[TRABAJO ENCARGADO: INMOVILIZACION DE CELULAS] 27 de noviembre de 2014

INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

INTRODUCCIÓN

En la actualidad los países desarrollados experimentan grandes avances en el campo

científico y particularmente en el campo de la biotecnología. En el Perú existen pocos
trabajos al respecto .No obstante, el interés de muchos investigadores en el estudio de
inmovilización celular como técnica de aplicación de la biotecnología ha permitido
desarrollar nuevos métodos que han vuelto rentables a muchos procesos y productos
industriales por su simpleza y rendimiento

.Dentro de la industria alimentaria, la inmovilización de microorganismos en soportes

natural eso sintéticos proporciona estabilidad a las funciones celulares. Esta técnica
permite alcanzar altas concentraciones celulares en volúmenes reducidos, así como la
reutilización como biocatalizador y la implantación de sistemas de continuos de
producción

La inmovilización de un biocatalizador consiste en la localización de una célula o

enzima en una región definida de espacio, manteniendo al mismo tiempo una actividad
catalítica deseada. Además, en el caso concreto de las células, esto involucra a su
viabilidad.

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 INVOMILIZACION DE CELULAS (BIOCATALIZADORES)

Uno de los principales principios de cualquier sistema con biocatalizadores

inmovilizados data en el transporte de substratos y productos producidos por
mecanismos difusionales. El uso de biocatalizadores para llevar a cabo
biotransformaciones es un área de la biotecnología en continua expansión.

El uso de biocatalizadores para llevar a cabo biotransfomaciones es un área de la

Biotecnología en continua expansión. Un aspecto clave del proceso es el uso del
catalizador (célula o enzima) en un sistema continuo que permite extender el uso del
mismo en el tiempo dando como resultado una disminución de los costos del proceso
y otras ventajas como una mayor pureza del producto, mayor productividad etc.
También se puede pensar en la reutilización del biocatalizador en procesos batch.
Para lograr este objetivo los biocatalizadores se inmovilizan. La definición de la
EuropeanFederation of Biotechnology(1983) aclara el concepto. "Los biocatalizadores
inmovilizados son enzimas, células u organelos (o combinación de ellos) confinados o
localizados en cierta región definida del espacio, con retención de su actividad
catalítica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo
repetido y continuo.

 Es necesario analizar tres de los conceptos incluidos en la definición:

 “Confinados o localizados": para cumplir con esta condición es necesario

formar una fase sólida dispersa, macroscópica, de alta densidad y
catalíticamente activa, dentro de, o en contactó con, un medio reactivo líquido
libre de biocatalizador. Se dice que el biocatalizador está compartimentalizado.
Las características de la fase sólida son tales que el transporte de reactivos
hacia y desde el biocatalizador está gobernado por difúsión exclusivamente.
Por la resistencia al transporte difusional se establecen en la partícula
gradientes de concentración o de pH, con lo que el ambiente que rodea a la
partícula de biocatalizador inmovilizado difiere grandemente del seno de la fase
líquida.
 “retención de la actividad catalítica (y viabilidad)": los tratamientos a los que
son sometidas tanto las células como las enzimas libres que serán
inmovilizadas afectan en cierto grado la actividad. Si bien es deseable, no es
necesario que se retenga el 100% de la actividad del biocatalizador libre, pero,
para mantener la rentabilidad del proceso, debe alcanzarse un valor que no

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debe ser menor al 25%. En el caso de células puede ser necesario mantener la
viabilidad. La inmovilización, entonces, debe tratar de ser realizada en
condiciones tales quela pérdida de actividad sea reducida.
 “uso repetido y continuo": surge inmediatamente que la gran ventaja del uso de
biocatalizadores inmovilizados se relaciona con la fácil separación del
catalizador del medio de reacción sin pérdida de actividad, y por consecuencia
directa, con su reutilización. Las células o enzimas inmovilizadas pueden ser
separadas fácilmente. Es necesario saber cómo afecta el método de
inmovilización la estabilidad del biocatalizador, y por ende la extensión de su
uso repetido.

Las células libres en suspensión presentan un rápido decaimiento en su actividad

catalítica; sin embargo, las células inmovilizadas presentan una estabilidad mayor, y
por lo tanto la inmovilización es un requisito necesario para poder reutilizar las células.
El tiempo de vida media, en condiciones operacionales, varía normalmente entre 20 y
50 días.

Un caso particular, ampliamente usado, es aquel en el que se desea efectuar una

reacción de una sola etapa donde la viabilidad celular no interesa. Mas aun esta se
destruye deliberadamente mediante tratamientos fisícos o químicos los que también
estabilizan la estructura celular. En este caso las células no viables actúan como
soporte de la actividad catalítica de interés.

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METODOS DE INMOVILIZACION:

Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan actividad y sean estables es

necesario aplicar un método de inmovilización adecuado, que dependerá del tipo de
actividad catalítica de interés. Existen diversos métodos para inmovilizar células, los
cuales pueden dividirse en:

 entrecruzamiento fisico (floculacion).

 entrecruzamiento covalente.
 adsorcion sobre matrices insolubles
 enlace covalente con matrices insolubles.
 entrampamiento fisico en materiales porosos.
 encapsulamiento.

Según la ruta seguida para su preparación los sistemas pueden clasificarse en cuatro:

1. INMOVILIZACIÓN SIN CARRIER:

es el caso de células unidas con otras células, tanto por adsorción o por
uniones covalentes. La floculación de células, durante su fermentación o por
procesos secundarios mediante variación en parámetros fisicoquímicos(pH,
fuerza iónica) es un proceso de unión por adsorción. Este proceso puede
ayudarse por el agregado de pequeñas cantidades de agentes de floculación
(polimeros). Es también común eluso de agentes químicos bifuncionales, tal
como el glutaraldheído para unir células mediante entrecruzamiento químico.
El caso típico es la floculación de algunas cepas de Zymomonasmobilis,
empleadas en la producción de etanol. El método de inmovilización es sencillo,
pues espontáneamente se producen flocs cuando se crecen células en un
medio adecuado sin agitación. Los flocs asíformados se utilizan como inóculo
de medios de cultivo frescos, y pueden ser usados en la producción de etanol a
partir de glucosa en reactores especialmente diseñados. Las células
inmovilizadas son retenidas dentro del reactor.
Este método permite alcanzar altas concentraciones celulares, y se lleva a
cabo en condiciones de reacción suaves, que no perjudican la estabilidad del
biocatalizador. Presenta algunas desventajas: se alcanza una baja resistencia
mecánica frente a la agitación y a la compresión, hay limitaciones difusionales
al transporte de nutrientes, y está limitado a pocas clases de microorganismos.

2. INMOVILIZACION DEL BIOCATALIZADOR EN CARRIERS PREFORMADOS:

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Es la estrategia típica en la inmovilización de enzimas, especialmente por

medio de enlaces covalentes. La matriz puede generarse sin las limitaciones
en condiciones físicas y químicas (temperatura, pH, etc.) impuestas por el
biocatalizador, por lo que pueden mejorarse y optimizarse las características de
estabilidad mecánica, la estructura porosa del material, la resistencia, etc. En el
caso de células, el problema estriba en cómo favorecer la adhesión de las
células (relativamente grandes) a las superficies de la matriz, manteniendo la
estabilidad y la resistencia al lavado. La matriz debe presentar poros de mayor
diámetro que la célula para permitir la penetración a las superficies internas. Se
emplean carriers porosos, que son embebidos por inmersión en suspensiones
celulares. En el caso de enzimas es necesario activar el soporte, mediante la
generación de grupos reactivos capaces de reaccionar con los grupos amino o
carboxilo libres presentes en la enzima.

3. INMOVILIZACION DURANTE LA PREPARACION DEL CARRIER:

Es la estrategia más común en la inmovilización de células enteras Si bien hay

dos métodos, entrampamiento y encapsulamiento, este último es de limitada
importancia.

Debido al tamaño de las células enteras, es relativamente sencillo preparar

redes de porosidadtal que garanticen la completa retención de las células, y
que los procesos de transporte desustratos y productos sean suficientemente
rápidos para obtener alta eficiencia en la actividad catalítica. La dificultad se
encuentra en la búsqueda de condiciones de preparación de carriers que
cumplan con los requerimientos exigidos para que se retenga la actividad del
biocatalizador y/o la viabilidad celular. Es el método de inmovilización más
usado, debido asu flexibilidad y simplicidad, y a las poco agresivas condiciones
de reacción (en el caso depolímeros naturales).

4. INMOVILIZACION POR CRECIMIENTO DE CELULAS

PREVIAMENTEINMOVILIZADAS:

En realidad es un caso particular del criterio anterior. Esta estrategia es

utilizada para aumentar la concentración de células dentro del carrier, por lo
que,evidentemente, sólo sirve para inmovilización de células. Permite
inmovilizar células que contienen sistemas multi enzimáticos, ya sea en estado
estacionario o en condiciones de crecimiento. La desventaja es, al igual que en
caso de células libres, la existencia de reacciones laterales no deseadas.
Generalmente se realiza por entrampamiento en redesiónicas. Es posible

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restaurar la actividad catalítica, e inclusive aumentarla. Es un método útil para

obtener células difíciles de inmovilizar como tales, como por ejemplo micelio
celular.
La técnica en este caso consiste en la inmovilización de esporos en matrices
insolubles, los cuales originarán micelio una vez inmovilizados en la matriz.

TIPOS DE CARRIERS.

Lo Carriers son las sustancias implementadas para el soporte de biocatalizadores,

desde el punto de vista químico; pueden ser divididas en orgánicas e inorgánicas,
teniendo por consiguiente un origen sintético y/o natural.

Desde el punto de vista químico, las sustancias usadas para soportar a los
biocatalizadores pueden ser divididas en inorgánicas u orgánicas, y el origen de las
mismas puede ser natural u obtenidas por síntesis.

INORGANICOS:

 Naturales: arena, silicatos, arcillas.

 Sintéticos: vidrios de porosidad controlada, cerámicas.

ORGANICOS:

 Naturales: virutas de madera, antracita, colágeno, celulosa, alginatos,

carragenatos, albúmina.
 Sintéticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida, resinas de intercambio iónico,
epóxidos, poliuretanos.

La selección del material se realiza siguiendo algunos criterios heurísticos:

 Materiales de alta disponibilidad y bajo costo

 Materiales que permitan un proceso de inmovilización simple y efectivo
respecto de la retención de la actividad.
 Materiales con alta capacidad y eficiencia
 Materiales que permitan un diseño de reactores sencillo.

Los dos primeros criterios apuntan al uso de materiales naturales y que permitan
técnicas de inmovilización por adsorción. Los dos últimos criterios dirigen la elección
hacia carriers orgánicos complejos. Obviamente la elección final deberá tener en
cuenta el biocatalizadór a utilizar, el proceso en el cual va a participar y,
fundamentalmente, el producto que se desea obtener.

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De todos los métodos mencionados se hará especial énfasis en aquellos que

involucran la formación de redes poliméricas a partir de prepolímeros de cadena larga,
tales como alginatosy kappa-carragenatos (K-carragenatos). La variedad de sistemas
de este tipo es tan grande que pueden subdividirse según los mecanismos de
formación de las redes poliméricas:

1. Precipitación: formación de red sin reacción química, por separación de fases.

2. Gelificación: formación de redes sin reacción química, por transición de fase
debida a cambios de pH, temperatura, etc.
3. Gelificación ionotrópica: formación de redes con reacción química (intercambio
de iones) debido al entrecruzamiento de cadenas poliónicas con contraiones
multivalentes.
4. Entrecruzamiento covalente: formación de redes con reacción química debida
al entrecruzamiento de polímeros multifuncionales entre sí o con reactivos
bifuncionales de bajo peso molecular.

VENTAJAS

 El empleo de biocatalizadores inmovilizados representa un gran número de

ventajas:
 Permite la utilización continua del biocatalizador, dado que éste queda
fácilmente retenido en el interior del reactor utilizado, mientras se mantiene en
flujo continuo de entrada y salida de líquido.
 Favorece la re-utilización del biocatalizador en el caso de reacciones en
discontinuo.
 Con la inmovilización se puede aumentar sensiblemente la concentración de
biocatalizador, con respecto a un proceso en el que el mismo se encuentre en
suspensión.
 En cuanto a sistemas operando en continuo, éstos permiten un aumento en las
productividades de los correspondientes biorreactores, dado que permiten
operara a mayor concentración de catalizador, (mayor conversión de substrato)
y con caudales más altos.
 En el caso de enzimas inmovilizadas es frecuente observar un aumento de su
estabilidad y su resistencia a la desnaturalización y proteolisis.
 Permite reducir los efectos de contaminación accidentales del proceso en las
células; dado que la población de células contaminantes se encuentran en
suspensión y en concentración mucho menor que la población de células
inmovilizadas, ésta puede ser eliminada mucho más fácilmente del reactor.

DESVENTAJAS

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 Por otra parte, la utilización de estos biocatalizadores inmovilizados presenta

ciertos inconvenientes o desventajas:
 Es necesario tener en cuenta que la actividad de una célula o una enzima
puede quedar directamente afectada por las condiciones a que se lleva a cabo
el proceso de inmovilización, perdiendo parte de su actividad o su viabilidad.
 La velocidad de difusión de substratos y productos dentro del sistema de
biocatalizadores inmovilizados puede limitar su actividad catalítica y su eficacia,
cuando dicha velocidad sea más lenta que la velocidad de la transformación
que se está llevando a cabo.
 La inmovilización de catalizadores involucra la incorporación de una nueva
etapa al proceso, y por tanto un aumento de su complejidad, el cual tiene que
verse compensado por aumentos de productividad claros, mejoras en la
separación entre el producto y el biocatalizador y en tiempos de operación más
largos.

En el trabajo práctico se estudiará la inmovilización de células de levadura con

actividad invertasa en geles de alginato de Ca+2, con el fin de emplearlas en la
hidrólisis de sacarosa.

Por lo tanto, se describirán brevemente los mecanismos de entrampamiento por

gelificación y por gelificaciónionotrópica.

 GELIFICACION:

La gelificación por transición de fase suele ser promovida por cambios en temperatura
o en pH. Los agentes gelificantes usados tradicionalmente son gelatina y agar, los
cuales promueven una fácil gelificación pero presentan la desventaja de originar geles
blandos y mecánicamente inestables. Una mejora significativa constituye la
introducción deK-carragenato, heteroopolisacárico con ~-D-galactosa sulfato y 3,6-
anhidro a-D-galactosa,soluble en agua a temperaturas entre 40 y 60 ºC y que gelifica a
temperatura ambiente. Este material permite la formación de bolillas, bloques y
membranas que pueden ser usados como soporte de biocatalizadores.

Hay dos áreas donde se aplica el K-carragenato:

 Conversiones catalizadas por sistemas monoenzimáticos, donde pueden

usarse células muertas. La matriz es post-tratada con glutaraldehido o
hexametilendiamina, reactivos que estabilizan la actividad catalítica.
 Inmovilización de células vivas, donde hay crecimiento de células en la matriz.

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 GELIFICACION IONOTROPICA:

El sistema más común es el entrecruzamiento de alginatos con iones Ca+2. Los

alginatos son polímeros de ácido manurónico y gulurónico, solubles en agua a
temperatura ambiente como alginatos de Na+ y que gelifican en presencia de ciertos
iones polivalentes. En general una solución de alginato de Na+ se deja gotear en una
solución de CaCl2 obteniéndose en tiempos cortos, bolillas esféricas de tamaño
controlado y homogéneo. Es un método que presenta gran flexibilidad, pues alginatos
de distinto peso molecular y distinta composición química (distintas proporciones de
ácidos gulurónico y manurónico) rinden geles de muy buenas características químicas
y físicas. El requerimiento de Ca+2 depende de la composición química del gel. La
concentración de CaCl2 en la mezcla de gelificación puede variar entre 0,05 y 2 %. El
rango de temperaturas de operación va desde 0 hasta 80 ºC. Las bolillas que se
obtienen presentan diámetros entre 0,1 y 5 mm.y pueden presentar una alta carga
celular por entrampamiento directo (hasta 30 g de células húmedas por ml de
catalizador). Este sistema puede someterse a un secado parcial, con lo que el tamaño
disminuye y aumenta la estabilidad mecánica sin variación en la porosidad. La
desventaja que presenta es la inestabilidad frente a ciertos agentes capaces de
secuestrar iones Ca+2 (p. ej.: fosfatos).

Los puntos destacables de este método son:

 Reversibilidad de la gelificación: obliga a tornar precauciones en cuanto a la

composición del medio a utilizar, principalmente pH y presencia de agentes que
puedan secuestrar a los contraiones por precipitación o por formación de
complejos.

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 Buena estabilidad mecánica respecto al empaquetado en columna y a la

agitación.
e Formación de bolillas regulares, y con tamaño controlado.
e Formación de redes macroporosas, que se conserva aún después del secado
parcial.
 Alta capacidad de carga sin pérdida de estabilidad mecánica, pero con pérdida
de eficiencia debido a resistencias difusionales.
 Rendimientos de actividad catalítica de entre 80 y 100% en condiciones de
reacción controladas.
e Método suave, que permite que las células mantengan viabilidad y
estabilidad.

 Problemas con la inmovilización de células

 Si bien, el uso de células inmovilizadas en matrices solidas ha permitido la

implementación de procesos de fermentación en sistemas de flujo continuo.
Existen numerosos problemas que se presentan a nivel industrial, los cuales
se describen a continuación.
 Los sistemas floculados presentan un difícil manejo debido a que la floculacion
depende de factores como el pH, la concentración de Ca2+, temperatura y la
agitacion Ademas, cadacepa de levadura presenta un comportamiento
diferente.Otro caso, es el uso de membranas microporosas como filtros para
retener las levaduras en el reactor, lo cual resulta muy costoso cuando se
emplean reactores continuos.

 El mayor problema que presenta esta técnica es el bloqueo que

eventualmente sufren los poros de la membrana debido a particulas o a las
mismas levaduras .Por otro lado, la inmovilización de células por adsorción
sobre la superficie de materiales es fácil deconseguir, pero al ser la adsorción
un fenómeno fundamentalmente electrostatico, durante los procesos en
continuo, especialmente por efecto de la agitación, las células se liberan del
soporte. Además, por este método es difícil inmovilizar grandes cantidades de
biomasa (Verbelen et al., 2006).

 Otros métodos de inmovilización de células para procesos de

fermentación

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 Si bien, existe una problemática alrededor del uso de células inmovilizadas,

hoy en dia se han enfocado esfuerzos en el desarrollo de rutas novedosas que
permitan el desarrollo de sistemas inmovilizados mediante el uso de materiales
porosos diferentes a los polímeros de origen natural que se han usado hasta
ahora. Muchos de estos sólidos porosos podrían encontrar un lugar importante
en los procesos de produccion de vinos y fermentaciones alcohólicas en
general.
 Las zeolitas y los diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados
en diversos procesos cataliticos,prueba de ello es su extensa aplicación
.Debido a su tamaño de poro pequeño, no seria posibleinmovilizar levaduras
dentro de sus cavidades. Sin embargo, el uso de membranas zeoliticas si
podría ser de granutilidad en procesos de fermentación en los que se requiere
eliminar el etanol del reactor de forma selectiva .
 Para tal aplicacion se podrian emplear materiales zeoliticos hidrofobicos
convencionales como lazeolita beta o materiales hibridos organicos-inorganicos
como los metilaluminofosfatos-alfa ymetilaluminofosfatos–beta .Cabe
mencionar que la produccion de membranas zeoliticas compactas y con
propiedades mecanicas adecuadas no es sencilla y hoy en dia sigue siendo un
reto para muchos grupos de investigación. Los materiales mesoporosos
templados mediante aglomeraciones micelares , aunque siguen sin presentar
 el tamaño de poro adecuado para la inmovilización de levaduras, si permiten la
inmovilización de enzimas
 Esto hace que estos sólidos tengan un interes especial en la industria vinícola
ya que mediante el uso de enzimas podrían modificarse la naturaleza de
algunas sustancias responsables de aromas y sabores característicos del vino
consiguiéndose productos con propiedades organolépticas diferentes.

 Los materiales mesoporosos mas adecuados para la inmovilización de enzimas

serian los solidos del tipo SBA-15 debido a su gran tamaño de poro .La
inmovilizacion de las enzimas se conseguiria por difusión de las mismas en los
poros del solido previamente funcionalizado con moleculas que “anclarian” la
enzima a la pared del material Solidos como los que se proponen aqui podrian
usarse en procesos en continuo o en sistemas fluidizados.
 La inmovilizacion de levaduras requiere de materiales macroporosos con radios
del orden de algunas micras. Estos materiales pueden sintetizarse mediante
dos tecnicas:

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 La primera hace uso de esferas sintetizadas por polimerizacion en

microemulsion, que posteriormente son usadas como moldes que se recubren
con precursores de oxidos, metales u otros materiales .Por medio del proceso
de calcinacion de las esferas es posible sintetizar materiales macroporosos de
cavidades esfericas regulares conectados por ventanas de menor tamano.
Mediante esta técnica seria posible sintetizar biosolidos de gran resistencia
mecanica en los que no habria grandes problemas de difusión de reactivos o
productos. El paso mas complejo de sintesis seria la inoculación de las células
en el interior del solido, ya que aunque los poros pueden ser muy grandes, las
levaduras deben difundir por las ventanas que comunican los poros. La
estructura 3D de canales que estos materiales exhiben podria resultar de
interes para la fabricación de membranas para la retención de levaduras en
reactores en continuo.
 El segundo método que posee gran potencial es el uso de materiales porosos
sintetizados por congelación unidireccional y posterior liofilizacion .Esta técnica
de preparación de solidos macroporosos, al ser reciente, es la menos
explorada en el campo de la catalisis. Este metodo implica la congelación de
una solución de partículas que pueden ser polimericas, siliceas, metalicas etc.
a temperatura de nitrógeno liquido de manera unidireccional y a velocidad
controlada. El proceso que parece complejo, es en realidad un metodo sencillo
de fabricación de materiales macroporosos que, además, permite la
incorporación de especies biologicas in-situ en la matriz durante la sintesis del
material debido a que no se requiere calcinacion de ningun molde organico.
 Para inmovilizar bacterias dentro de una matriz polimerica Gutierrez et al.
partieron de una suspensión acuosa concentrada de bacterias E. coli
protegidas con alginato de calcio y glucosa. Las cuales incorporaron a la
suspension alcohol polivinilico y la mezcla se transfirio a una jeringa de
insulina.

 Esta se introdujo en un baño con nitrógeno liquido a velocidad controlada (5.9

mm/min) y posteriormente se liofilizo. Durante el proceso de congelación
unidireccional se producen frentes de congelación perpendiculares a la
dirección de inmersión en los que los cristales de hielo apartan las “impurezas”,
que en este caso serian las bacterias y el alcohol polivinilico.

 Una vez eliminado el hielo por liofilizacion se obtiene una matriz porosa de
alcohol polivinilico en la que quedan retenidaslas bacterias. En este caso las

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bacterias se recubrieron con alginato-glucosa para protegerlas durante el

proceso de congelacion criogenica. Métodos similares de protección deben
usarse si se pretende inmovilizar sistemas biologicos sensibles al proceso de
congelación. Otra ventaja de este metodo es que se obtienen monolitos con la
forma y geometria del recipiente que contiene la suspensión que se congela,
en lugar de los clásicos polvos que dan como resultado los otros métodos de
inmovilización. También es posible modular el tamaño de poro al jugar con la
relación masa suspendida/agua de la suspensión a congelar y con la velocidad
de inmersion. De ahi que estos métodos novedosos de inmovilización de
células abran un abanico de posibilidades empleando matrices solidas de
diversa naturaleza, y asi de esta forma lograr diseñar sistemas de fermentación
que trabajen en reactores continuos.

 Asimismo, existen otros métodos modernos que no requieren del uso de

dispositivos inmovilizadores complejos. Uno de estos métodos es el uso de
catalizadores artificiales inertes, como los nanotubos de carbono, que inducen
la floculación de los micro-organismos. Utilizando nanotubos de carbono,
células de Saccharomyces cerevisiae han sido inmovilizadas exitosamente por
el método de floculacion . Aunque esta técnica aporta buenos resultados con
respecto a la inmovilización, la síntesis selectiva de nanotubos de carbono
sigue siendo costosa.
 Es común que la inmovilización de levaduras y enzimas con los métodos
mencionados anteriormente enfrenten problemas técnicos y científicos. No
obstante, es importante plasmar una visión sobre las expectativas y
potencialidades que tienen estos materiales en el proceso de fermentación
alcohólica. Por lo tanto, surge la motivación para realizar investigación
profunda y novedosa fundamentada en el hecho de que los recientes avances
en la síntesis de micro y nano materiales porosos aun no se han permeado al
campo de la catálisis con levaduras.

 Por lo cual, se abren nuevos horizontes en el area de investigación y aplicación

de estos métodos de inmovilización de células.

APLICACIONES DE INMOVILIZACION DE CELULAS:

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EN FERMENTACION DE VINO (diversos métodos de inmovilizar células de

levaduras)

1. MATERIALES:

2. PROCEDIMIENTO:

2.1Reactivación del cultivo Saccharomyces sp.

Se sembró por estría en tubos de agar Sabouraud la cepa de levadura. Incubar a

temperatura ambiente por 3 a 4 días.

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2.2 Proliferación celular

.A partir de la cepa reactivada se sembró por superficie en 1 placa de agar Sabouraud
con la ayuda de un hisopo estéril. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 4 días.

2.3 Cosecha de células y obtención del inóculo

a. Se colocó 3 ml de solución salina fisiológica (al 0.85%) en la placa sembrada y

5 perlas de vidrio estéril, se movió suavemente la placa hasta obtener la
suspensión celular, colocamos la suspensión en un tubo falcon estéril.

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b) Colocar en agitación a 200 rpm por 18 horas a temperatura ambiente

(procedimiento no ejecutado

c) realizar el recuento celular utilizando la cámara de Neubauer (109 cél/ml).

2.4. Inmovilización de células

.a.) Se tomó los 3.4 ml. del inóculo y se mezcló con 100 ml. de agar-agar fundido a
42ºC al 3%,(concentración celular final 10-8cél/ml).

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b) Con ayuda de pipetas estériles se tomó agar-agar con levaduras (mantenido en

baño maría 42ºC) se deja caer gota a gota en forma rápida en aceite vegetal,
contenido en un frasco de vidrio sumergido en un recipiente con hielo en forma
permanente.

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C) Las perlas son lavaron con agua corriente y destilada estéril en forma sucesiva para
desprender el aceite de su superficie

2.5. Producción de alcohol utilizando las células inmovilizadas.

a.)Se preparó un mosto de fruta de 2000 ml. A este se le agregó las células de
levaduras inmovilizadas en agar –agar y se dejó fermentar por espacio de una
semana. Se realizaron las evaluaciones diarias determinando consumo de sustrato
(azúcar) utilizando un refractómetro (realizar la curva consumo de sustrato/tiempo).

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b) Posteriormente, una vez terminada la fermentación, las perlas o células

inmovilizadas fueron recuperadas del fermento y colocadas en una solución de
glucosa al 20% (utilizamos agua pasteurizada a 85°C).

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3. RESULTADOS

3.1 Evaluación de la Determinación de Azúcares Reductores.

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3.2 Análisis Organoléptico del Fermento

DISCUSIÓN

La inmovilización de levaduras disminuye la mayoría de los problemas que plantea la

fermentación utilizando células libres. Este sistema tiene la ventaja de poder manejar
la densidad celular, previa al inicio de la fermentación. Además, facilita el sistema de
operación del proceso de fermentación continua, evitando el paso de eliminar las

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levaduras del fermentador. La inmovilización celular desacopla el crecimiento

microbiano de los procesos metabólicos de interés industrial.

Es así, que diversos grupos de investigación han empleado este sistema de levaduras
inmovilizadas especialmente del género Saccharomyces para la obtención de variados
productos de interés industrial como el vino por ejemplo. En el laboratorio tras reactivar
e inmovilizar el cultivo de Saccharomyces y ver su capacidad fermentativa, logramos
determinar que los azúcares (glucosa y fructosa) del mosto disminuyeron en un 80%,
los cuales han sido empleados por las células y esto debido a que ellas necesitan
fuentes carbonadas para su desarrollo.

Durante el proceso de fermentación, hubo la conversión de los azúcares a etanol, que

es el metabolito esperado en estos bioprocesos, sin embargo no se pudo medir los
grados generados en durante el desarrollo de la práctica. Por otro lado no todas las
levaduras se inmovilizaron, ya que hubieron brotes que se filtraron delegar-agar
(debido derrepente a su concentración) y se consolidaron como células libres. Por
último, la gran ventaja de este bioproceso es que se pueden reutilizar las levaduras
inmovilizadas en el agar-agar, siempre y cuando se le suministre una fuente
carbonada que les permita estar viables para una próxima fermentación.

CONCLUSIONES

 Existe viabilidad de las levaduras inoculadas en el mosto, ya que hubo una

considerable reducción de azúcares y aumento de acidez.

 Adicionalmente se registró la presencia de Etanol, característica descubierta en

el análisis organoléptico.

 El Agar-Agar al 3% resultó ser un eficaz inmovilizador celular.

 El tiempo es un factor importante cuando se maneja fermentaciones con

células inmovilizadas.

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 La concentración celular de cada perla fue adecuada para la cantidad de mosto

empleado.

 EL aceite común utilizado fue un buen formador de perlas de agar-agar, debido

a su propiedad hidrofóbica.

 La inmovilización de células, este proceso puede ayudar a mejorar la

produccion de alimentos, farmacos, quimicos y bioproductos de interes
cientifico y economico.

 los procesos que utilizan levaduras inmovilizadas en soportes gelificantes,

proporcionan la oportunidad de superar los largos tiempos de fermentación y
maduración encontrados en las industrias cerveceras tradicionales

BIBLIOGRAFIA:

 Casas Alvero, C., González Anadón, G., Lafuente Sancho, F.J, Lema Rodicio,
J.M. (2005). Ingeniería Bioquímica (1ª edición). Síntesis. p. 107. ISBN 84-7738-
611-0. «Biocatalizadores Inmovilizados». Consulta

 DURAN-PARAMO.PhD. thesis, Universite de Thecnologie de Compiegne,

France. 1997.

 EDWIN BALDEON CH, VICTOR MEZA C, JULIO GIRALDO H. Evaluación de

un fermentador conlevaduras (S. cerevisiae ) inmovilizadas en perlas de
cerámica . Anales Científicos. UNALM. 2004.Vol LVIII

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