Apéndice técnicas electroforéticas

Apéndice: Aspectos Prácticos

Electroforesis de Proteínas
Materiales necesarios
a) Solución tampón: Veronal sódico 0,04 M (dietilbarbiturato sódico 8,24 g/l).
b) Solución colorante: Ponceau S 0,5 g en 100 ml de ácido tricloroacético 5%.
c) Solución decolorante: Ácido acético 5%.
d) Solución deshidratante: Metanol puro.
e) Solución transparentizadora: 87 ml de metanol + 3 ml de ciclohexanona + 10 ml de ácido acético,
preparada en el momento.
f) Solución disolvente: Ácido acético 80 %.

Procedimiento:
1) Sumergir las tiras de acetato de celulosa en el tampón al menos 10 minutos.
2) Eliminar el exceso de tampón entre dos hojas de papel de filtro.
3) Extender las tiras sobre el puente de la cubeta con la superficie penetrable1 hacia arriba,
de modo que queden planas y firmes. Se contactan con la solución buffer mediante
puentes de papel de filtro. Conviene operar rápidamente para evitar que las tiras se
sequen.
4) Sobre puente de 8,5 cm sembrar el suero con sembradores de electroforesis, de
acuerdo a la técnica elegida:
i. Microelectroforesis: microaplicación de 0,5 µl a 3 cm del borde catódico. Tiempo: 20
minutos (longitud de migración: 25 mm).
ii. Semi-microelectroforesis: semi-microaplicación de 1,5 µl a 2 cm del borde catódico.
Tiempo: 30 minutos (longitud de migración: 40 mm).
iii. Macroelectroforesis: sobre puente de 11 cm se aplican 3-4 µl a 1,5 cm del borde
catódico. Tiempo: 75 minutos (longitud de migración: 6 cm).
5) Tapar la cuba para establecer una cámara húmeda.
6) Conectar los electrodos a la fuente de poder suministrando 200V durante el tiempo
establecido anteriormente según la técnica elegida.
7) Finalizada la corrida, desconectar la cuba. Retirar las tiras y colorear durante 10 minutos.
8) Decoloración: pasar las tiras en 3-4 baños de solución decolorante hasta que el fondo
de la tira quede completamente blanco.
9) Transparentizado:
i. Sumergir las tiras en baño deshidratante 1-2 minutos en una cubeta seca.
ii. Retirar y sumergir en otra cubeta con baño transparentizador 3 minutos como
mínimo (no realizar si se cuantificará por disolución).
10) Sin secar, colocar sobre placa de vidrio eliminando las burbujas de aire con rodillo y
calentar preferentemente debajo de una lámpara infrarroja unos minutos a 5.10 cm de
distancia hasta transparencia completa.
11) Se invierte la placa sobre papel de filtro, dejando enfriar 20 minutos como mínimo.
12) Cuantificación: por disolución de las fracciones o densitometría.

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Comercialmente las tiras vienen con una esquina cortada. La superficie opaca o penetrable se reconoce colocando
la tira sobre el puente de la cubeta, con dicha esquina abajo a la derecha.

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Consideraciones:
1) Buffer: su función es ayudar a mantener un pH constante, a la vez que confiere una
carga negativa a la mayoría de las proteínas séricas a pH 8,6. Por lo tanto no debe
precipitar ni desnaturalizar las proteínas.
2) Fuerza iónica (I): 0,05 a 0,15 mol/l. A mayor I, bandas mas nítidas, pero mas juntas,
porque la migración se enlentece al competir los iones del buffer por la corriente.
3) Voltaje (V): corriente, temperatura y tiempo: en la práctica se desea una rápida
separación para preservar la nitidez de las bandas. Cuanto más tiempo dura la
electroforesis, mayor es la difusión radial y más anchas las bandas. Se puede disminuir
el tiempo disminuyendo la longitud del soporte o aumentando el voltaje; pero esto último
incrementa la corriente generando calor y ocasionando desnaturalización proteica. Una
forma de reducir el calor es disminuir la I.
4) Efecto electroforético: los iones Na+ del buffer neutralizan la carga (-) de las proteínas,
arrastrándolas en sentido contrario.
5) Electroendósmosis: todos los soportes adquieren carga en solución electroforética,
estableciéndose una circulación electrosmótica (endosmótica) de regulador hacia el
electrodo con carga del mismo signo que el medio de soporte. A mayor
electroendósmosis, bandas mas anchas con pérdida de resolución.
6) Muestra: debe extraerse sangre en forma atraumática para evitar hemólisis. Se
requieren unos 5 ml de sangre (alrededor de 2,5 ml de suero) para que la muestra
alcance para determinar proteínas totales, albúmina, realizar la corrida y realizar
ensayos adicionales de ser necesario. Se prefiere suero obtenido en forma habitual en
lugar de plasma, porque el fibrinógeno produce un pico monoclonal en la región rápida
de la -globulinas que puede prestarse a confusión.
7) Aplicación de las muestras: en forma lineal, angosta y sin sobrecargar para no perder
resolución.
8) Adsorción: durante la corrida, las proteínas se adsorben al soporte produciendo “colas”
que se manifiestan como una estela inmóvil de proteínas, disminuyendo la resolución
(generalmente por la albúmina en papel de filtro como soporte).
9) Marcadores para electroforesis: permiten controlar la corrida. Puede usarse:
a. Azul de bromofenol seco: se agrega directamente a la muestra. Una vez
solubilizados se adhiere a la prealbúmina y albúmina.
b. Sueros ictéricos: la bilirrubina se fija a la albúmina observándosela de color
amarillo intenso.

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Inmunoelectroforesis
Muestra: suero, orina o LCR. El plasma no se utiliza por su elevada concentración en fibrinógeno
en la muestra no coagulada. Las muestras de orina y LCR deben ser previamente concentradas
(50-100 veces) para llevar los niveles de proteínas a niveles detectables por IEF.

Materiales necesarios:
a) Gel de agar base:
a. Agar Noble Disco u Oxoid: 0,50 g
b. Agua destilada c.s.p.:100 ml.
Colocar en un baño de agua hirviente y agitar hasta disolución completa.
b) Buffer:
a. Dietilbarbiturato de sodio: 10,40 g
b. Ácido dietilbarbitúrico: 1,34 g
c. Agua destilada c.s.p. para disolución completa: 800 ml
Calentar, luego enfriar
d. Agua destilada c.s.p.: 1000 ml
e. pH 8,6, fuerza iónica 0,05.
c) Gel de agar tamponado:
a. Agar Noble Disco u Oxoid: 1,50 g
b. Solución tampón: 50 ml
c. Agua destilada: 50 ml
Colocar en baño de agua hirviente y agitar hasta disolución completa.
d) Colorante indicador:
a. Azul de bromofenol: 0,10 g
b. Etanol: 100 ml
e) Suero humano normal
f) Antisueros específicos:
Antiproteínas humanas totales de conejo; monoespecíficos de cabra contra IgG, IgA, IgM, cadenas
livianas  y , en la cantidad indicada de acuerdo a su título.
g) Colorante:
a. Negro Amido 10 B: 0,50 g
b. Metanol; 45 ml
c. Ácido acético glacial: 10 ml
d. Agua destilada: 45 ml
h) Solución lavadora:
a. Metanol: 45 ml
b. Ácido acético glacial: 10 ml
c. Agua destilada: 45 ml

Consideraciones:
Como soporte se puede emplear agar, agarosa o acetato de celulosa. Los geles de agar se
emplean en concentraciones del 1 a 1,5% de agar para obtener una firmeza adecuada.

Procedimiento:
1) Preparación de los portaobjetos:

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a. Con agar base: fundir el agar, dejar enfriar a 50-60ºC y antes que solidifique
colocar con pipeta 2-3 ml sobre el portaobjeto cubriéndolo en su totalidad. Llevar
a estufa de 50-80ºC hasta sequedad.
b. Con gel de agar tamponado: Colocar con pipeta 4 ml del gel tamponado fundido
sobre la película de agar base. Dejar solidificar 5 minutos a temperatura
ambiente.
2) Corte y perforación del gel: con un bisturí practicar una doble incisión perpendicular en
la parte media del portaobjetos, perfectamente centrada, de 2 mm de separación y de 65
mm de longitud. No retirar la película de agar. Luego, realizar con un sacabocado dos
orificios de 1,8 mm de diámetro y a una distancia de 14 mm entre centros, equidistantes
respecto del corte anterior. Si se desconoce la sustancia a analizar es conveniente
practicar los orificios a la misma distancia de los extremos para evitar que algunos
constituyentes de la muestra se desplacen fuera del portaobjeto.
3) Preparación de la muestra: colocar unas gotas del colorante indicador sobre un
portaobjetos e inflamar para evaporar rápidamente el solvente. Una vez frío, depositar
sobre el portaobjetos, una cantidad apropiada de muestra y suero humano normal
mezclando respectivamente con el colorante hasta que tomen color azul. Tomar 4 µl de
cada uno, y depositar respectivamente en cada uno de los orificios.
4) Corrida electroforética:
a. Ubicar el soporte en la cuba. Si los orificios donde se sembraron las muestras
son asimétricos, el punto de siembra debe encontrarse del lado del cátodo.
b. Establecer puentes con papel de filtro.
c. Tapar la cuba para establecer una cámara húmeda y conectar la fuente de
poder.
d. Ajustar la I=5 mA/portaobjeto o 200V en forma continua, por 90 minutos
(longitud de la migración: 30-35 mm).
5) Inmunodifusión:
a. Luego de la electroforesis, retirar el agar del canal con una aguja de punta
biselada y colocar con micropipeta de punta fina el antisuero.
b. Colocar el portaobjeto en una cámara húmeda de fondo plano y nivelado y dejar
difundir por 24-48 hs.
6) Elución de las proteínas no precipitadas: luego de la inmunodifusión, colocar el
portaobjetos en un baño de solución fisiológica durante 72 hs, renovándola cada 24 hs.
Luego se la sumerge 48 hs en agua destilada, renovándola cada 24 hs.
7) Secado: retirar el portaobjetos y colocar sobre la superficie libre del gel un papel de filtro
de 3 cm de ancho por 8 cm de longitud embebido en agua destilada. Llevar a estufa de
70-80ºC hasta sequedad.
8) Coloración: una vez seco, retirar el papel de filtro y sumergir el portaobjetos en el
colorante por 15 minutos. Eliminar el exceso de colorante por lavados sucesivos con
solución lavadora hasta que la misma permanezca incolora. Luego dejar secar al aire.

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Fracciones normales:
Mediante esta técnica pueden identificarse con relativa facilidad las siguientes fracciones:

Valoración semicuantitativa:
Se efectúa teniendo en cuenta los siguientes parámetros:
 Longitud del arco de inmunoprecipitación
 Espesor del arco de inmunoprecipitación.
 Posición del arco de inmunoprecipitación con respecto al surco central.

Una determinada fracción estará aumentada siempre en relación a la correspondiente del suero
humano normal cuando:
 La longitud del arco es mayor.
 El espesor del arco es mayor.
 La posición del arco es más próxima al surco central.

Aplicaciones:
Esta técnica se utiliza principalmente para evaluar las características electroforéticas e
inmunológicas de proteínas y glucoproteínas en suero, orina o LCR con fines cualitativos
(identificación específica) y semicuantitativa. La IEF es una técnica mas elaborada que la
electroforesis de proteínas séricas y se emplea rutinariamente para caracterizar anomalías
cualitativas de proteínas específicas o para analizar la composición de una mezcla compleja de
proteínas en líquidos biológicos.
Es el método más comúnmente utilizado para la identificación y caracterización de proteínas
monoclonales a través del empleo de antisueros monoespecíficos.
Ayuda a distinguir aumentos policlonales de los monoclonales en las gammaglobulinas.
Permite el análisis de Igs disminuidas o ausentes en diversos trastornos por inmunodeficiencia.

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Permite identificar cadenas livianas en la orina de enfermos con discrasias de las células
plasmáticas o trastornos autoinmunitarios.
En la enfermedad de cadena pesada los fragmentos de la cadena H de las Igs se encuentran en
cantidades mayores en el suero registrándose ausencia de precipitación con cadena liviana  y
.
Ante una gammapatía monoclonal permite ver qué tipo de inmunoglobulina es.

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Inmunodifusión Radial Simple

Técnica cuantitativa de inmunoprecipitación en gel, en la cual uno de los reactantes (por lo
común el anticuerpo) es uniformemente distribuido en una capa de gel de agar o agarosa,
mientras que el otro de los reactantes (usualmente el antígeno) se deposita en orificios
practicados en el gel).
El antígeno difunde radialmente a través de la mezcla gel-anticuerpo formando un anillo visible
de precipitado en un punto que depende de la estequiometría Ag-Ac. Como la reacción de
precipitación es dinámica, el anillo se forma primero cerca de la concavidad en el punto inicial de
equivalencia Ag-Ac. A medida que el Ag difunde, su exceso solubiliza el precipitado que sigue
difundiendo hacia afuera. Un nuevo anillo se forma en un nuevo punto de equivalencia Ag-Ac.
Se emplea para determinar concentración de Ag y Ac de una solución. Para Ig séricas y
complemento.
Materiales necesarios:
1) Agar purificado para uso en inmunodifusión: se prepara una solución al 2% en tampón veronal sódico
adicionado de 0,01% de mertiolate.
2) Antisueros específicos.
3) Antígenos patrones.
4) Placas de Petri.
5) Pipetas de 2µl, 1 y 5 ml.
6) Sacabocados de 2 mm de diámetro, para la confección de orificios sobre la placa de agar.

Método:
Una vez fundido y enfriado el agar a 50ºC, se le añade 5-10% del antisuero específico logrando
la mayor homogeneización posible. La cantidad de antisuero añadido depende de su título.
1) Se cubre la placa de Petri con una cantidad de la mezcla anteriormente mencionada de
manera de lograr una capa de gel de 1 mm de espesor, dejando en reposo hasta que
solidifique.
2) Luego se practican una serie de orificios mediante el empleo del sacabocado, los que
deben situarse a una distancia conveniente para evitar interferencias. Se necesita un
orificio para cada una de las distintas concentraciones del antígeno patrón. En uno de
los orificios de la placa se colocan 2 µl de la solución antigénica a valorar o dilución
conveniente de la misma y en los restantes, 2 µl de las diluciones del Ag patrón.
3) Las placas se mantienen a temperatura ambiente, en cámara húmeda.

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Evaluación de los resultados:

Por lectura del diámetro de los halos de
precipitación de las muestras y testigos, a
las 18 hs (Método de Fahey o de difusión
radial única) o a las 48-72 hs (Método de
Mancini).
La lectura puede realizarse sobre el
material fresco o previa desecación y
lavado. La medida directa es poco sensible
por lo cual se emplean “Técnicas de
magnificación” como graficar r2 vs
concentración del antígeno. De este
modo se obtiene una curva que permite
calcular la concentración de Ag en la
muestra.
Presenta una exactitud aproximada del 5%.
Permite reconocer conc. hasta 0,3 mg Ag/ml o 5 mg% de Ig. Puede usarse para reacciones
cualitativas de identidad o no identidad.

Consideraciones:
1) Las placas se mantienen a temperatura ambiente, en cámara húmeda antes de su
empleo o en heladera en recinto humectante.
2) Si se efectúa una dilución previa de la muestra para su siembra, el resultado final debe
estar afectado por la misma.
3) Como en la técnica de Mancini la concentración de anticuerpo en el gel es constante, se
requiere de una concentración adecuada como para obtener anillos medibles a baja
concentración de antígeno y como para que haya exceso da altas concentraciones del
mismo.

Aplicaciones:
Medición de las concentraciones de Igs séricas. Cada placa permite la identificación de un solo
tipo de Ig, porque en el agar tenemos un antisuero monoespecífico dirigido al determinante Fc o
a una determinada cadena pesada (IgG, IgA, IgM). Por sus bajas concentraciones IgD e IgE se
valoran por otras técnicas).
Disminuyendo la cantidad del anticuerpo específico colocado en el agar, se obtienen las placas
de “bajo valor”, que tienen sensibilidad aumentada para la identificación de valores reducidos de
Igs (como IgA secretoria).

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Interferencias:
Formas poliméricas de las Igs y complejos inmunitarios, dan resultados falsamente disminuidos
porque difunden más lentamente (como altas concentraciones de FR que se une a la Fc,
Mieloma A). En cambio, formas de bajo PM dan valores falsamente aumentados por difundir más
rápidamente (como IgM 7S en magroglobulinemia, LES, AR, ataxia-telangiectasia que difunde
más rápido que la IgM 19 S usada como estándar).
Una prueba útil para cuantificar la IgM 7S monomérica es la doble inmunodifusión de
Ouchterlony.
Alteraciones cualitativas (alteraciones fisicoquímicas), llevan a precipitación de inmunoglobulinas
en soluciones de baja fuerza iónica. Para evitarlo, se diluye el suero con solución fisiológica
concentrada (p.ej. al 4%) para aumentar la fuerza iónica del buffer.
Alteraciones funcionales de reconocimiento de Ag (de la región variable) o de unión a células o
complemento (de la región constante).
En neoplasias o enfermedades autoinmunes se forman crioglobulinas (Igs que precipitan a <
37ºC) que se asocian a cambios estructurales. Al haber precipitación anómala de proteínas por
efecto de la T, se dice que existen “termoproteínas” que pueden ser: picoproteínas, que
precipitan a más de 50ºC (de poca importancia porque no dan manifestaciones); crioproteínas,
que precipitan a menos de 37ºC (fan procesos vasculíticos importantes en zonas de baja
irrigación, en personas con enfermedades reumáticas).

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