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PLATICIDADE GENÔMICA

Genes móveis e variação de fase

Profa. Mariana Dias Moreira


maridias@ufsj.edu.br
Campus Alto Paraopeba – Sala 218 – Bloco2
INTRODUÇÃO

DNA
Mecanismos
de reparo

Morte
programada
de células
com DNA
não reparado

Informação hereditária da célula


... alguma recombinação, mas o DNA permanecia sempre intacto
INTRODUÇÃO

 Estudou elementos transponíveis em milho (Zea mays) 1940s-1950s

 Posteriormente, estes elementos foram encontrados em outras


espécies  atualmente, sabe-se que são ONIPRESENTES! (p. ex.
constituem 50% do genoma humano)
SEQUÊNCIAS MÓVEIS DE
DNA NO GENOMA

 Elemento transponível: elementos genéticos que têm a capacidade de


se mobilizar e mover de um local para outro do genoma.
o Normais e ubíquos  componentes de genomas de procariotos e
eucariotos.
o Procariotos  transpõem de/para cromossomo da célula, plasmídeo
ou cromossomo de fago.
o Eucariotos  transpõem do mesmo ou de cromossomos diferentes.
SEQUÊNCIAS MÓVEIS DE
DNA NO GENOMA

 Sequências sem função???? Manutenção nos

 Fardo replicativo para a célula???? genomas 

 “DNA lixo”???? possuem função!

 Papel importante na expressão gênica (inserção em sequências


regulatórias)
 Causam mutações
 Reorganizam a estrutura do genoma  moldam as principais
mudanças do genoma e têm um papel importante na evolução do genoma

OS GENOMAS NÃO SÃO ENTIDADES FIXAS!


SEQUÊNCIAS MÓVEIS DE
DNA NO GENOMA

 Elementos transponíveis em procariotos:

o Sequências de inserção (IS)

o Transposons

Não têm qualquer existência independente e são somente


encontrados como uma parte de alguma outra molécula de DNA
SEQUÊNCIAS DE INSERÇÃO

 Mais simples elementos genéticos móveis (que não têm qualquer


existência independente, somente encontrados como uma parte de
alguma molécula de DNA)
 Muitos outros elementos que participam em rearranjos genéticos
compartilham características chave com as sequências de inserção.
B: Repetições invertidas (a linha vertical é o centro das repetições).

SEQUÊNCIAS DE INSERÇÃO

 Codificam apenas uma proteína  TRANSPOSASE  necessária


para o movimento do elemento de um sítio para outro
 Possuem sequências repetida invertidas (IR) em suas extremidades

NOTA: Sequências repetidas invertidas =


sequências que estão arranjadas em orientação
oposta. Podem se posicionar adjacentes umas às
outras (tandem) ou estarem separadas por alguma
sequência que não seja parte da repetição.

A: Repetições diretas

B: Repetições invertidas (a linha vertical é o centro


das repetições).
B: Repetições invertidas (a linha vertical é o centro das repetições).

SEQUÊNCIAS DE INSERÇÃO

 A referência para uma repetição invertida de uma sequência de


DNA NÃO significa que a sequência em uma fita individual é repetida em
sentido contrário, mas que a sequência da esquerda para a direita na
parte superior da fita é repetida da direita para a esquerda na parte
inferior da fita.
SEQUÊNCIAS DE INSERÇÃO
 A duplicação da sequência alvo gera repetições diretas nas
extremidades da IS.
Cópias diferentes de IS terão
diferentes repetições de
sequências alvo dependendo
do ponto de inserção.
SEQUÊNCIAS DE INSERÇÃO
SEQUÊNCIAS DE INSERÇÃO

Foram identificadas na maioria das bactérias, apesar da sua


presença e número de cópias variar frequentemente de linhagem
para linhagem

 Uma mesma bactéria pode possuir várias tipos diferentes de IS

 Elementos IS podem desempenhar um papel significativo na


variação da estrutura genômica entre uma cepa e outra.

 Também podem ser encontrados em plasmídeos bacterianos


SEQUÊNCIAS DE INSERÇÃO

 Causa de instabilidade do
plasmídeo
 A recombinação entre
elas levará a inversão ou
deleção da região
interveniente
 O mesmo pode acontecer
no cromossomo bacteriano
SEQUÊNCIAS DE INSERÇÃO

 Podem alterar o fenótipo por provocar o silenciamento de genes

 Pouco ou nenhum benefício direto para a bactéria  São


sequências parasitas????

 Podem ser replicativas  a cópia original permanece e um


duplicado é inserido no novo sítio

 Regulação: repressão da inserção quando o número de cópias é


alto

 Assim, como qualquer parasita bem adaptado, uma sequência de


inserção "coloniza" seu hospedeiro sem comprometer totalmente a
sobrevivência do mesmo
TRANSPOSONS
Década de 40: Barbara McClintock

Descoberta dos Elementos


Genéticos Móveis em Milho
“Elementos Controladores”
TRANSPOSONS

B. McClintock

Elementos que inibiam a expressão de genes para


pigmento  mutações estáveis e mutações
revertidas com alta frequência (grãos manchados)
 cruzamento tornava as mutações estáveis
revertidas com alta frequência.
TRANSPOSONS

Mutação estável –
Grão Branco

Reversão da
mutação com alta
frequência em
algumas células –
Grão manchado
TRANSPOSONS

 Posteriormente descobertos em outros eucariotos e em procariotos

 Plasmídeos  como um simples elemento poderia ter evoluído


para transportar um número de genes de resistência a
antibióticos?

Aquisição do gene de resistência a partir do cromossomo de uma


cepa hospedeira resistente.

Explica a grande distribuição de genes de resistência.


TRANSPOSONS

Responsáveis pela
transferência horizontal de
genes de resistência!
(Ex. β-lactamase TEM)
TRANSPOSONS

Estrutura dos transposons


 Similares aos elementos IS, mas mais complexos estruturalmente e

carreando genes adicionais.

o 2 tipos de transposons:

1. Transposons não compostos (CLASSE II)

2. Transposons compostos (CLASSE I)


TRANSPOSONS

Estrutura dos transposons

Transposon
não
composto
Classe II

Transposon
composto
Classe I

Duas cópias de uma IS


de ambos os lados de um
conjunto de outros genes
TRANSPOSONS

Estrutura dos transposons


Transposon não composto
Classe II
TRANSPOSONS

Estrutura dos transposons


Transposon composto
Classe I
TRANSPOSONS
TRANSPOSONS
TRANSPOSONS
O comportamento da transposição de tais elementos compostos pode ser bastante
complexo:
 as sequências de inserção podem se transpor de forma independente
 a transposição de toda a região pode ocorrer
 a recombinação entre os elementos IS pode ocorrer, levando à deleção ou inversão
da região que os separa
INTEGRONS

 Transposons grandes e complexos, construídos a partir da inserção de


genes adicionais dentro de um transposon existente.

 Região genômica que permite a inserção de cassetes genéticos, via


recombinação sítio-específica (região integron contém as sequências
para recombinação e codifica a integrase)

 Requer enzima específica  Integrase

 Formação de mutantes multi-resistentes

 Genes são transcritos a partir do promotor do integron (os cassetes


genéticos não possuem promotor)
INTEGRONS
MECANISMOS DE
TRANSPOSIÇÃO
Transposição Replicativa
 Mecanismos idênticos para IS e
transposons.

 Transposição Replicativa: uma cópia é


inserida em um sítio diferente e a cópia
original é mantida.

 Co-integrado: duas cópias do


transposon na mesma orientação.
MECANISMOS DE
TRANSPOSIÇÃO
Transposição Replicativa
 Resolução do co-integrado pode
ocorrer via recombinação, usando
enzimas do hospedeiro

 Alguns transposons codificam seus


próprios sistemas de resolução  gene
tnpR de Tn3  resolvase 
recombinação sítio-específica que
resolve os sítios dentro do transposon 
resolução eficiente do co-integrado,
independente do hospedeiro.
Transposição
Replicativa
 Cortes escalonados  duplicação da
sequência alvo.

 As extremidades livres do transposon


são ligadas às extremidades livres do
alvo (o transposon não é liberado como
molécula independente).

 A extremidade 3’ livre do alvo atua


como primer para a DNA polimerase do
hospedeiro
Transposição
Replicativa
 O plasmídeo co-integrado
contém duas cópias do transposon
na mesma orientação (repetição
direta).

 Recombinação entre duas


cópias dá origem a dois
plasmídeos contendo cada um
uma cópia do transposon.

 Plasmídeo B adquiriu uma cópia


do transposon ladeada por uma
repetição direta da seqüência alvo.
MECANISMOS DE
TRANSPOSIÇÃO
Transposição Replicativa
MECANISMOS DE
TRANSPOSIÇÃO
Transposição Replicativa
MECANISMOS DE
TRANSPOSIÇÃO
Transposição Conservativa
 Após ligação das
extremidades do transposon ao
alvo, as fitas simples do doador
são cortadas

 Liberação do alvo contendo o


transposon, sendo as lacunas
preenchidas por mecanismos de
reparo (próximo slide)

 Doador, linearizado pela


excisão do transposon, é
degradado
Transposição
Conservativa
 Mecanismo alternativo:
“cortar e colar” ou “Ctrl X +
Ctrl V”

O transposon é
completamente removido do
doador, antes de ser ligado ao
alvo

 A molécula doadora é
degradada (caso seja um
plasmídeo)
Duas vias gerais para a transposição

1) O DNA é clivado em cada lado do transposon.


2) Os grupos 3’-OH liberados nas extremidades do transposon
atuam como nucleófilos em um ataque direto nas ligações
fosfodiésteres no DNA-alvo.
Duas vias gerais para a transposição

3) O transposon está agora ligado ao DNA alvo


4) Transposição direta  a replicação preenche as lacunas em cada
extremidade.
5) Tranposição replicativa  todo o transposon é replicado para criar um
intermediário co-integrado.
Duas vias gerais para a transposição

6) O co-integrado é frequentemente resolvido depois  sistema de


recombinação sítio-específica separado.
7) DNA hospedeiro clivado depois da transposição direta  reparado pela
união das extremidades do DNA ou degradado.
REGULAÇÃO DA
TRANSPOSIÇÃO

 Altos níveis de transposição podem ser prejudiciais para o


hospedeiro celular  aumento na frequência de mutações

 Transposição replicativa  acúmulo de grande número de


transposons ou IS

 Considerando estes elementos como parasitas  não é de


interesse causar grandes danos aos seus hospedeiros

 Vários mecanismos são utilizados para controlar os níveis de


transposição
REGULAÇÃO DA
TRANSPOSIÇÃO
 A proteína TnpR de Tn3 não só age como um resolvase mas
também funciona como um repressor da transcrição do gene
transposase, tnpA

 Transcrição em níveis baixos devido à falta de um promotor forte

 IS10: mRNA antisenso  complementar ao mRNA da


transposase
REGULAÇÃO DA
TRANSPOSIÇÃO

 IS1: frameshifting ribossomal


REGULAÇÃO DA
TRANSPOSIÇÃO

 IS1: frameshifting
ribossomal 
processo infrequente,
garantindo que
poucas enzimas
funcionais serão
produzidas
ATIVAÇÃO DE GENES POR
ELEMENTOS TRANSPONÍVEIS
 A inserção de um transposon no interior de gene causa a inativação do gene 
ideia mais facilmente concebível.....

 Para alguns elementos transponíveis (IS10) este efeito pode ser inverso  a
inserção do elemento pode promover a expressão de genes adjacentes ao local de
inserção  sequências de inserção que contém promotor (pOUT)
VARIAÇÃO DE FASE

 Mecanismos adicionais de responder às mudanças ambientais,


além dos mecanismos de regulação da expressão gênica já
estudados

 Para certos procariotos uma população geneticamente


diversificada é gerada por mudanças reversíveis conhecida como
variação de fase
VARIAÇÃO DE FASE

 População possui pequena fração que contém “mutações”

 “Mutantes” são selecionados quando condições ambientais são


desfavoráveis para os “normais”

 Fenótipo “normal” volta a prevalecer quando condições voltam a ser


propícias

 Preferível em relação a mutações: todas as células possuem a


característica, embora somente algumas a expressem
VARIAÇÃO DE FASE

Variação mediada por inversões


 Expressão da fímbria tipo I em E. coli  escape do sistema imulógico do
hospedeiro  garante a sobrevivência de algumas células (sistema ON/OFF)
VARIAÇÃO DE FASE

Variação Antigênica em Campylobacter fetus


 Proteína de superfície (SapA)  torna as células resistentes à morte
no soro, mas também é um antígeno.

 Possui até nove diferentes genes sapA que codificam proteínas


antigenicamente distintas

 Cada célula expressa apenas um desses genes, os demais são


silenciados pela ausência do promotor

 Recombinações podem mover o promotor de um gene para outro


VARIAÇÃO DE FASE

Variação Antigênica em Neisseria gonorrhoeae


 Também evade da resposta imune do hospedeiro por variação
antigênica

 Produzem fímbrias que são importantes na determinação da virulência,


pois permite à bactéria atacar o tecido mucoso durante os estágios iniciais
da infecção

 Podem variar a composição da proteína que forma a fímbria, mantendo


a estrutura necessária à virulência (~50aa em N-terminal)

 Possuem vários genes pil, mas somente um expresso por vez 


mecanismo ligeiramente distinto do C. fetus.
VARIAÇÃO DE FASE

Variação Antigênica em Neisseria gonorrhoeae


VARIAÇÃO DE FASE

Variação de fase por


mal-pareamento devido a repetições
 Grandes sequências repetidas  erros durante a replicação que
resultam na perda ou ganho de uma ou mais unidades repetidas
AAAAAAAAAAAA
ATATATATATATAT
GCCGCCGCCGCCGCC
 Normalmente, a sequência se mantém inalterada após a replicação,
mas em uma pequena população surge um número diferente de unidades
de repetição  expressão gênica afetada
VARIAÇÃO DE FASE

Variação de fase por


mal-pareamento devido a repetições
 Controle da expressão de vários genes envolvidos na virulência:
o produção de polissacarídeo capsular de Neisseria meningitidis
o produção de lipopolissacarídeo antigênico em Haemophilus
influenzae, Campylobacter jejuni e Helicobacter pylori.
VARIAÇÃO DE FASE

Variação de fase por


mal-pareamento devido a repetições
 Pode ser em uma região de regulação e mudanças no seu comprimento podem alterar a
interação do DNA com proteínas reguladoras ou a RNA polimerase.
o A proteína de membrana Opc externa de Neisseria meningitidis sofre esta forma de
regulação.
o Mudanças de fase trazidas em uma repetição de bases de citosina ao lado do
promotor  muda a eficiência da iniciação da transcrição pela RNA polimerase.

10 bases 14 bases 12 bases

• Não ocorre • Gene • Expressão


transcrição expresso ligada!
fracamente
VARIAÇÃO DE FASE

Variação de fase por metilação


diferenciada
Epigenética
Variação de fase em que a variação gera fenótipos alterados,
enquanto a sequência do genoma permanece inalterada.

Ex.: A metilação do DNA tem sido historicamente associada aos sistemas de


modificação da restrição, mas pode também alterar as interações das proteínas
reguladoras de DNA e, consequentemente, é usado pelas células para regular a
expressão de determinados genes em uma fase variável
EPIGENÉTICA

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Epigenetic_mechanisms.jpg
EPIGENÉTICA

Falaremos mais sobre http://en.wikipedia.org/wiki/File:Epigenetic_mechanisms.jpg


este tema em outra oportunidade....
Variação de fase por
metilação diferenciada
em E. Coli
 Regulação da expressão de
agn43 (antígeno 43)
 OxyR liga-se ao promotor do
gene e impede a sua expressão
 Ligação de OxyR em três sítios
GATC  alvos da DAM metilase
 A metilação liga/desliga a
transcrição
 Após a replicação esses sítios
são aleatoriamente metilados 
resultando em variação de fase
(algumas células expressam
antígeno 43 e outras não)
Dúvidas?

Mas antes vamos


estudar para a Terceira
Prova!!!!

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

 DALE, J.W.; PARK, S.F. Molecular Genetics of


Bacteria. 5 ed. Wiley-Blackwell: UK, 2010. Cap. 7.