LABORATORIO

E.S.E. SANTIAGO DE
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PROCEDIMIENTOS Versión 1 25/03/2014
PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR PARA LA COLORACION DE ZIELH NEELSEN

1. OBJETIVO

Estandarizar el procedimiento para la realización de la coloración de Zielh Neelsen

en el laboratorio clínico de la ESE Santiago de Tunja.

2. ALCANCE

Este documento aplica al Área de coloraciones del Laboratorio Clínico de la E.S.E.

Santiago de Tunja para la realización de la coloración de Zielh Neelsen.

3. RESPONSABLE

El personal auxiliar encargado del Área de coloraciones del Laboratorio Clínico

E.S.E. Santiago de Tunja.

4. REFERENTE TEÓRICO

 Manual y guía técnica, MANUAL PARA EL DIAGNOSTICO

BACTERIOLOGIOCO DE LA TUBERCULOSIS, parte 1 baciloscopio,
Organización panamericana de la salud, oficina regional de la
organización mundial de la salud, 2008, consultado el:10/08/13,
disponible en: http://files.sld.cu/tuberculosis/files/2009/12/tb-labs-
baciloscopia1.pdf
 Ledermann Walter, UNA HISTORIA PERSONAL DE LAS BACTERIAS,
Sociedad Chilena de Infectologia, Ril Editores 2007, pág. 167,
Consultado el: 10/08/13, Disponible en:
http://books.google.com.co/books?id=pydkwNBz9dEC&pg=PA167&dq=
historia+de+la+tincion+de+ziehl+neelsen&hl=es-
419&sa=X&ei=1PMHUtX5CarO2wXe24GYDw&ved=0CCwQ6AEwAA#v
=onepage&q=historia%20de%20la%20tincion%20de%20ziehl%20neels
en&f=false
 Rodríguez Cavallini Evelyn, Gamboa Coronado Maria del Mar,
Hernández Chavarría Francisco, García Hidalgo Jorge Danilo,
BACTERIOLOGIA GENERAL: PRINCIPIOS Y PRACTICAS DE
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LABORATORIO, Editorial Universidad de Costa Rica, pág. 68,
consultado el:10/08/13, disponible en:
http://books.google.com.co/books?id=vwB0fgirgN0C&printsec=frontcov
er#v=onepage&q&f=false
 Historia y fundamento, Disponible en:
http://demostraciondelbacilodekoch.blogspot.com/2011/06/metodo-de-
coloracion-de-ziehl-neelsen_03.html
http://es.scribd.com/doc/39054818/Tincion-de-Ziehl-Neelsen
 Fundamento de la tinción de zielh Neelsen y fotografías, disponible en:
http://microinmuno.files.wordpress.com/2011/05/5-tinciones-
especiales.pdf
 Instituto Nacional de Salud. Laboratorio Nacional de Referencia
Micobacterias. Bacteriología de tuberculosis, Baciloscopia y
cultivo.

5. CAMBIOS EFECTUADOS

No. VERSIÓN DESCRIPCIÓN DEL CAMBIO FECHA

6. DESARROLLO

5.1. INTRODUCCION

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida

y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, fue
desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la
presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clínicas de
pacientes. Después dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a1926), un
bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 a 1894), un patólogo, plantearon otros
colorantes, por lo cual se les atribuye su descubrimiento.

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5.2. FUNDAMENTO

Este método se basa en que las paredes celulares de bacterias contienen

ácido graso ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50
a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos.
Por esto se denominan ácido-alcohol resistencia bacilos ácido-alcohol
resistente o BAAR. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis M.
tuberculosis y Mycobacterium marinum M. marinum y se caracterizan por sus
propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-
Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared
bacteriana que contiene ceras.

La técnica de Z-N fuerza la penetración de la fucsina básica en la pared celular

mediante la acción combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de
la capa de ácidos micólicos: el calor “derrite” el componente ceroso y el fenol
actúa a modo de disolvente, permitiendo el paso del colorante básico que se
une a los ácidos micólicos con carga negativa. Cuando cesa la aplicación de
calor y/o se elimina el exceso de fenol mediante un lavado con agua, la pared
recupera su consistencia cerosa, pero las moléculas de fucsina quedan
atrapadas en su espesor.

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Con la coloración de Ziehl Neelsen, las micobacterias se observan como
bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose
claramente contra el fondo azul.

http://microinmuno.files.wordpress.com/2011/05/5-tinciones-especiales.pdf

5.3. DEFINICIONES

 BACILOSCOPIA: en una prueba seriada de tres días consecutivos,

donde se toma una muestra de esputo (catarro), para ver qué
bacteria se encuentra presente. Esta prueba se utiliza para dictar el
diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis.
 BACTERIAS ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES: es la propiedad
física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la
fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol
y el calor.
 MICOBACTERIAS: son bacterias aerobias y no móviles (con
excepción de la especie M. marinum, que ha mostrado ser móvil
dentro de los macrófagos). Tienen ácido-alcohol resistencia, no
producen endosporas ni cápsulas y suelen considerarse gram
positivas.
 ÁCIDO MICÓLICO: Los ácido micólicos son α-alquil-β-hidroxiácidos
grasos de cadena larga (60-90 átomos de carbono) y son los lípidos
mayoritarios de la pared celular de micobacterias.
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5.3. CONDICIONES GENERALES

 El área de trabajo debe encontrarse en perfecto orden.

 Se requiere para esta prueba, extendidos hechos a partir de una muestra
clínica como esputo. Ver Manual de Toma de Muestras
 Las muestras deben estar correctamente identificadas con el número de
ingreso, nombres y apellidos completos.
 Los procedimientos de neutralización y disposición de los reactivos usados
para el desarrollo de la metodología, se encuentran registrados en el Plan
de Gestión Integral de Residuos Sólidos y Hospitalarios del Laboratorio
Clínico de la ESE Santiago de Tunja
 Todas las muestras de pacientes y controles deberán ser manipulados
como posibles agentes potencialmente infecciosos.
 Utilizar todas las normas de Bioseguridad requeridas en el Laboratorio
Clínico, para el montaje de estas pruebas, según regulaciones aplicables.
(Ver Manual de Bioseguridad)

6. EQUIPO ADICIONAL
 Microscopio con lente de inmersión
 Mecheros

7. PROCEDIMIENTO
7.1. PREPARACION DEL EXTENDIDO

 Coloque las muestras en el sitio de trabajo. Procese máximo 6 muestras a

la vez.
 Coloque el mechero entre las muestras a procesar y usted.
 Deje un espacio de la lamina para marcarla con lápiz de cera azul o negro,
indicando primero el número consecutivo del paciente y luego el número de

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la muestra (primera, segunda o tercera según el caso). El resto de la lámina
es para hacer el extendido de la muestra.
 Revise que el frasco de la muestra que se va a procesar y la lámina tengan
el mismo número.
 Coloque el mechero en la mitad entre la muestra y usted para evitar riesgo
de contaminación.
 Divida el bajalenguas en dos y con una de las partes seleccione la partícula
útil que es el moco de color verde, café o amarillo y en algunos casos tiene
sangre
 Coloque la lámina por el lado que tiene el número de registro y con el
bajalenguas extienda la partícula útil sobre la lámina de modo uniforme sin
llegar hasta el borde de ella.
 Cuando el extendido de la muestra sea muy delgado, deje secar y realice
otra vez el extendido sobre la misma lamina. Tape el recipiente que
contiene la muestra y deje secar el extendido a temperatura ambiente cerca
del mechero. No acelere el secado pasando las láminas sobre la llama, esto
deteriora el extendido y dificulta la observación al microscopio pues el calor
fuerte altera la estructura de los bacilos y su posterior tinción; además
puede generar aerosoles.
 Una vez secos los extendidos páselos rápidamente sobre la llama del
mechero tres veces con el extendido hacia arriba con el fin de fijar la
muestra.
Ver Anexo 1. Flujograma de preparación de extendido.

7.2. COLORACION

 Tenga en cuenta las láminas de control de calidad de coloración de ZN

control positivo y control negativo. (Ver control de calidad)
 Coloque las láminas sobre el soporte con el extendido hacia arriba
separadas en orden numérico.
 Cubra la totalidad de la lámina con fucsina de Ziehl Neelsen previamente
filtrada (rojo).
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 Caliente las láminas por debajo pasando la llama del mechero hasta que se
produzcan vapores. Empiece a contar 10 minutos, retire el mechero y
cuando los vapores desaparezcan caliente nuevamente, haga esto cuantas
veces sea necesario hasta completar el tiempo.
 Evite que el colorante hierva o se seque, si esto pasa agregue más
colorante y continúe produciendo los vapores.
 Deje enfriar y lave suavemente con agua de chorro.
 Cubra el extendido con alcohol ácido durante 1 minuto y después de este
tiempo lave suavemente con agua de chorro como lo hizo anteriormente.
 Cubra el extendido decolorado con azul de metileno durante 2 minutos, lave
suavemente con agua de chorro.
 Limpie con papel suave la parte de atrás de la lámina, es decir donde no
está el extendido para retirar los residuos de colorante que pueden interferir
con la lectura.
 Dejar secar a temperatura ambiente protegidos de la luz directa del sol.
 Una vez secos los extendidos revise la numeración y rotule con el nombre
del paciente, número consecutivo y el número de muestra y pase los
extendidos al área de microscopía para su observación.

Ver Anexo 2. Flujograma de Coloracion Ziehl Neelsen

8. CONTROL DE CALIDAD

Cada vez que se realize la coloración de Ziehl Neelsen es necesario haga el

montaje de controles positivo y negativo con el fin de garantizar un proceso
adecuado.
Para el control positivo se utilizarán bacilos acido alcohol resistentes, que pueden
obtenerse de la vacuna BCG.
El control negativo se realizará con bacilos acido alcohol sensibles lo cual se
puede lograr con una muestra negativa a la cual se haya realizado Baciloscopia.

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9. REPORTE DE RESULTADOS

(-) Ausencia de BAAR en 100 campos observados

(+) Menos de un BAAR por campo, en 100 campos observados
(++) 1-10 BAAR por campo, en 50 campos observados
(+++) + 10 BAAR por campo, en 20 campos observados

Los resultados serán registrados en la carpeta de registro de baciloscopias y

adicionalmente se digitan en el software CNT por número de documento o por
sección.

10. ANEXOS

ANEXO 1. FLUJOGRAMA DE PREPARACION DEL EXTENDIDO

ANEXO 2. FLUJOGRAMA DE COLORACION ZIEHL NEELSEN

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ANEXO 1. FLUJOGRAMA DE PREPARACION DEL EXTENDIDO

Disponga las muestras en el sitio de trabajo poniendo el

mechero entre las muestras a procesar y usted y proceda
a marcar la lámina con lápiz azul o negro con número
consecutivo seguido de un guión y número de muestra.

Revise que el frasco de la muestra que se va a procesar y

la lámina tengan el mismo número.
Coloque el mechero en la mitad entre la muestra y usted

Divida el bajalenguas en dos y con una de las partes

seleccione la partícula útil . Coloque la lámina por el lado
que está marcada y con el bajalenguas extienda muestra
sobre la lámina uniformemente.

Cuando el extendido de la muestra sea muy delgado, deje

secar y realice otra vez el extendido sobre la misma
lamina. No acelere el secado pasando las láminas sobre
la llama.

Una vez secos los extendidos páselos rápidamente sobre

la llama del mechero tres veces con el extendido hacia
arriba con el fin de fijar la muestra.

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ANEXO 2. FLUJOGRAMA DE COLORACION ZIEHL NEELSEN

No olvide realizar el montaje de los controles negativo y posistivo al

momento de hacer la coloración. Coloque las láminas sobre el
soporte con el extendido hacia arriba separadas en orden numérico.

Cubra la totalidad de la lámina con fucsina de Ziehl Neelsen

previamente filtrada .

Caliente las láminas por debajo pasando la llama del mechero hasta
que se produzcan vapores. Empiece a contar 10 minutos sin dejar
hervir ni secar el colorante, en este caso reponer con más colorante.

Deje enfriar y lave suavemente con agua de chorro.

Cubra el extendido con alcohol ácido durante 1 minuto y después

de este tiempo lave suavemente con agua de chorro

Cubra el extendido decolorado con azul de metileno durante 2

minutos, lave suavemente con agua de chorro.

Limpie con papel suave la parte de atrás de la lámina y deje secar a

temperatura ambiente. Pase las láminas al aárea de microscopía.

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