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LA ASOCIACIÓN DEL HUESO Y LOS OSTEOCLASTOS CON LA CALCIFICACIÓN

VASCULAR
Abstracto
La presencia de tejido óseo en arterias calcificadas puede proporcionar una visión de la fisiopatología y la
reversibilidad potencial de la calcificación, pero el predominio, la distribución y los determinantes del hueso
y los osteoclastos en las arterias calcificadas son desconocidos. Los especímenes de 386 arterias de
amputaciones más bajas del miembro en 108 pacientes fueron examinados retrospectivo. La calcificación
estaba presente en 282 arterias a partir de 89 pacientes, que era medial en el 64%, intima en el 9%, y ambos
en el 27%. El hueso estaba presente en el 6% de las arterias, esencialmente todas las cuales fueron calcificadas
pesadamente. El muestreo múltiple reveló que la prevalencia verdadera del hueso en arterias fuertemente
calcificadas era el 25%. El hueso era más común en calcificaciones intermedias más bien que intímales (el
10% contra el 3%, p = 0.03) pero no varió con la localización de la arteria (sobre contra debajo de la rodilla).
Las arterias fuertemente calcificadas con el hueso eran más probables venir de los pacientes que eran más
viejos (p = 0.04), tenían diabetes (p = 0.06), o estaban recibiendo warfarina (p = 0.06), pero no había asociación
con el género o la falta renal. El hueso era casi siempre adyacente a calcificaciones, a lo largo de la periferia,
pero nunca adentro. La coloración para las proteínas hueso-específicas osteocalcina y osterix fue observada
en el 20% y el 45% de arterias pesadamente calcificadas sin el hueso visible. Los osteoclastos estaban
presentes en el 4,9% de las arterias, todas las cuales estaban fuertemente calcificadas y la mayoría de las cuales
contenían hueso. La ausencia frecuente del hueso en recipientes pesadamente calcificados y el patrón
histológico sugiere fuertemente un secundario algo que acontecimiento primario. El reclutamiento de
osteoclastos a las calcificaciones vasculares puede ocurrir pero es raro, sugiriendo una capacidad limitada de
revertir calcificaciones.
INTRODUCCIÓN Puesto que la presencia de hueso en arterias
calcificadas no se ha estudiado extensivamente, su
La calcificación vascular es una lesión común para
prevalencia y epidemiología así como su histología
la cual la patofisiología y el tratamiento siguen
son desconocidas. Esto podría proporcionar
siendo inciertos. Un hallazgo intrigante es la
indicios de si la formación ósea es un proceso
presencia del hueso en algunas arterias
primario o secundario, mientras que la
calcificadas, que tiene implicaciones importantes
identificación de los factores específicos de los
en términos de la patofisiología y de la
vasos y de los pacientes podría ayudar a dilucidar
reversibilidad de la calcificación así como los
los mecanismos subyacentes y potencialmente
mecanismos para la formación del hueso de de
llevar a medidas preventivas. Aunque el foco se ha
novo. Mientras que la presencia de hueso ha
centrado en los osteoblastos y la transformación
sugerido que la calcificación es un proceso
osteoblastica, los osteoclastos son igualmente
osteogénico, iniciado a través de la trans-
importantes las células óseas específicas
diferenciación osteoblastica de las células
responsables de la resorción ósea. Estas células
musculares lisas, el hueso no se observa a menudo
serían necesarias para quitar el hueso de arterias
y los marcadores osteogénicos no están siempre
calcificadas y se pueden también requerir para
presentes, levantando la posibilidad que la
quitar las otras calcificaciones puesto que también
osteogénesis es un evento secundario. La
se componen en gran parte de la apatita altamente
conversión de calcificaciones al hueso podría
insoluble. Sin embargo, esencialmente, nada se
hacerlos más permanentes como tejido uno mismo-
sabe sobre este proceso en arterias calcificadas.
que perpetúa, con la revocación que requiere
cambios en el metabolismo del hueso que también Pacientes sometidos a amputaciones proporcionan
afectaría al esqueleto. Finalmente, la identificación una excelente oportunidad para estudiar estas
de los factores responsables de la formación del preguntas ya que esta cirugía se realiza en un gran
hueso en arterias calcificadas puede proporcionar número de pacientes con una variedad de
la penetración en los mecanismos para formar el condiciones subyacentes. Una gran proporción de
nuevo hueso. estas arterias están calcificadas, y muestras de
todas las arterias principales se preparan
habitualmente durante la examinación patológica. generalmente en dos secciones (proximales y
Como parte de un estudio sobre la histopatología distales) de cada arteria tibial. Sin embargo, no se
de la enfermedad arterial periférica, las arterias de realizaron secciones seriales. Para algunas
los especímenes de amputación también fueron muestras, los bloques de tejido original se
examinadas para la presencia de hueso y obtuvieron y se prepararon secciones adicionales.
osteoclastos. Secciones de tejidos teñidos con hematoxilina y
eosina (H & E) fueron revisados para este estudio.
La calcificación fue delineada por los basófilos de
MÉTODOS la coloración, generalmente presente en grandes
colecciones. En la capa intermedia esta fue
Pacientes clasificada semi-cuantitativamente de 1 a 4, donde
Pacientes con enfermedad arterial periférica (EAP) 1 indica calcificación apenas visible, que aparece
y amputaciones de extremidades inferiores fueron generalmente como un polvo, y 2 a 4 indican áreas
identificados prospectivamente de búsquedas de la confluentes de la calcificación que comprende
programación quirúrgica y retrospectiva de menos del 10%, 10 – 50%, y > 50% de la nave
búsquedas electrónicas de los registros médicos circunferencia, respectivamente, previamente
electrónicos. Casos fueron seleccionados calcificación Intimal descrita. Fue clasificada en
intencionalmente para asegurar una representación una escala similar, excepto que los grados 2-4
adecuada de los pacientes con y sin factores de fueron asignados cualitativamente. Ósea fue
riesgo diferentes. Se excluyeron las amputaciones identificado como material eosinófilo denso, bien-
de los pies o los dedos del pie y amputación demarcada que demostró birrefringencia lineal con
realizada para indicaciones que no sea de PAD luz polarizada. Hueso inmaduro (también llamado
(émbolos, síndromes compartiméntales, primario o tejido) exhibió alborotado
enfermedad común, neoplasias, trauma). Se birrefringencia lineal mientras hueso maduro
revisaron expedientes médicos individuales para (también llamado secundario o laminar) exhibieron
identificar diabetes mellitus, insuficiencia renal birrefringencia paralelo. Osteoclastos se
terminal (ESRD), historia de tabaquismo, uso de identificaron como células gigantes multinucleadas
warfarina y la creatinina sérica basal en el momento con citoplasma eosinófilo. La inmunoperoxidasa
de la cirugía. Diabetes mellitus se definió como una que manchaba para SM22α, osteocalcina y osterix
historia de diabetes en el expediente médico o el fue realizada como previamente described3 con
uso de insulina o medicamentos hipoglicemiantes clon 1A4 ratón monoclonal anticuerpos (Sigma-
orales. ERT se definió como la diálisis ambulatoria. Aldrich), anticuerpo monoclonal de ratón OC4-30
Una historia de fumar incluyó tabaquismo actual y (Abcam) y anticuerpo policlonal de conejo,
pasado. Este protocolo fue aprobado por la Junta de respectivamente (Abcam). La hematoxilina se
revisión institucional de Emory Universidad. utilizó como un contraste.
Consentimiento del paciente no se obtuvo ya que Estadísticas
este fue un estudio retrospectivo pero información
para el paciente era anonimizada y la identificada Las variables continuas se expresan como medios
antes del análisis. ± errores de estándar y las diferencias determinadas
por dos colas prueba de t. Diferencias entre las
Análisis histológico variables categóricas fueron determinados por la
Este fue un estudio retrospectivo de especímenes prueba exacta de Fisher para 2 × 2 comparaciones
quirúrgicos previamente, todo procesado en la y ji cuadrado prueba de arreglos de discos más
división de patología anatómica según grandes.
procedimientos estándar para empotramiento de
parafina. Además de los márgenes vasculares,
secciones de arterias específicas también se RESULTADOS
obtuvieron, generalmente de segmentos muy
Se examinaron un total de 386 arterias de 122
enfermos según el protocolo estándar para
amputaciones en 108 pacientes, de que 49
especímenes quirúrgicos. En el caso de las
amputaciones fueron superiores y 73 debajo de la
amputaciones por debajo de la rodilla, esto resultó
rodilla. La distribución de las arterias se muestra en
la tabla 1. El número medio de arterias examinadas en la sección de' métodos'. Barras sólidas y
por paciente fue de 3.6 y osciló entre 1 y 11. Las números dentro de las barras abiertas indican el
arterias solo estaban disponibles en 16 pacientes, número de arterias con hueso.
dos arterias en el 23, tres arterias en el 23, cuatro
arterias en 18, cinco arterias en 10 y seis o más
arterias en 18 pacientes. Calcificaciones vasculares Para identificar los factores asociados con el
estaban presentes en las 282 arterias de 89 independiente del grado de calcificación del hueso,
pacientes, según la evaluación de H & E tinción, análisis posteriores incluyeron sólo las arterias con
con calcificación medial presente en el 64%, la la calcificación pesada. Como se muestra en la
calcificación intimal en el 9% y en 27%. En tabla 2 figura 2, el hueso era mucho más frecuente en las
se muestran las características de los pacientes con regiones de la calcificación medial que en las
y sin la calcificación arterial y, como era de esperar, regiones de la calcificación intimal. Mientras que
ESRD, la diabetes y la edad fueron asociados con el hueso era más frecuente en arterias muy
calcificación arterial. El hueso fue identificado en calcificadas situadas debajo de la rodilla, esto no
23 arterias (6.0%) y, como se muestra en la figura fue estadísticamente diferente y probablemente
1, estuvo presente sólo en vasos calcificados, todos explicado por la mayor prevalencia de medial
menos uno que estaba muy calcificado (puntuación versus calcificación intimal en estas arterias. La
de 3 o 4). La prevalencia de hueso fue del 9,9% en relación entre características del paciente y la
arterias calcificadas y 12,8% en arterias muy presencia o ausencia de hueso en arterias muy
calcificadas. Para evaluar los errores de muestreo calcificadas se muestra en la tabla 3. Arterias muy
posibles, se prepararon secciones adicionales de los calcificadas que contiene hueso eran más
bloques de parafina de 43 muestras con propensos a venir de pacientes de edad avanzada y
calcificación severa que no contenían hueso en la de pacientes con diabetes o recibiendo warfarina,
sección original. Hueso estaba presente en sólo aunque las dos asociaciones de este último fueron
cinco de ellos y sólo en uno de 21 muestras de significación marginal. Hubo 15 pacientes con
negativas seccionadas por tercera vez. Estas cinco hueso arterial de que más de una arteria con
arterias adicionales con hueso se incluyeron en los calcificación pesada estaba disponible. De estos 58
análisis posteriores. Los resultados de múltiples arterias adicionales (excepto la primera arteria
secciones indicaron que la prevalencia verdadera calcificada para cada paciente), la prevalencia del
del hueso en arterias muy calcificadas es hueso fue de 21% frente al 9 por ciento en todas las
aproximadamente el 25%. arterias muy calcificadas (p < 0.05), lo que indica
un agrupamiento de hueso que contiene arterias en
pacientes.
Además de los pacientes con EAP severo, se
identificaron 10 pacientes con amputaciones
realizadas para otras indicaciones: seis fueron
realizados para cáncer, dos por mal funcionamiento
de prótesis, uno para la osteomielitis y uno de
embolia aguda. De las 15 arterias examinadas,
cinco no tenían ninguna calcificación y solamente
dos tenían calcificación severa. Hueso no se
detectó en cualquiera de las arterias.
La histología del hueso dentro de arterias
Figura 1. Efecto de la gravedad de la calcificación calcificadas se muestra en la figura 3. La mayoría
en la prevalencia de hueso en arterias calcificadas. de las secciones carecía de cualquier hueso visible,
Barras de la izquierda: prevalencia de hueso a pesar de la calcificación muy pesada (Figura 3A).
dentro de calcificaciones mediales. Barras de Ósea fue siempre a lo largo de la periferia de las
derechas: prevalencia de hueso dentro de las calcificaciones (figuras 3B y 3C) y en sólo una sola
calcificaciones intimales. Una mayor puntuación sección hueso presente sin calcificaciones
indica calcificación más severa, como se describe adyacentes (Figura 3D). Hueso laminar maduro
con médula ósea raramente se observó (figura 3E),
y en ningún caso se observó cartílago. Está claro en
estas imágenes que incluso cuando están presentes,
hueso estuvo ausente de gran parte de las
calcificaciones. Osteoclastos (figura 3F)
observaron en 4.9% de las arterias, que estaban
fuertemente calcificada. La prevalencia en arterias
muy calcificadas fue de 8,7%. La capacidad para
identificar los osteoclastos fue limitada por el
hecho de que casi la totalidad de estas arterias
experimentó la descalcificación ácida, lo que
imposibilitó la tinción para fosfatasa ácida tartrato-
resistente. De las arterias en las que se encontraron
osteoclastos, 63% contenía huesos. Con la
excepción de un ejemplar en el que los osteoclastos
parecen ser resorbing calcificaciones (figura 3F),
osteoclastos no fueron inmediatamente adyacentes Figura 2. Características anatómicas del hueso en
a las calcificaciones. No características de los arterias muy calcificadas
pacientes se correlacionaron con la presencia de
osteoclastos pero la muestra fue pequeña.
DISCUSIÓN
Desde fases muy tempranas de la formación de
hueso pueden no ser reconocidos por H & E En esta gran muestra de arterias de extremidades
tinción, secciones adicionales de arterias muy inferiores de pacientes con isquemia crítica del
calcificadas sin aparente del hueso fueron miembro y el hueso estaba presente en sólo el 6%
manchadas para la osteocalcina hueso-específica en el examen inicial y se limitaba casi enteramente
de la proteína y el factor hueso-específica a los buques severamente calcificados, en que la
transcripción osterix (Figura 4). Allí era frecuente prevalencia fue dos veces mayor. Si esta rareza es
la coloración de las calcificaciones de la debido a errores de muestreo o al hecho de que más
osteocalcina, como se ha observado, que representa vasos calcificados no contienen cualquier hueso se
probablemente sea vinculante de osteocalcina o abordó mediante el examen de las secciones
Unión no-específica del anticuerpo a las múltiples de arterias solo. Mientras que esto
calcificaciones de la circulación. Tinción celular se aumentó la producción de hueso, el aumento fue
observó en sólo dos de 10 secciones. Tinción mínimo por la tercera sección, indicando que el
celular osterix fue observado en cinco de 11 hueso estaba ausente en las tres cuartas partes de
tramos. Especificidad del anticuerpo fue arterias muy calcificadas. La prevalencia de hueso
confirmada en las secciones de hueso humano y en arterias calcificadas no se ha divulgado
ratón neonatal columna como se describió previamente, pero la escasez de hueso era constante
anteriormente. Puesto que la transformación con un estudio previo en válvulas calcificadas
osteogénica debe ir acompañada de pérdida del corazón humano, de que sólo 13% contenido del
fenotipo del músculo liso, las arterias también hueso.
fueron manchadas para la proteína del músculo liso
La ausencia de hueso en la mayoría de las arterias
SM22α. Como se muestra en los 4F y figuras 4E,
muy calcificadas, no se puede explicar por la
hubo fuerte coloración de células inmediatamente
incapacidad para detectar la formación temprana de
adyacentes y dentro de las calcificaciones.
hueso ya que la osteocalcina fue detectada en sólo
Mientras que algunas calcificaciones mostraron
20% de arterias muy calcificadas desprovista de
poca coloración adyacente, esto fue debido
hueso. Osterix, un factor de transcripción
principalmente a pérdida de la célula en lugar de
osteogénico del hueso-específica, se detectó más
pérdida de la coloración.
comúnmente, que indica osteogénesis muy
temprano o que osterix expresión no conduce
necesariamente a la osteogénesis. Estudios previos
han implicado la diferenciación osteogénica de las severidad de la calcificación. Después de
células musculares lisas como un evento inicial en contabilidad para al incluir solamente pesadamente
la calcificación vascular basada en la expresión de calcificadas las arterias en los análisis, parecen
genes osteogénicos y proteínas en arterias haber cierta especificidad anatómica. Ósea era
calcificadas de los seres humanos y en modelos mucho más probable ser asociado a calcificación
animales. Sin embargo, muchos de estos genes, medial y más íntima. La importancia de esto está
como la osteopontina, fosfatasa alcalina y Runx2, clara pero podría estar relacionado con el
no son específicos para el hueso, y un estudio pathophysiologies diferentes de estas lesiones
previo de la temprana calcificación en las arterias distintas. Sin embargo, puesto que fué la
del pecho humano no pudo demostrar la expresión calcificación medial generalmente más extensa que
de proteínas osteogénicos más específicas. la calcificación intimal y ningún método fiable para
Además, una concomitante pérdida del fenotipo del comparar la severidad de los dos, la predilección
músculo liso, como lo indica la coloración para por los medios de comunicación podría explicarse
SM22α, no se observó en arterias calcificadas en parte por la severidad de la calcificación.
periféricas. Los resultados son coherentes con otros
Factores específicos del paciente también
mecanismos de calcificación vascular tales como la
aparecieron determinar la presencia de hueso en
pérdida de los inhibidores endógenos o cambios en
arterias muy calcificadas desde hueso arterial fue
la matriz extracelular, en lugar de transformación
más frecuente cuando otras arterias del mismo
osteogénica del músculo liso vascular.
paciente contienen huesos. Hueso arterial era más
La escasez de hueso en arterias calcificadas, su probable que ocurra en pacientes mayores y en
restricción a arterias muy calcificadas y su pacientes con diabetes o recibiendo warfarina,
ubicación en la periferia de calcificaciones y nunca aunque las dos asociaciones de este último fueron
dentro, sugieren fuertemente que la formación de de significación marginal. Warfarina promueve la
hueso es un evento secundario en la calcificación calcificación vascular reduciendo la carboxilación
vascular. El hecho de que la coloración para y la actividad de la matriz Gla proteína, un
marcadores osteogénicos estuvo ausente en la inhibidor endógeno de la calcificación. Esta
mayoría de arterias muy calcificadas también proteína también se une y hace inactivo la proteína
discute contra un papel primordial para la morfogénica ósea 2, que se expresa en arterias
transformación osteogénica. La posibilidad de que calcificadas, posiblemente explicando la mayor
la calcificación puede inducir osteogénesis es prevalencia de hueso arterial en pacientes que
apoyada por el hallazgo que hidroxiapatita induce reciben warfarina. Sin embargo, edad, diabetes y la
la expresión de Runx2 en las células de músculo warfarina son todos factores de riesgo de
liso vascular en cultivo. Por otra parte, las calcificación medial y, pese a los intentos de
calcificaciones podrían atraer células circulantes control para esto, podrían estar influyendo en
precursores osteoblásticos evidenciada por la formación ósea simplemente a través de la
presencia de precursores osteogénicos expresando calcificación más severa que no era perceptible en
osteocalcina en válvulas aórticas calcificadas en la evaluación cualitativa. El hecho de que estos
circulación. La presencia de hueso en hasta un factores de riesgo no afectan a la severidad de la
cuarto de arterias muy calcificadas tiene calcificación medial en especímenes de la
implicaciones terapéuticas. Una vez formado, amputación podría argumentar contra esto.
hueso arterial sería un tejido autoperpetúa cuyo También, ERT no se asoció con hueso arterial,
metabolismo sería similar al hueso esquelético. aunque se asocia con una mayor calcificación
Así, la formación podría continuar bajo medial en especímenes de la amputación.
condiciones normales y sólo podría evitarse
Osteoclastos son notablemente raros en arterias
mediante medidas que impiden la formación de
calcificadas. Ya que las calcificaciones arteriales
hueso en general. Además, las terapias que
están compuestas de CA y otras formas altamente
reabsorben hueso arterial tendrían similares efectos
insolubles de calcio, un proceso biológico similar a
deletéreos sobre el esqueleto.
la reabsorción osteoclástica en hueso sería
Es evidente que el parámetro más fuertemente necesario para su eliminación. La presencia
asociado con la formación de hueso fue la ocasional de osteoclastos demuestra que reclutaron
a calcificaciones vasculares pero su rareza indica intermedia, calcificación (ateroma) íntima también
que este proceso está deteriorado en la mayoría de estuvo presente y presumiblemente es
los casos. No había ningún patrón aparente a esto representante de la calcificación intimal que es
salvo que los osteoclastos se encontraron sólo en común en las arterias coronarias y central. Debido
arterias muy calcificadas y generalmente las que a la predilección del hueso por calcificación
contienen hueso, consistente con el reclutamiento a medial, es poco probable que hueso sería más
través de la secreción de citocinas como ligando frecuente en estas otras arterias.
RANK por osteocitos. La escasez de osteoclastos
SIGNIFICACIÓN CLÍNICA
implica una limitada capacidad de inversión de
calcificaciones vasculares y que si no recluta Este estudio demuestra por primera vez la
osteoclastos contribuye a la severidad de la frecuencia y distribución anatómica del hueso y
calcificación vascular. osteoclasts dentro de calcificaciones arteriales, así
como los asociados a características de los
Este estudio fue limitado a las extremidades
pacientes. Los datos tienen implicaciones para la
inferiores y se sabe que varían entre camas
patogenesia de la calcificación vascular en que la
arteriales la calcificación vascular. Sin embargo,
formación de hueso parece ser algo secundario y no
esta variabilidad se refiere principalmente a la
primario, y las implicaciones para la terapia en la
propensión a desarrollar la calcificación y el tipo de
que la formación ósea y la escasez de los
calcificación. Mientras que la calcificación en las
osteoclastos harían calcificación difícil de revertir.
arterias de la extremidad inferiores es sobre todo
Figura 3. Hueso en arterias calcificadas. (A) pesadamente calcificada arteria sin hueso. (B y C) Hueso
(flechas) junto a calcificaciones (D) hueso (flechas) que rodea una calcificación. (E) maduro del hueso
laminar con médula (flecha). (F) osteoclastos (flechas). Los dos osteoclastos a la izquierda parecen ser
resorbing la calcificación (calcif). (Hematoxilina y eosina manchas.)

Figura 4. Inmunohistoquímica de arterias calcificadas. Negativo (A) y positiva (B) celular (flechas) la
coloración de osteocalcina en arterias muy calcificadas. Nótese la coloración inespecífica de
calcificaciones. Negative (C) y positiva celular (D) (flechas) de tinción para osterix en arterias muy
calcificadas. También hay no específico de calcificaciones. Tinción para SM22α reveló la coloración de las
células musculares lisas inmediatamente adyacente (E) y calcificaciones (F).

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