiva indica la presencia de compuestos
fenólico y la NaOH flavonoides como era de
esperarse ya que las antocianinas tienen
grupos fenólicos en su estructura y son
flavonoides. De acuerdo con Osorio (2015),
Los flavonoides son compuestos químicos del
tipo C6-C3-C6 (dos anillos aromáticos unidos
por una cadena de tres carbonos) que se
encuentran ampliamente distribuidas en los
vegetales. La biosíntesis se lleva a cabo por dos
rutas: Del ácido shikímico y de la acetilcoenzima
A. vía malonilCoA (biosíntesis mixta). En los
flavonoides existe diversidad en cuanto a los
sustituyentes del esqueleto carbonado
especialmente en la cadena de tres carbonos lo
que permite la clasificación en Flavonas,
Flavonoles, Chalconas, Flavononas,
Flavononoles, Catequinas, Isoflavonas, entre
otros. En referencia a los escritos de Osorio
(2015), la reacción de tricloruro férrico es un tipo
de reacción ácido-base de Lewis, teniendo
como donador de electrones a los hidroxilos del
catecol del tanino, existiendo la formación de
cargas parciales para la posterior eliminación
de átomos de hidrógeno y cloruro hasta llegar a
la formación de un complejo oscuro, sugiriendo
la presencia de taninos hidrolizables. El
resultado obtenido es una variación de color
original del compuesto a azul o negro debido a
la alta concentración de los reactivos. Esta
respuesta se debe al ataque producido por el
Ion cloruro al hidrogeno del grupo hidroxilo
provocando una ruptura de enlace y la unión del
grupo fenóxido al hierro formando un complejo
el cual es coloreado.
Conclusiones:
 Las antocianinas desarrollan
transformaciones estructurales reversibles
con el cambio de pH manifestado por el
espectro a diferentes absorbancias.
Conociendo que, la forma de oxoanionicas
coloreada predomina a pH 1 y la forma c
hemicetal incolora a pH 4,5, se establece el
método de pH diferencial, que se basa en
esta reacción para medir el total de
antocianinas en la muestra de zarzamora.
 No se determino el contenido total de
antocianinas presentes en los extractos de
zarzamora trabajados, debido a que no se
leyeron todas las diluciones en las
longitudes trabajadas (514-770)nm, pero si
se evidencia que estas estaban presentes
con los datos que se obtuvieron en las
lecturas obtenidas se encontraban dentro
del rango a la cual absorben las
antocianinas en el UV visible.
Bibliografía
 Martínez, N. (2011). Antocianinas y
actividades anti radicales libres de Rubus
adenotrichus Schltdl (zarzamora). Revista
mexicana de ciencias farmacéuticas, 42 (4),
66-71.
 Cosavalente, K., Ruiz, S. & Ganoza, M.
(2016). Antocianinas totales y capacidad
antioxidante in vitro de extractos de diferente
grado etanólico del fruto de
Vacciniumcorymbosum “Arándano”. UCV-
Scientia, 8 (1), 44-48.
 Quintero, H. (2013). Extracción y
cuantificación de antocianinas. Recuperado
el 6 de octubre de 2018 de:
http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/docum
entos/lqf/quintero_h_cm/capitulo6.pdf
 Wesche‐Ebeling, P. & Montgomery, M.
(2000). Strawberry polyphenoloxidase: its
role in anthocyanin degradation. Journal of
 Food Science, 55(3), 731-734. Recuperado
el 6 de octubre de 2018. Disponible en:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1
365-2621.1990.tb05217.x/epdf
 Santacruz, I. A. (2011). Análisis químico de
antocianinas en frutos silvestres. Universidad
nacional de Colombia. Disponible en:
http://bdigital.unal.edu.co/5351/1/19751
8.2011.pdf
 Martínez-Cruz, N. D. (2011). Antocianinas y
actividad anti radicales libres de rubus
adenotrichus schltdl (zarzamora). Revista
mexicana de ciencias farmacéuticas, México.
66-71. Disponible en :
http://www.redalyc.org/pdf/579/5792278
3007.pdf
 Rivera, H. M. (2015). Técnica de análisis
espectrofotométrica de antocianinas en
materias primas de la región de ayacucho.
Universidad nacional de san cristóbal. Perú.
Disponible en :
http://repositorio.unsch.edu.pe/bitstream/han
dle/UNSCH/946/Tesis%20AI157_Mar.pdf?s
equence=1&isAllowed=y
 Osorio, C. (2015). Metabolitos secundarios
[Scrib]. Recuperado el 9 de septiembre de
2018 de:
https://es.scribd.com/document/137122672/
Metabolitos-secundarios-1
 Leyva, Diana. 2009.Determinación de
antocianinas, fenoles totales y actividad
antioxidante en licores y frutos de mora.
México. Recuperado de:
http://jupiter.utm.mx/~tesis_dig/10876.pdf.
 Burgo,C., Ruiz, S. y Ganoza M.
2016.Antocianinas totales y capacidada
antioxiante in vitro de extractos de
diferenetes grado etanólico del fruto de
Vacciniumcorymbosum “Arandano”. Trujillo:
Perú.