Universidad

de Celaya

Facultad de Medicina

Unidad 2: Técnicas de biología molecular utilizadas
en medicina

Presenta:
Dr. Juan Antonio Cervantes Montelongo




20 de Agosto del 2018
 Unidad 2. Técnicas de molecular con
aplicación médica
1.  Análisis tipo Southern, Northern y Western Blot.
2.  PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)
3.  RAPD´s (Random Amplification of Polymorphic DNA)*
4.  rt-PCR (Reverse transcription PCR-semicuantitativo)*
5.  RT-PCR (Real time PCR-cuantitativo)
6.  CRISPER/Cas9

Tema de Investigación
Transformación genética en eucariotes
Análisis tipo Southern blot
Permite detectar la secuencia de ADN concreta en una mezcla.
Paso 1
Digestión de la muestra (ADNg) con enzimas de restricción

Paso 2
Separación por medio de electroforesis en gel de agarosa

Paso 3
Transferencia del ADN separado por tamaños a una
membrana de nitrocelulosa

Paso 4
Hibridación del ADN transferido con la/las sonda(s)

Paso 5
Revelado
 Método Ventajas Desventajas
Southern Blot Alta especificidad y Proceso largo y se
sensibilidad. requiere de
Detecta hasta 1 solo experiencia.
molécula de ADN. No permite detectar
secuencias de ADN
desconocidas.
 ADN de la sangre encontrada
en la ropa del defendido

D-ADN de la sangre V-ADN de la sangre

del Defendido de la Víctima
Análisis tipo northern blot
Permite detectar la presencia de transcritos particulares en una mezcla.
Paso 1
Obtención de la muestra (ARN total)

Paso 2
Separación por medio de electroforesis en gel de agarosa

Paso 3
Transferencia del ARN total separado por tamaños a
una membrana de nitrocelulosa

Paso 4
Hibridación del ARN total transferido con la/las sonda(s) (ADNc)

Paso 5
Revelado
 Detección de la abundancia de transcritos de un gen
determinado en diferentes tipos de tejido humano

Método Ventajas Desventajas

Northern Blot Alta especificidad y Proceso largo y se requiere de experiencia.
sensibilidad. La detección de múltiples transcritos a la vez es
problemática
No permite detectar secuencias de transcritos
desconocidas.
Análisis tipo western blot - Inmmunoblotting
Permite detectar la presencia de proteínas en una mezcla.
Mahajan y col., 2010 Clinical Chemistry 56:10. 1523-1527
 Método Ventajas Desventajas
Western Blot Alta especificidad y Proceso largo y se requiere de experiencia.
sensibilidad si se diseña NO es útil para complejos de proteínas
correctamente el No es cuantitativo
anticuerpo primario. Puede haber errores si existen diferencias post-
traduccionales respecto a la proteína (diferentes
glicosilaciones)
 VIH POSITIVO

VIH POSITIVO
Microplaca de ELISA Concentración de anticuerpos
 Comparación entre ELISA y western blot

ELISA Western Blot con Ambos

SDS-PAGE
Puede usarse para detectar un Las proteínas están Pueden ser utilizados
antígeno o un anticuerpo desnaturalizadas. para detectar proteínas
dependiendo del procedimiento. específicas.
Las proteínas deben de
Las proteínas están en su estado ser transferidas a una
nativo. membrana.
Videos
Reacción de PCR
PCR-¨Polymerase Chain Reaction¨-Reacción en cadena de la Polimerasa
PCR-transcriptasa reversa
(rt-PCR or reverse transcription PCR)

Método en el cual moléculas de ARN son

convertidas en sus moléculas complementarias de
ADN (ADNc) haciendo uso de la transcriptasa
reversa.
Posteriormente, se utiliza este ADNc como
molde para la reacción de PCR estándar.

Se utiliza para el estudio de expresión

genética.

La normalización de la muestra y una síntesis

eficiente del ADNc representan los puntos
clave de la técnica.

Robert E. Farrell Ph.D, in RNA Methodologies (Fourth Edition), 2010.

PCR en tiempo real (RT-PCR o Real Time PCR)

Essential Concepts and Techniques in Molecular Biology, 2017.

 Determinación de la carga viral

La carga viral se define como el número de partículas virales

por unidad de volumen presentes en un fluido corporal.

El rango de cuantificación de partículas virales de VIH-1 por medio

de PCR en tiempo real es menor a 40 partículas o copias/mL de
sangre.

Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(Supl 3):47-50

Sistema CRISPER/Cas9
CRISPER Sequences
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats.

Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y
regularmente interespaciadas.

Las secuencias CRISPR se encuentran relacionadas con los genes

denominados CAS (CRISPR Associated) que codifican una serie de
nucleasas.
Aplicaciones del sistema CRISPR/Cas9 en medicina

1.Como agente antimicrobiano que puede usarse contra cepas

resistentes a antibióticos o que presentan alta virulencia.

2. En terapia génica:
Reparación del gen cftr en cultivos celulares de pacientes con
fibrosis quística.

3. Tratamiento para enfermedades asociadas a virus como son: el
virus del VIH y hapatitis B.

4. Como herrarmienta secundaria en el proceso de transfección por
virus adeno-asociados para la terapia génica de células somáticas.

5. Edición de genomas en embriones para alterar el ADN humano y
prevenir o reparar enfermedades hereditarias.

6. Mejoramiento genético de humanos.

Tema de exposición:

Transformación genética de eucariotes:
1.  Electroporación
2.  Bombardeo de partículas
3.  Inyección directa de ADN
4.  Precipitación con fosfato
5.  DEAE-Dextrán
6.  Liposomas
7.  Transducción por virus