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ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

MICROBIOLOGÍA BÁSICA

DOCENTE: Ing. Verónica Caballero Serrano PhD.

TERCER NIVEL “B”

PRÁCTICA 6: “CULTIVO PURO, VERTIDO Y DIFUSIÓN EN PLACA”

1. DATOS GENERALES:

NOMBRE(S): CÓDIGO(S):

LUGAR DE REALIZACIÓN: LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

FECHA DE REALIZACIÓN: FECHA DE ENTREGA:

2018/06/06 2018/06/15

Riobamba – Ecuador
2. INTRODUCCIÓN:

Cultivos puros.
El cultivo puro presenta las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y
otros microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el
manejo del laboratorio.
Los métodos de vertido en placa y extensión en placa
En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra
en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos,
que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con
mil millones de células por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una
suspensión con un centenar de células por mililitro. Por tanto, se realizan diluciones
seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien.
Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml
(le medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir
las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede
proceder de dos maneras diferentes.
 En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar
fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y
otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán
más grandes.
 En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembran
directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de un
asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las
células microbianas sobre la superficie. (Madigan,2010)
Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener
un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto,
se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos
de microorganismos.
 Métodos para aislar cultivos puros.
Técnica de siembra por estrías en placa y técnica de siembra por difusión en placa
Con un asa bacteriológica, se pasa una porción de la muestra a la superficie de un medio
de cultivo hecho a base de agar y se siembra en el medio ya sea por estría o por difusión.
Para sembrar por difusión en placa, por lo común se usa una varilla de cristal estéril para
esparcir la muestra. Esta operación hace posible adelgazar la muestra de tal manera que
en la superficie del agar quedan las bacterias separadas unas de otras. Cabe suponer que
cada colonia aislada es descendencia de una sola célula y por lo tanto un cultivo puro. En
las especies donde las colonias se agrupan de manera característica, las colonias se
desarrollan a partir de un mismo tipo de células e igualmente provienen de un cultivo
puro.
Una porción de una colonia que se pase a un medio de cultivo en tubo viene a ser un
cultivo puro. Después de una incubación adecuada, el desarrollo se observa al
microscopio o mediante cultivo para verificar si es puro. La técnica de siembra en placa
con estrías y por difusión se puede hacer convincentemente y con equipo mínimo; estos
son procedimientos de rutina que se efectúan para aislar bacteria en cultivos puros.
Aunque sus limitaciones son que solo pequeñas cantidades de la muestra pueden ser
esparcidas en la superficie del medio de cultivo.
Técnica de la placa invertida.
Su principio es la dilución de la muestra en tubos de agar fundido y enfriado. Se necesita
hacer diluciones en más de un tubo para obtener colonias bien aisladas, si es que no se
conoce la magnitud de la población bacteriana de la muestra antes de manejarla. El medio
se mantiene al estado líquido a una temperatura de 45°C para permitir que el inoculo se
distribuya adecuadamente en el medio. Una vez sembrado el medio se pone en cajas de
Petri, se deja solidificar y después se incuba. Como algunos microorganismos quedan
atrapados en el agar, se observarán colonias tanto en la superficie como en el medio
cuando este solidifica.
Técnica de enriquecimiento de cultivo.
Para mejorar las posibilidades de aislamiento de algunos tipos fisiológicos poco
frecuentes de bacterias, los procedimientos de la siembra en placa deberán
estar precedidos del desarrollo de las bacterias en un cultivo de enriquecimiento. El
principio de esto, es procurar un ambiente de cultivo diseñado que pueda favorecer el
desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que necesitaremos pero que no sea
adecuada para los demás. Los medios de enriquecimiento se usan generalmente cuando
un tipo de bacteria que queremos aislar se encuentra en muy pequeñas cantidades y se
desarrolla con mayor lentitud que muchas de las otras especies presentes en el inoculo.
(Mediaumh, 2013)
3. OBJETIVO(S):
A. OBJETIVO GENERAL
 Obtener cultivo puro mediante los métodos de vertido y difusión en placa.

B. OBJETIVO ESPECÍFÍCO
 Identificar una colonia bacteriana aislada en una de nuestras cuatro cajas
Petri realizadas el anterior laboratorio.
 Aprender los procedimientos necesarios para la elaboración de un cultivo
puro mediante el método de vertido y difusión en placa
 Describir las colonias de los cultivos puros obtenidos mediante vertido y
difusión en placa.

4. EQUIPOS Y MATERIALES:
A. Materiales:
 1 Caja Petri con cultivos mixtos
 5 tubos
 2 Cajas Petri con agar nutritivo solidificado
 50 ml de Agar nutritivo en estado líquido
 Alcohol
 Asa de transferencia
 Mechero
 Solución salina estéril o agua destilada estéril
 Jeringa de 10 ml
B. Equipos:
 Cámara de flujo laminar

1. METODOLOGÍA
 Desinfectar la cámara de flujo laminar
 Colocar 10 ml de agua destilada o solución salina estéril en 1 tubo y en los
cuatro restantes 9 ml en cada uno.
 Elegir una de las colonias de bacterias que se va a transferir.
 Dentro de la cámara de flujo laminar, esterilizar el asa de transferencia en
la llama del mechero y transferir una alícuota de la colonia seleccionada
al tubo con solución salina. Agitar el tubo hasta que se forme una
suspensión uniforme.
 Usando una jeringa de 10 ml, transferir 1ml de la solución del tubo
preparado a uno de los tubos que contienen 9ml de la solución, repetir el
proceso con los tubos restantes transfiriendo cada vez 1ml de la dilución
preparada al siguiente tubo.
 Transferir 0.1 ml de la suspensión bacteriana del último tubo al centro de
la caja que contiene Agar nutritivo solidificado. Y otro 0.1 ml de la
suspensión en otra caja que contenga Agar Nutritivo Solidificado.
 Extender la gota de suspensión bacteriana sobre toda la superficie del agar
con movimientos circulares.
 Incubar a 30℃, hasta que aparezcan colonias visibles.

6. RESULTADOS Y DISCUSION:

6.1 RESULTADOS:

CULTIVO PURO EN AGAR NUTRITIVO

24 horas 48 horas

Luego de un lapso de tiempo ya hubo un Finalizado las 48 horas las colonias


promedio pequeño de colonias bacterianas crecieron en gran incidencia y
bacterianas. estarían listas para un determinado estudio.
CULTIVO PURO EN AGAR NUTRITIVO (REPETICÓN)

24 horas 48 horas

Luego de un lapso de tiempo ya hubo Finalizando las 48 horas las colonias


un promedio mínimo de colonias bacterianas crecieron en mayor
bacterianas. incidencia que en el primer cultivo puro.

6.2 DISCUSIÓN:

 Así como lo describe Soriano, los cultivos puros son aquellos que contienen un
solo tipo de microorganismo. El modo de conseguir estos cultivos consiste en
obtener colonias aisladas, que provienen de una sola célula. Una de sus
características más representativos de los cultivos puros, son que las colonias
deben ser iguales en forma, tamaño y color.

 En cuanto a Rangel informa que la técnica para el aislamiento preciso, comienza


preparando un inóculo de siembra, que es la deposición de una pequeña porción
de la muestra en el medio o en los medios de cultivo adecuado, en función de las
especies microbianas que se espera encontrar. También recalca que para obtener
un cultivo puro es más factible emplear medios solidos como el Agar Nutritivo.

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:

7.1 CONCLUCIONES:
 Para realizar el cultivo puro se utilizó muestra de la caja Petri en donde se
sembró el hongo de la naranja ya que fue la única en donde encontramos
una colonia bacteriana separada del resto.

 Los procedimientos para la obtención de un cultivo puro fueron sencillos,


ya que consistía en utilizar la muestra de un solo tipo de microorganismo,
llevarlo a una suspensión uniforme que pase por 5 tubos y verter 0.1 ml en
pleno centro de la placa, seguido por realizar una difusión en placa y
llevarlos a la incubadora.

 Las colonias bacterianas que se presentaron en este tipo de cultivo puro


tienen las misma forma, tamaño y color como se pudo observar en los
resultados que se obtuvieron a las 24 y 48 horas.

7.2 RECOMENDACIONES:

 No jugar en el área de trabajo ya que se manipulan equipos y materiales


muy delicados y costosos.

 Nunca olvidarse la protección primaria que se necesita para ingresar al


laboratorio de microbiología.

 Desinfectar el área de trabajo una vez que ha terminado el mismo.

8. CUESTIONARIO:
1. ¿Describir y dibujar una colonia del cultivo puro?
Características Gráficos.

Superficie:

 Plana
Características ópticas:

 Tamaño pequeño
Pigmentación:

 Crema traslucida
Forma:

 Irregular
Elevación:

 Umbilicada
 Convexa
Borde:

 Irregular
(Oloarte, 2015)

2. ¿Podrían crecer bacterias anaerobias en el medio del cultivo puro?

Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al


oxígeno, sí el medio contiene un compuesto químico que reaccione con el mismo, como
el tioglicalato, que reacciona con el oxígeno manteniendo la parte inferior del tubo libre
de oxígeno. Los anaerobios también pueden cultivarse en placas Petri, si estas se incuban
dentro de unos contenedores, en los cuales se haya eliminado totalmente el oxígeno y se
haya reemplazado por un gas inerte como nitrógeno o argón.

También se puede llevar a cabo una eliminación química del oxígeno. Para ello, se
comercializan paquetes con unas mezclas (le reactivos que producen hidrógeno cuando
se les añade agua; el hidrógeno reacciona con el oxígeno en presencia de un catalizador;
la reacción consume el oxígeno produciendo agua. (López, 2016)

Un método muy sencillo para disminuir la concentración de oxigeno (y al mismo tiempo


producir anhídrido carbónico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es
encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo herméticamente; la vela consumirá
oxígeno hasta que se extinga. Esta técnica se utilizaba para cultivar anaerobios
aerotolerantes, como las bacterias del ácido láctico.
3. ¿Por qué se debe enfriar el medio a 45-50ºC?

El agar es una sustancia gelatinosa, formada por unos polisacáridos (cadenas de azúcares
como la glucosa) llamados agarosa y agaropectina. Es muy útil porque se puede mezclar
en caliente con prácticamente cualquier caldo para cultivar bacterias. Se le enfría a 45-
50ºC para evitar la formación de agua de condensación y la presencia de burbujas al
momento del vertido en las placas Petri, lo que causaría un gran problema al instante que
realicemos un cultivo puro (Madigan,2010)

9. ANEXOS

PREPARACIÓN DE UN CULTIVO PURO

10. BIBLIOGRAFIA

 Lopez, K. (2016). Bacterias Anaerobicas. Encontrado en:


http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni
_02/56/cap310.htm

 Madigan, John Martinko, Jack Parker (20 de enero de 2010) Editorial Pearson
Introducción a la Microbiología/ disponible en:
https://es.slideshare.net/rebecaoloarte/tecnicas-de-siembra-de-cultivos-puros

 Mediaumh. (12 de Junio de 2013). Goumh. Obtenido de Siembra de


microorganismo https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-
microbiologia/indice/Vertido-en -placas

 Oloarte, R. (2015). Técnicas de Siembra de Microorganismos. Encontrado en:


https://es.slideshare.net/rebecaoloarte/tecnicas-de-siembra-de-microorganismos

 Rangel, H. (2014). Cultivo Puro. Encontrado en:


http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/10/cultivo-puro.html
 Soriano, P. (2016). Cultivo Puro. Encontrado en:
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/