Perwarnaan Mikroorganisme

 Tujuan

Mahasiswa dapat melakukan berbagai metode pewarnaan bakteri

 Landasan teori
Mengamati mikroba dalam keadaan hidup adalah sangat sulit walaupun telah
menggunakan mikroskop. Terutama pengamatan pada sel bakteri. Sel bakteri
ukurannya sangat kecil dan transparan (tidak berwarna). Oleh sebab ithu
dikembangkan metode pewarnaan pengamatan. Dengan metode pewarnaan
pengamatan terhadap sel bakteri menjadi lebih jelas. Bahkan hasil pewarnaan ini
dapat digunakan untuk pewarnaan lebih lanjut dan mendalam, diantaranya digunakan
dalam penentuan jenis atau identifikasi.
Banyak metode pewarnaan yang dapat dilakukan dan mempunyai tujuan-
tujuan tertentu diantaranya adalah:
1. Mempermudah melihat bentuk jasad mikroba
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan
kimia yang ada dapat diketahui.
Ada berbagai macam metode pewarnaan. Teknik perwarnaan tersebut adalah
pewarnaan sederhana, pewarnaan gram,pewarnaan tahan asam(acid fast ), pewarnaan
kapsula, pewarnaan endospora, pewarnaan negatif.

I. PERSIAPAN PEWARNAAN
o ALAT DAN BAHAN :
1. Obyek glass 6 buah
2. Kawat inokulasi 1 buah
3. Pembakar bunsen 1 buah
4. Alkohol 70%
5. Biakan murni
6. Kertas tissue
7. Sabun cuci
 o CARA KERJA :
1. Bersihkan obyek glass dengan sabun cuci dan air panas sampai bersih dan
keringkan. Selanjutnya bersihkan dengan alkohol sehingga bersih dari
kotoran dan minyak.
2. Siapkan alat dan bahan di dalam entkas atau laminar yang telah disterilkan
. sterilkan kawat inokulasi dengan cara dipanaskan diatas api sampai pijar.
3. Ambil biakan murni yang berumur 1x24 jam, lepas penutup tabung
tersebut dan sterilkan mulut tabung reaksi dengan cara melewatkannya
melalui api.
4. Ambil bakteri dengan kawat inokulasi, lalu mulut tabung reaksi dilewatkan
diatas api dan ditutup kembali.
5. Pindahkan inokulum tersebut ditengah obyek glass yang telah ditetesi
sedikit air dan sebarkan dengan diameter kurang lebih 1 cm hingga rata.
6. Keringkan sediaan bakteri dengan dilewatkan beberapa kali diatas api.
7. Sediaan bakteri siap digunakan untuk pewarnaan.

II. PEWARNAAN SEDERHANA

Teknik pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat pewarna.

Kebanyakan sel bakteri dapat diwarnai dengan mudah menggunakan teknik
pewarnaan ini karena sel bakteri bersifat basofilik (suka akan basa), sehingga
zat warna yang digunakan bersifat basa.jika warna terletak pada ion bermuatan
negatif maka senyawa tersebut dinamakan zat warna asam, contoh :
eosin,karbol fuchsin. Salah satu sifat zat warna basa adalah mudah bereaksi
dengan bagian inti sel, sedangkan zat warna asam mempunyai sifat
bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel.
o ALAT DAN BAHAN
1. Mikroskop 1 buah
2. Beaker glass 250 ml 1 buah
3. Pipet tetes 1 buah
4. Kertas tissu sckpnya
5. Sediaan bakteri 2 buah
6. Larutan karbol fuchsin
7. Kristal violet
o CARA KERJA
1. Siapkan alat dan bahan
2. Ambil satu sediaan bakteri, tetesi dengan karbol fuchsin tunggu selama 30-
60 detik.
3. Cuci dengan air mengalir dan bersihkan dengan kertas tissu hingga kering
dan bersih
4. Amati dibawah mikroskop .

o HASIL PENGAMATAN

Berdasarkan hasil dari pengamatan yang diamati, bakteri yang ditemukan ialah
bakteri cocus atau bacillus.

o PEMBAHASAN

Tujuan dari pewarnaan sederhana adalah mengidentifikasi morfologi sel

bakteri dengan menggunakan zat warna tunggal. Prinsipnya yaitu pewarnaan
ini hanya menggunakan satu macam zat warna saja. Sebelum zat warna
difiksasi terlebih dahulu pewarnaan ini dipakai untuk melihat bentuk-bentuk
bakteri. Zat warna yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet, basic
fuchin atau safranin. Fungsi zat warna: Crystal violet merupakan pewarna
primer (utama) yang akan memberi warna mikrioorganisme target. Crystal
violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme
yang bersifat asam (Sutedjo, 1991).
 Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum
digunakan. Berbagai macan tipe morfologi bakteri (coccus, bacillus,
spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna
sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat
warna saja.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan
sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan
zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat
alkalin (komponen kromotofiknya bermuatan positif).
Pada pewarnaan sederhana, bakteri diwarnai oleh reagen tunggal.
Pewarnaan dasar dengan kromogen (zat warna) muatan positif disarankan
selama asam nukleat bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan
negatif yang menyerap dengan kuat dan mengikat kation kromogen perlu
diperhatikan lamanya waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarnaan yang
digunakan. Misalnya metilen blue terserap selama 2-3 menit, dengan demikian
bakteri yang terdapat pada sampel akan menyerap zat warna yang diberikan.
Pengecetan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas
kontras antara sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk
dari sel-sel mikroba itu sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan
zat warna khususnya warna Kristal Violet.

o KESIMPULAN
Berdasarkan pengamatan dibawah mikroskop dengan menggunakan
perbesaran 100 x 10, maka dapat disimpulkan bahwa pada sampel tersebut
ditemukan bakteri berbentuk coccus dan basillus.

III. PEWARNAAN GRAM

Prinsip pewarnaan gram adalah kemampuan dinding sel mengikat
warna dasar(kristal violet) setelah pencucian berhubungan dengan komposisi
senyawa penyusun dinding sel. Pada bakteri gram positif mengandung
peptidoglikan lebih banyak dan lemak lebih sedikit dibanding gram negatif.
Pewarnaan gram atau metode gram adalah salah satu teknik
pewarnaan yang paling penting dan luas di gunakan untuk mengidentifikasi
bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi di kenai
larutan-larutan berikut zat pewaraan Kristal violet, larutan yodium, larutan
akohol(bahan pemucat) dan zat pewarnaan tandinganya berupa zat warna
safranin atau air fucshin. Metode ini di beri nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan
bakteri Klebsiela, pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini
dibagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram
negatif. Bakteri garam positif akan memprtahankan zat pewarna kristal violet
dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun
bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna Kristal violet setelah dicuci
dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingnya yaitu dengan zat
pewarn air fucshin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan
warna ini di sebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya
(Pelczar, 2007).
Bakteri gram positif adalah bakeri yang mempertahankan zat warna
metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna
biru atau ungu di bawah mikroskop sedangkan bakteri gram negatif akan
berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis
bakteri ini terutama berdasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
.Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat metal
ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram-positif akan
mempertaahankan warna ungu gelap setelah di cuci dengan alkohol.
Sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram suatu
pewarnaan penimbal (conterstain)di tambahkan setelah metil ungu, yang
membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah
muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
perbedaan struktur dinding selnya. Banyak spesies organisme inang, sifat
pathogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel
gram-negatif terutama lapisan lipopolisakarida (Pelczar, 2007).
o ALAT DAN BAHAN
1. Mikroskop 1 buah
2. Beaker glass 4 buah
3. Pipet tetes 4 buah
4. Kertas tissu
5. Sediaan bakteri 1 buah
6. Larutan kristal violet
7. Larutan yodium
8. Larutan safranin
9. Alkohol 95%
o CARA KERJA
1. Siapkan alat dan bahan
2. Ambil sediaan bakteri, tetesi dengan kristal violet tunggu selama
kurang lebih 20 detik.
3. Cuci sediaan bakteri dengan air yang mengalir dan keringkan dengan
kertas tissu .
4. Tetesi sediaan bakteri tersebut dengan larutan yodium tunggu 60 detik,
lalu cuci dengan air mengalir dan keringkan dengan kertas tissu
5. Tetesi lagi sediaan bakteri dengan alkohol 95% tunggu selama 10-20
detik, lalu cuci dengan air mengalir dan keringkan dengan kertas tissue
6. Selanjutnya tetesi sediaan bakteri dengan larutan safranin tunggu
selama 10-30 detik, lalu cuci dengan air mengalir dan keringkan
dengan kertas tissu.
7. Amati sediaan bakteri di bawah mikroskop dan tentukan gram positif
atau gram negatif.
 o HASIL PENGAMATAN

Berdasarkan hasil dari pengamatan yang saya amati dengan perbesaran 40 x

10 , bentuk bakterinya adalah berbentuk batang atau disebut dengan basil dan
merupakan bakteri gram negatif.

Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna
utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai
oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri
tampak berwarna merah.

o PEMBAHASAN

Tujuan dari pewarnaan gram adalah untuk melakukan pengamatan

morfologi bakteri dengan pewarnaan diferensial. Prinsip pewarnaan gram
termasuk pewarnaan diferensial (untuk membedakan) karna dapat
membedakan bakteri-bakteri yang bersifat gram negatif dan positif.
Pewarnaan ini ditemukan pertama kali pada tahun 1884 oleh Criestian
Gram.

Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama

(crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh
peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada
mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu.
Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat
zat warna utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan
 dapat diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan
mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah. Fungsi zat warna:
Crystal violet yang berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid
acid pada membran/dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks
mg-Ribonucleid acid- crystal violet. Kompleks ini merupakan senyawa
yang tidak luntur dengan alkohol.
Lugol’s ladin yang berfungsi sebagai penguat ikatan pada
kompleks mg-Ribonuclead acid.
Alkohol 95% berfungsi mencuci lemak pada dinding sel bakteri.
Safranin berfungsi sebagai zar warna tandingan (lawan) luruh nya
kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal violet dari dinding sel bakteri
gram negatif (Pelczar, 2007).

o KESIMPULAN

Tujuan dari prinsip pewarnaan gram termasuk pewarnaan

diferensial (untuk membedakan) karna dapat membedakan bakteri-
bakteri yang bersifat gram negatif dan positif.

IV. PEWARNAAN TAHAN ASAM

Adakalanya suatu preparat tersebut tahan asam sehingga warnanya
tidak terhapus saat dicuci dengan asam encer. Keadaan ini merupakan ciri
khas dari suatu bakteri. Bakteri yang tidak mudah dipucatkan dengan alkohol
asam setelah diwarnai dengan karbol fuchsin panas disebut tahan asam.
Mikroorganisme yang mengandung sejumlah besar bahan lipid yang
menyerupai lilin akan tahan dengan zat warna merah. Bila warna terhapus
maka bakteri tersebut termasuk bakteri tidak tahan asam.
o ALAT DAN BAHAN
1. Mikroskop 1 buah
2. Beaker gelas 3 buah
3. Pipet tetes 3 buah
4. Pembakar bunsen 1 buah
5. Alkohol asam
6. Sediaan bakteri 1 buah
7. Larutan metilin blue
8. Larutan karbol fuchsin
9. Kertas tissu
o CARA KERJA
1. Siapkan alat dan bahan
2. Ambil sediaan bakteri dan tetesi dengan larutan karbol fuchsin, lalu panasi di
atas nyala api selama 5 menit, jaga agar jangan mendidih dan jangan
mengering
3. Setelah sediaan bakteri dingin, cuci dengan air mengalir dan keringkan
4. Tetesi dengan zat pelarut alkohol asam selama 10-30 detik atau sampai warna
sedikit merah lalu cuci dengan air mengalir dan keringkan.
5. Beri larutan biru metilin selama 30 detik lalu cuci dengan air mengalir dan
keringkan dengan kertas tissu
6. Amati sediaan bakteri dibawah mikroskop.
 o HASIL PENGAMATAN

Berdasarkan hasil pengamatan yang saya lakukan, bakteri yang saya temukan
merupakan bakterinya berwarna merah muda, berbentuk kapsul yang berarti termasuk
dalam bakteri yang tidak tahan asam.

Bakteri tidak tahan asam adalah bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat
warna karbol-fuchsin pada saat dicuci dengan asam klorida dalam alkohol warnanya
akan luntur. Larutan asam terlihat berwarna merah, pada bakteri yang tidak tahan
asam karena larutan pemucat akan melakukan fuksin alkohol dengan cepat, sehingga
sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan cat warna kedua bakteri tidak tahan
asam berwarna merah.

o PEMBAHASAN

Adakalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat

warna, kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna akan
terhapus. Akan tetapi ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya
bakteri basil-basil berspora. Maka dapat dikatakan bahwa itu adalah bakteri
tahan asam. Untuk menentukan sifat bakteri yang termasuk tahan asam dan
tidak tahan asam herus diwarnai dengan pewarnaan khusus. Pada umumnya,
bakteri tahan asam merupakan bakteri yang lapisan luarnya terdiri dari lapisan
lilin, sehingga menyebabkan zat warna sukar masuk ke dalam sel bakteri.

Untuk mewarnainya maka lapisan lilin pada sel itu harus dihilangkan,
yaitu dengan cara pemanasan yang dimasukkan supaya lilinnya meleleh,
sehingga sel tersebut bisa dengan mudah menerima zat warna. Selain sukar
menerima zat warna, bakteri tahan asam juga sukar menyerap bahan
 penghilang zat warna (pencuci), sehingga walaupun dicuci dengan larutan
asam encer, sel bakteri ini akan tetap mengikat zat warna yang telah masuk.
Sedangkan hasil bakteri yang telah didapat menyerap biru saja, ini berarti
bakteri tersebut merupakan bakteri tidak tahan asam.

o KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum yang dikerjakan yaitu, bakteri yang tidak

tahan asam akan berwarna merah.

V. PEWARNAAN KAPSUL
Kebanyakan bakteri mempunyai lapisan lendir yang menyelubungi
dinding sel seluruhnya. Jika lapisan lendir cukup tebal, ini disebut kapsula
yang tersusun oleh hasil metabolisme sel yang disekresikan. Umumnya terdiri
dari senyawa yang sangat kompleks berupa polisakarida. Fungsi kapsula untuk
melindungi sel terhadap kehadiran faktor lingkungan yang merugikan,
jugabertindak sebagai pengikat antar sel serta berfungsi sebagai gudang
makanan cadangan. Beberapa bakteri mempunyai kapsul yang berfungsi
manambah kemampuan bakteri untuk menginfeksi sel inang.

o ALAT DAN BAHAN

1. Mikroskop 1 buah
2. Beaker glass 2 buah
3. Pipet tetes 2 buah
4. Sediaan bakteri 1 buah
5. Larutan kristal violet
6. Larutan CuSO4
7. Kertas tissu

o CARA KERJA
1. Siapkan alat dan bahan
2. Tetesi sediaan bakteri dengan kristal violet tunggu selama 2 menit
3. Cuci dengan larutan CuSO4 lalu keringkan dengan kertas tisu
4. Amati dibawah mikroskop
 o HASIL PENGAMATAN

Bakteri yang saya temukan berwarn biru, kapsul tampak sebagai

bagian yang kosong di sekitar tubuh bakteri dan sekitar kapsul berwarna
gelap/ agak pekat.

o PEMBAHASAN

Pada bagian sebelah luar dari dinding sel beberapa jenis bakteri,
terdapat suatu zat semacam lender (gum). Karena zat tersebut terdapat
mengelilingi bakteri dan menyerupai kapsul, maka struktur demikian
disebut kapsul bakteri. Lendir tersebut dapat ditemui dalam keadaan tipis
ataupun tebal, tergantung dari jenis bakteri dan jenis makanan yang
terkandung dalam media. Lendir kapsul merupakan ekskresi dari dinding
sel bakteri itu sendiri dan berfungsi melindungi dirinya.

Komponen utama dari kapsul adalah air, bahn organik yang berupa
homo-polisakarida (misal selulosa, dekstran) atau hetero-polisakarida
(misal alginat), kandungan zat kimia yang tergantung dari spesies,
biasanya kapsul tersusun dari polisakarida atau polipeptida.

o KESIMPULAN

Pewarnaan kapsul adalah metode pewarnaan diferensial yang

dikhususkan untuk melihat bagian kapsul dari suatu bakteri dan
merupakan gabungan antara pewarnan sederhana dan pewarnaan negatif.
VI. PEWARNAAN SPORA (ENDOSPORA)
Spora bakteri ialah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha
mengamankan diri terhadap pengaruh buruk diluar. Segera setelah keadaan
membaik maka pecahlah spora dan bakteri tumbuh sebagaimana biasa. Spesies
tertentu bakteri yang menghasilkan spora diluar sel vegetatif atau didalam sel
vegetatif. Endospora merupakan tubuh berdinding tebal, sangat refraktif, dan
sangat resisten, juga tahan lama.
Metode ini menggunakan melachit green panas sebagai zat warna
intensif dan tidak dapat dihilangkan dari endospora dengan cara pencucian.
Untuk zat warna tandingan digunakan warna safranin. Endospora akan
berwarna hijau tetapi sisa bagian sel yang tidak mengandung endospora akan
berwarna merah terang.
o ALAT DAN BAHAN
1. Mikroskop 1 buah
2. Beaker glass 2 buah
3. Pipet tetes 2 buah
4. Sediaan bakteri 1 buah
5. Larutan melachit green
6. Larutan safranin
7. Kertas tisu
o CARA KERJA
1. Siapkan alat dan bahan
2. Tetesi sediaan bakteri dengan malachite green dan uapkan diatas air
mendidih selama 5 menit. Jaga jangan sampai kering.
3. Cuci dengan air mengalir sampai bersih lalu tetesi dengan safranin
selama 20-30 detik
4. Cuci dengan air mengalir lalu keringkan dengan kertas tissu, amati
dibawah mikroskop.
HASIL PENGAMATAN

Bentuknya lonjong memanjang, dan sporanya terletak di sentral yaitu

berada di tengah-tengah sel dan berwarna putih di tengah-tengah sedangkan
badannya di sekelilingnya berwarna hijau kebiruan/ agak pekat.

o PEMBAHASAN

Pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehinggga zat

warna utama dapat masuk ke dalam spora sehingga berwarna hijau
kebiruan. Malalui pendinginan warna utama akan terperangkap di dalam
spora, dengan pencucian zat zat warna utama yang ada pada sel vegetatif
akan terlepas sehingga pada pewarnaan kedua (safranin), sel vegetatif
akan berwarna merah.

Spora bakteri merupakan bentuk bakteri yang sedang dalam usaha

mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora biasanya
terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan.

o KESIMPULAN

Ditemukan Spora sentral pada bekteri yang diamati.

 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D,1989. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan

Irawan, 2008. Teknik pewarnaan. Mikroba
Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri
Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).
Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.
Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.
Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi
UNS.
Jutono, dkk. (1980). Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum Untuk Perguruan Tinggi.
Yogyakarta: Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM. [25 Oktober 2012]
Lay, B. W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo Persada.
[25 Oktober 2012]
anonim. (2012). pewarnaan bakteri tahan asam.
Dwidjoseputro, D.2005. Dasar- dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT Penerbit Djambatan.
Hadioetomo, R.S.1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar
Laboratorium. Jakarta: PT Gramedia.
Pelczar, M J.dan E.C.S Chan.1986.Dasar- dasar Mikrobiologi Jilid 1 Jakarta: UI Press.
Razali, U. 1987. Mikrobiologi Dasar.Jatinangor:FMIPA UNPAD.
Volk, W.A dan Margaret Fwheeler.1988.Mikrobiologi Dasar, diterjemahkan oleh: Markham,
M.sc.Jakarta: Erlangga