INFORME 9: PRUEBA IFI PARA ENFERMEDADES AUTOINMUNES

1. Marco teorico
La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una de las técnicas más utilizadas en los estudios
de autoinmunidad debido a su fácil manejo y estandarización. Sin embargo, la lectura e
interpretación requieren de amplia experiencia. La técnica se basa en el reconocimiento de
los anticuerpos que reconocen estructuras antigénicas celulares nativas. La interacción se
evidencia por medio de un anticuerpo antiinmunoglobulina humana, producido en conejo,
cabra o cobayo, dirigido contra las fracciones constantes (Fc) de las inmunoglobulinas IgG,
IgA y/o IgM. Este anticuerpo antiinmunoglobulina humano está conjugado o acoplado a un
fluoróforo (generalmente isotiocianato de fluoresceína [FITC]). Los resultados del
reconocimiento de los antígenos por los autoanticuerpos presentes en el suero, plasma o
cualquier otro líquido, se evalúan en un microscopio de epifluorescencia. Actualmente, la IFI
se utiliza en los estudios de autoinmunidad para la detección de anticuerpos anti-DNA de
doble cadena (DNAcd) o DNA nativo (DNAn) utilizando como sustrato Crithidia luciliae. Para
la detección de anticuerpos que reconocen antígenos nucleares se utilizan como sustratos
líneas celulares epiteliales humanas como las células HEp-2 o las células HeLa. En el caso
de los anticuerpos contra componentes de los gránulos primarios y específicos de los
polimorfonucleares o anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA), se utilizan neutrófilos
fijados con etanol y formalina; y para los anticuerpos que reconocen antígenos órgano-
específicos, se utilizan como sustratos cortes de tejidos específicos (v. g. tiroides, esófago,
estómago, glándulas suprarrenales, glándulas salivales, etc.).

2. Competencias
 Entiende y aplica correctamente la técnica y método de la prueba de IFI en el diagnóstico
de las enfermedades auto inmunes.
 Conoce, valora y aplica en las discusiones, los conocimientos y funciones de la prueba
de IFI, así como su lectura e interpretación de sus resultados.

3. Materiales y equipos
Reactivo ANA-IFI. Contiene:
Laminas(Slides) sensibilizados con células HEp-2.
Control Positivo, Negativo.
Conjugado: anticuerpos para anti-Ig G humana marcados con fluoresceina.
Sales para PBS pH 7.2
Tween 20
Medio para montaje(Glicerol)
Laminillas(62x23 mm)
Agua destilada
Micropipetas automaticas de 10, 50 y 100 uL.
Pipeta automática de 1000 uL autograduable.
Puntas amarillas y azules
Beakers de 100 y 200 ml
4. Procedimiento
 Buffer PBS-Tween 20
 Diluir en 1000 cc de Agua destilada el sobre de PBS y agregar 2 ml de Tween 20
 Diluir las muestras 1/100 con solución preparada PBS-Tween 20 Ej. 10 ul de muestra en
990 ul de PBS-Tween 20
 Pipetear 30 ul de CONTROL POSITIVO, CONTROL NEGATIVO y muestras diluidas en
recuadro de la PLACA DE TITULACION
 Sacar lamina con Biochips(contiene células HEp-2) y colocarla con el sustrato hacia la
muestra en la placa de titulación. Incubar a Temperatura Ambiente x 30 minutos
 Lavado Con Buffer PBS-Tween 20

 Dejar caer un chorro sobre la lámina (no directamente en el sustrato)

 Sumergir la lamina en envase con Buffer PBS-Tween 20 por 5 min. mínimo
 Lavar placa de titulación con jabón de laboratorio y agua de caño y secarla para
siguiente paso
 Colocar 25 ul de Conjugado en cada recuadro de la placa de titulación
 Colocar la lámina como en paso 4 e INCUBAR A TEMP AMBIENTE X 30 min.
 Lavado Con Buffer PBS-Tween 20

 Dejar caer un chorro sobre la lámina (no directamente en el sustrato)

 Sumergir la lamina en envase con Buffer PBS-Tween 20 por 5 min. Mínimo
 Montaje
 Poner laminilla cubreobjeto en base (de tecnopor) colocar una gota pequeña de Glycerol
en cada lugar correspondiente a la muestra. Retirar de la base y llevar a la lectura.
 Leer con un microscopio de Inmunofluorescencia.
 Se recomienda usar objetivo de 40x para IF

5. Resultado

6. Cuestionario
 La IFI es muy útil en el diagnóstico de estas enfermedades?
El análisis de AA (autoanticuerpos)por IFI continua siendo un destacado medio de
diagnóstico, aunque para muchos ya está desfasado en tiempo y se le da mayor uso a los
inmunoensayos y a los sistemas Multiplex
 La IFI ha facilitado su diagnóstico por su alta especificidad y especificidad?
Aunque la presencia de varias dianas antigénicas en los cortes de tejidos da lugar a una
sensibilidad general excelente de la IFI, los ANA de especificidad no definida se pueden ver
en el suero de pacientes con muchas EA, pero también en enfermedades infecciosas y
hasta en individuos sanos. La falta de especificidad podría dar lugar a una mala
interpretación de los resultados de la IFI, por lo que pierde valor como método de escrutinio.

Además, aunque la IFI es un método sensible, tiene sus limitaciones, como las variaciones
en el substrato, su realización manual, la interpretación subjetiva del resultado, poca
 reproducibilidad y la falta de estandarización; así como el elevado consumo de tiempo para
obtener un resultado, lo que implica poca salida de resultados a corto plazo de tiempo y
elevación de los costos del laboratorio en gastos de personal.
 Los ANA son de diferente características proteicas y pueden ser evidenciadas por
ELISA?
La detección de ANA mediante IFI utilizando como sustrato células HEp-2 es útil como
prueba de tamizado inicial, debido a que los patrones de tinción más comunes se relacionan
con una gran variedad de antígenos; sin embargo, resulta necesario realizar pruebas más
sensibles y específicas como el ELISA para identificar el antígeno o antígenos reconocidos
por los autoanticuerpos.