NRC: 5040

Bitácora de protocolos

Paúl Erazo
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
NRC: 5040
Mu-DNA: Método de extracción de ADN modular universal
adaptable para varios tipos de muestras

ADN-Mu: Suelo
El procedimiento es escalable dependiendo del peso inicial de la muestra de suelo o la
cantidad de lisado utilizada. Cabe destacar que las escalas de adición se incluyen entre
paréntesis. Muestras de mayor peso requerirán mayores volúmenes en cada paso y serán
necesarias extensiones de tiempo de centrifugación con bajo nivel de xg para lograr
resultados óptimos.
Lisis – Pasos basados en una muestra de 0.25g
1. Añadir 0.5g (2X el peso de la muestra) de esferas de granate estériles de diámetro
de 1-1.4 mm en un tubo de tapa rosca de 2mL.
2. Agregar los 0.25g de muestra en el tubo.
3. Añadir 550µL de solución de lisis y 200µL de aditivo de lisis de suelos, esto
mientras se agita en el vortex.
4. Colocar en TissueLyser II (o un aparato similar) a 30Hz por 10 minutos.
5. Centrifugar a 10000 xg por 1 minuto a temperatura ambiente.
6. Trasvasar el sobrenadante a un tubo de 1.5mL sin perturbar el pellet.
7. Centrifugar a 10000 xg por 1 minuto a temperatura ambiente.
8. Trasvasar el sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5mL sin perturbar el pellet.
Remoción de inhibidores – Pasos basados en un producto de lisis de 500-650µL

1. Añadir 300µL (0.6X en volumen) de solución floculante (flocculant solution),

exponiendo brevemente al vortex e incubando a 4ºC o en hielo por un tiempo
mínimo de 10 minutos.
2. Centrifugar a 10000 xg por 1 minuto a temperatura ambiente.
3. Sin pertubar el pellet, trasvasar el sobrenadante a un tubo de 2mL.

Unión a sílica – Pasos basados en 600-700µL de sobrenadante transferido

1. Agregar 1200µL (2X en volumen) de solución de unión (binding solution),

agitando brevemente con vortex para mezclar.
2. Transferir 650µL de la mezcla en una columna giratoria.
3. Centrifugar a ≥ 10000 xg por 1 minuto a temperatura ambiente, descartar el flujo
continuo.
4. Repetir los pasos 2 y 3 hasta que la mezcla haya atravesado la columna giratoria.

Lavado

1. Añadir 500µL de solución de lavado a la columna giratoria.

2. Centrifugar a 10000 xg por 1 minuto a temperatura ambiente, descartar el flujo
continuo.
 3. Centrifugar a 10000 xg por 2 minutos a temperatura ambiente, reemplazando el
tubo de recolección con uno nuevo de 1.5mL.

Elución

1. Agregar 100µL de buffer de elucióndirectamente a la membrana de la columna

giratoria e incubar por 1 minuto a temperatura ambiente.
2. Centrifugar a 10000 xg por 1 minuto a temperatura ambiente.
3. El ADN está ahora en el tubo de 1.5mL.
Opcional; Se puede aumentar la producción de ADN repitiendo los pasos 1 y 2 por
mayor tiempo.

Solución de problemas

Columna giratoria obstruida: Centrifugar a mayor xg por 2 minutos. De forma alternativa,

calentar la columna giratoria (incluyendo el tubo de recolección) y uniendo el contenido
de los tubos (la mezcla del sobrenadante previamente trasvasado y la solución de unión)
a 55ºC por 5 minutos para luego centrifugar a mayor xg por 2 minutos y continuar con el
protocolo.

Protocolo obtenido de: Graham S Sellers, Cristina Di Muri, Africa Gómez & Bernd
Hänfling. (2018). Mu-DNA: a modular universal DNA extraction method adaptable for
a wide range of sample types.

Extracción de AND a partir de fluidos de respiradero/ cortical

o de agua de mar
1. Asumir un filtro plano de 47mm preservado en RNAlater en un tubo de 50mL o
en un filtro Sterivex. Limpiar la parte superior del banco, las pipetas y los
bastidores con Nucleo-clean y etanol al 70%. Asegurarse de tener portafiltros
Swinnex de 25mm autoclavados y 1X PBS estéril.

Nota: Si solo extrae la mitad del filtro plano de 47 mm, guarde la mitad restante en el tubo
de 50 ml con la mitad del ARNlater. Si usa la mitad de Sterivex, almacene la mitad
restante del filtro en un tubo de 2 ml con RNAlater esterilizado y esterilizado fresco.

Las recetas importantes incluyen:

Tris-HCl 1M (100 mL, pH 8.0)

15.76 gramos Tris-HCL (MW 157.6)
80mL MilliQ H2O (filtrado a 0.22µm)
NaOH 10M a pH 8.0
MilliQ H2O (filtrado a 0.22µm) a 100mL
Autoclave
1 M NaH2PO4 –H2O (100 mL, pH 8,0)
13.799 gramos de NaH2 PO4 –H2O (MW 137.99)
80 ml MilliQ H2O (filtrado a 0.22µm)
NaOH 10M a pH 8.0
MilliQ H2O a 100 mL (filtrado a 0.22µm)
Calor bajo para disolver
Autoclave

Tampón TE (50 mL, Tris 0,01 M, EDTA 1 mM, pH 8,0)

0.5 ml de Tris 1M (pH 8.0)
0.1 mL EDTA 0.5M (pH 8.0)
49.4 mL MilliQ H2O (filtrado a 0.22µm)
Filtrar y esterilizar

NaOH 10M (100 mL)

40 gramos de NaOH
Gradualmente agregue 90 ml de MilliQ H2O (filtrado a 0.22µm)
Llevar volumen hasta 100 mL
Almacenar en plástico (puede degradar vidrio)

20% de sulfato de dodecilo sódico (100 mL)

20 gramos de SDS
Calor bajo para disolver
Filtro estéril
¡No autoclavar!
(SDS se precipitará irreversiblemente)

NaCl 5 M (100 mL)

29.22 gramos de NaCl (MW 58.44)
100 ml de MillliQ H2O (filtrado a 0.22µm)
Autoclave

0.5M de Na2EDTA (100 mL, pH 8.0)

18,61 gramos de Na2EDTA (MW 372,24)
80 ml MilliQ H2O (filtrado a 0.22µm)
~ 2 gramos de gránulos de NaOH
NaOH 10M a pH 8.0
MilliQ H2O a 100 mL (filtrado a 0.22µm)
Autoclave

5% de CTAB (100 mL)

5 gramos de bromuro de hexadeciltrimetilamonio
100 mL de MilliQ H2O (filtrado a 0.22µm)
Calor bajo para disolver
Autoclave

Proteinasa K (10 mg / mL)

Añadir 6 mL de MilliQ H2O (filtrado a 0.22µm) a 0.06
gramos de stock
Almacenar en alícuotas a -20 ° C

Lisozima (50 mg / mL)

Agregar 20 mL de MilliQ H2O (filtrado a 0.22µm) a 1
Gramo de lisozima
Almacenar en alícuotas a -20 ° C
DNA Extraction Buffer (50 ml, 100 mM de Tris, 100 mM de EDTA, 100 mM de NaH2PO4,
1,5 M NaCl, 1% CTAB)
5 mL de Tris 1M
10 mL de EDTA 0.5M
5 mL 1 M NaH2PO4
15 mL de NaCl 5 M
10 mL de CTAB al 5%
5 mL de MilliQ H2O
Filtrar esterilizar

2. Cortar el filtro en trozos pequeños sobre una lámina estéril de papel aluminio
usando una cuchilla de afeitar estéril limpia (autoclavar / flamear con etanol) y
pinzas (flamear con etanol).

3. Si extrae de Sterivex, usar alicates (flamear con etanol) para romper el cartucho,
retirar el filtro con la hoja de afeitar y cortar en 6-8 piezas. Verter RNAlater del
cartucho en un tubo de 2 mL para guardarlo en el Paso 4.

4. Colocar el filtro en un tubo nuevo de 50 mL con 10 mL de 1x PBS (esterilizado

en autoclave, filtrado a 0.22µm).

5. Enjuagar el filtro con unas pinzas, luego colocar en un tubo limpio de 2 mL.
Agregar 1 mL de DEB a un tubo de 2 mL, colocándolo sobre hielo.

6. Verter RNAlater del tubo de filtro de 50 mL en el tubo con 1x agua de enjuague

PBS y filtrar esta solución a través de un filtro de 0,2 mm de 25 mm con una
jeringa de 60 mL. Si solo se extrae la mitad del filtro, verter solo la mitad del
RNAlater.

7. Enjuagar el filtro de 0,2 mm de 0,2 mm con 10 ml de 1x PBS. Empujar el filtro

de aire para eliminar cualquier líquido.

8. Cortar el filtro de 25 mm en trozos y agregarlo al tubo de 2 ml con filtro y DEB.

9. Añadir enzimas: añadir 20 µL de proteinasa-K (10 mg / mL) y 40 µL de lisozima

(50 mg / mL) a un tubo de 2 mL, congelar el tubo a -80ºC durante 15 minutos y
descongelar a 37ºC durante 5 minutos tres veces. Puede congelarse a -80ºC hasta
el día siguiente.

10. Incubar el tubo durante 30 minutos a 37ºC en un baño María.

11. SDS y 65ºC de incubación: Añadir 50 µL de SDS esterilizado por filtración (20%
en agua) a cada tubo de 2 mL, invertir varias veces para mezclar. Incubar durante
2 horas a 65ºC en baño María.

12. Extracción de fenol-cloroformo: trabajando en una campana de humos, llenar 2

mL de tubo por el resto del camino (nivel con la base de la tapa) con fenol:
cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1, pH 8.0). Mezclar con vortex.
 Centrifugar a baja velocidad (3000 rpm) durante 5 min. Transferir la capa superior
al nuevo tubo de 2 ml y repetir (total 2 lavados).

13. Precipitación: Estimar el volumen de la solución tampón a partir de marcas de

almohadilla en el lateral del tubo de 2 ml y añadir 0.6 volúmenes de isopropanol
al 100% a temperatura ambiente. Invertir suavemente para mezclar. Incubar a
temperatura ambiente durante 2 horas para pasar la noche en la oscuridad.

14. Pellet: Centrifugar el tubo a velocidad máxima (13000 rpm) durante 30 min. Con
cuidado, vertir el tampón + isopropanol (en un tubo falcon de 50 ml y ver si el
gránulo se derramó. Si el gránulo es invisible, normalmente no se derramará).
Añadir 1 mL de etanol al 70% a un tubo de 2 mL, invertir varias veces y
centrifugar a 13000 rpm durante 10 minutos. Verter etanol. Repetir para un total
de 2 enjuagues. Secar el sedimento en Speed Vac durante ~ 15 minutos (verificar
que el tubo está completamente seco). Los pellets pueden desprenderse de los
lados del tubo, especialmente después del segundo enjuague.

15. Elución: Agregar 90-250 µL de agua estéril libre de celulasas o 1 tampón TE a un

tubo de 2 mL, mezclar (sacudir el tubo) para empapar todo el ADN posible.
Permitir que el sedimento se disuelva durante 1-2 horas en el refrigerador.

16. Verificar la concentración de ADN con Picogreen.

Protocolo obtenido de: Julie Huber & Caroline Fortunato. (2017). DNA Extraction from
Filtered Vent/Crustal Fluids or Seawater.

Protocolo de extracción de ADN EMP (Earth Microbiome

Project)
1. Antes del primer uso, la solución C5-D debe prepararse. Agregue una cantidad
igual de 100% de etanol a la solución C5-D (para el kit de 4 preparaciones = 120
mL, o para el kit de preparación 12 = 360 mL). Mezclar bien. Ponga una marca
de verificación en la casilla "etanol agregado" en la etiqueta de la tapa de la
botella.

2. Centrifugar la placa de perlas durante 1 minuto a 2500 xg para sedimentar las

perlas.

3. Retire la esterilla cuadrada de la placa de perlas PowerSoil®-htp y reserve.

4. Agregue 0.1 a 0.25 gramos de muestra de suelo o hisopo de muestra. Este es un

punto de parada apropiado y puede almacenar la placa de perlas PowerSoil®-htp
a 4 ° C cubierta con la esterilla cuadrada. Este es el paso más lento del protocolo.
Se debe tener cuidado para evitar la contaminación cruzada entre pozos de
muestra.
5. Agregue 750 μl de solución de perlas PowerSoil®-htp a los pocillos de la placa
de perlas PowerSoil®-htp.

6. Verifique la solución C1. Si la Solución C1 ha precipitado, caliente la solución a

60 ° C hasta que el precipitado se haya disuelto. La solución C1 contiene SDS. Si
hace frío, se precipitará. El calentamiento a 60 ° C disolverá la SDS. La solución
C1 se puede usar mientras aún está caliente.

7. Añadir 60 L de solución C1. Asegure firmemente la esterilla cuadrada (del paso

3) a la placa.

8. Coloque los platos sellados en un baño de agua a 65 ° C durante 10 min. No

sumergir las placas.

9. Coloque la placa de perlas PowerSoil®-htp entre los adaptadores de placas de

aluminio y fíjela firmemente al agitador de placas de 96 pocillos.

10. Agitar a velocidad 20 durante 20 minutos.

11. Centrifugar a temperatura ambiente durante 6 minutos a 4500 x g. Mientras se

centrifuga, coloque alícuotas de 250 μl de solución C2 en cada pocillo de la placa
n. ° 1 y cubra con cinta aislante.

12. Retire y deseche la esterilla cuadrada de la placa de perlas.

13. Retire con cuidado la cinta de sellado de la placa n. ° 1 y transfiera el sobrenadante

(~ 400-500 μl) de la placa de perlas a la placa n. ° 1 y pipetee hacia arriba y hacia
abajo 4 veces.

14. Vuelva a aplicar la cinta de sellado a la placa n. ° 1. Incubar a 4 ° C durante 10

minutos.

15. Centrifugue la placa n. ° 1 a temperatura ambiente durante 6 minutos a 4500 x g.

Mientras se centrifuga, coloque una alícuota de 200 μl de Solución C3 en cada
pocillo de la Placa n. ° 3, luego cubra con una Cinta de Sellado.

16. Después de la centrifugación, retire y deseche cuidadosamente la cinta de sellado

de la placa n. ° 1.

17. Evitando el sedimento, transfiera todo el volumen (~ 600 μl dependiendo del tipo
de muestra) del sobrenadante en la Placa n. ° 1 a la Placa n. ° 2.

18. Aplique cinta de sellado a la placa n. ° 2 y centrifugue a temperatura ambiente

durante 6 minutos a 4500 x g.

19. Retire con cuidado la cinta de sellado de la placa n. ° 2 y la placa n. ° 3.

20. Evitando el sedimento, transfiera todo el volumen del sobrenadante (~ 600 μl) de
la placa n. ° 2 a la placa n. ° 3 y pipetee hacia arriba y hacia abajo cuatro veces.

21. Vuelva a aplicar la cinta de sellado a la placa n. ° 3. Incubar a 4 ° C durante 10

minutos.

22. Centrifugar a temperatura ambiente durante 6 minutos a 4500 x g.

23. Retire con cuidado y deseche la cinta de sellado de la placa n. ° 3.

24. Evitando el sedimento, transfiera todo el volumen de sobrenadante (~ 750 μl) a la

placa n. ° 4.

25. Aplique cinta de sellado a la placa n. ° 4 y centrifugue a temperatura ambiente

durante 6 minutos a 4500 x g. Mientras se centrifuga, agregue 650 μl de solución
C4 a la placa n. ° 5.

26. Evitando cualquier sedimento residual, transfiera hasta 650 μl de sobrenadante en

la placa n. ° 4 a la placa n. ° 5.

27. Agregue una segunda alícuota de 650 μl (1300 μl de C4 en total) de la Solución

C4 a cada pocillo de la Placa n. ° 5.

28. Pipetee las muestras "arriba y abajo" para mezclar.

29. Coloque la placa de giro en la placa n. ° 6.

30. Cargue aproximadamente 650 μl de la placa n. ° 5 en cada pocillo de la placa de

centrifugación y aplique la cinta centrífuga.

31. Centrifugar a temperatura ambiente durante 5 minutos a 4500 x g.

32. Deseche el flujo y coloque la placa giratoria nuevamente en la placa n. ° 6. Retire

y deseche con cuidado la cinta centrífuga.

33. Repita los pasos 30-32 hasta que todo el sobrenadante haya sido procesado.
Deseche el flujo final.

34. Coloque la placa giratoria nuevamente en la placa n. ° 6.

35. Confirme que se ha agregado etanol a la Solución C5-D (vea el paso 1). Agregue
500 μl de solución C5-D a cada pocillo de la placa de centrifugado. Aplique la
cinta centrífuga a la placa giratoria.

36. Centrifugar a temperatura ambiente durante 5 minutos a 4500 x g.

 37. Deseche el flujo y coloque la placa giratoria nuevamente en la placa n. ° 6.

38. Centrifugar de nuevo a temperatura ambiente durante 6 minutos a 4500 x g.

39. Descartar el flujo.

40. Coloque con cuidado la placa giratoria en la microplaca. Retire la cinta centrífuga
de la placa giratoria y deséchela.

41. Agregue 100 μl de solución C6 al centro de cada pocillo de la placa de

centrifugado. Aplicar la cinta centrífuga.

42. Deje que C6 se asiente en el filtro durante 10 minutos a temperatura ambiente

antes del paso de centrifugación final.

43. Centrifugar a temperatura ambiente durante 7 minutos a 4500 x g.

44. Retire la cinta centrífuga y deséchela.

45. Cubra los pocillos de Microplate con la estera de sellado de elución provista. El
ADN ahora está listo para cualquier aplicación posterior. No se requieren más
pasos.

Protocolo obtenido de: Donna Berg-Lyons, Chris L. Lauber, Greg Humphrey, Luke
Thompson, Jack A. Gilbert, Janet K. Jansson & Rob Knight. (2018). EMP DNA
Extraction Protocol.

MQRT-PCR
1. Se recogieron muestras de sangre de los pacientes con cáncer tratados con
radioterapia en tubos PAXGene de acuerdo con el protocolo del fabricante
(Qiagen, PreAnalytiX GmbH, Hilden, Alemania). Los tubos se mantuvieron a TA
durante 2 horas antes de congelarse a -20 ° C. Se extrajo el ARN de las muestras
utilizando el kit de miARN de sangre PAXGene (Qiagen, PreAnalytiX GmbH,
Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

2. La cantidad de ARN se evaluó mediante Nanodrop ND2000 usando 1ul de ARN

(Nanodrop, Wilmington, EE. UU.). La calidad del ARN se evaluó mediante los
valores RIN producidos por Tapestation 2200 usando 1ul de ARN mezclado con
4ul Screentape Buffer (Agilent Technologies, CA, EE. UU.).

3. Las reacciones de transcriptasa inversa se realizaron utilizando el kit de

transcripción inversa de cDNA de alta capacidad (Applied Biosystems,
FosterCity, CA, EE. UU.) De acuerdo con el protocolo del fabricante con 350 ng
de ARN total.
 4. Las reacciones de RT-PCR cuantitativa múltiple se realizaron por triplicado
usando PerfeCTa® MultiPlex qPCR SuperMix (Quanta Biosciences, Inc.
Gaithersburg, MD, EE. UU.) A una concentración final de 1X y con conjuntos de
cebador y sonda para genes diana a una concentración final de 300 nM
concentración cada. 3 '6-Carboxyfluorescein (FAM), 6-Hexaclorofluoresceína
(HEX), Texas Red y CY5 (todos de Eurogentec Ltd, Fawley, Hampshire, Reino
Unido) se utilizaron como fluorocromos reporteros para las sondas de hidrólisis
analizadas en reacciones multiplexadas con entre 2 y 4 genes por ejecución,
incluido el control.

5. Las muestras se corrieron a lo largo de curvas estándar obtenidas por dilución en

serie de fragmentos de ADN amplificados por PCR de cada gen. El rango
dinámico lineal de las curvas estándar abarca seis órdenes de magnitud (dilución
en serie de 3.2 x 10-4 a 8.2 x 10-10).

6. La RT-PCR cuantitativa multiplex en tiempo real se realizó con Rotor-Gene Q

(Qiagen, Hilden, Alemania). Los parámetros de ciclado fueron 2 minutos a 95 °
C, luego 45 ciclos de 10 segundos a 95 ° C y 60 segundos a 60 ° C.

7. Los datos fueron recolectados y analizados por el software de la serie Q de Rotor-

Gene. Los valores de Ct objetivo del gen (umbral del ciclo) se normalizaron a un
control interno de Hipoxantina-Guanina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).

8. Los valores de Ct se convirtieron en cantidad de transcripción usando curvas

estándar. Eficiencias de PCR entre 93% y 103% para cada gen con R2> 0.998.
Los niveles relativos de expresión génica después de la irradiación se
determinaron con relación a los controles no expuestos.

Protocolo obtenido de: Grainne O'Brien, Aleš Tichý & Ales Tichy. (2018). MQRT-PCR.

Colony PCR de levadura

Preparación de células por calentamiento

1. Alícuotas de 50 µL de agua por cada tubo de PCR de 0,2 mL.

2. Use una pequeña punta de pipeta para recoger una pequeña cantidad de levadura
(menos del tamaño de la semilla de sésamo). Evita tocar el agar. Transfiere la
levadura al agua, girando para sacar las células de la punta. Usar tubos de tapa.
Suavemente, agitar con vortex para suspender las células.

3. Coloque los tubos en una máquina de PCR con programa: 99ºC, 5 min; 4ºC,
espera. Retire los tubos de la máquina, centrifugue rápido, coloque los tubos en
 hielo. La levadura expuesta al calor está lista para usar o puede congelarse a -20ºC
para más tarde sin pérdida de actividad. Importante: agite suavemente las células
en suspensión justo antes de agregarlas a las reacciones de PCR. NO use el
sobrenadante de las células de levadura granuladas. La plantilla de ADN está en
las células. Usa la suspensión celular.

PCR utilizano células expuestas al calor – Ejemplo con muestra de 20 µL y la enzima

Phire Hot Start II

A partir de ahora, la PCR es esencialmente la misma que con cualquier plantilla

(plásmido, ADN genómico puro, entre otros). Haga una mezcla maestra de PCR
siguiendo al fabricante de la enzima PCR. A continuación se muestran las
concentraciones finales de reactivos en una mezcla maestra para 20 μL de PCR utilizando
Phire Hot Start II (Thermo Scientific):

Master Mix

1X Phire HS II buffer
0.2 mM cada dNTP
0.4 μL de enzima Phire HS II / 20 μL de PCR
0.5 μM de cada imprimador (puede agregarse luego a tubos individuales)

La mezcla maestra se puede hacer con o sin imprimadores. Mezcla maestra de alícuotas
a nuevos tubos PCR de 0,2 ml o a una placa de 96 pocillos. Si se incluyen cebadores en
la mezcla, alicuotar 18 μL de la mezcla. Si los cebadores se agregan más tarde, reduzca
el volumen / tubo en consecuencia. En cualquier caso, el orden típico de llenado de tubos
es: 1) mezcla maestra, 2) cebadores (si no están en la mezcla maestra), y 3) levadura
calentada en vórtex de 2 μL. Muestras de centrifugado rápido usando una mini centrífuga
(tubos de PCR) o una centrífuga con un rotor de placa (placas de PCR).

Ejecute la PCR (el tiempo de extensión de Phire HS II es de 10-15 segundos / producto

de PCR de 1 kb):

Temperatura Tiempo Proceso

98ºC 30s Desnaturalización
98ºC 5s
60ºC 5s 35 ciclos de OCR
72ºC Xs
72ºC 1min Extensión final
4ºC - Fin

Retire los tubos del termociclador y realice un centrifugado rápido. Si usa un E-Gel,
agregue 20 μL de agua a cada tubo, vortex y cargue 20 μL en cada carril de E-Gel. Para
otros geles, agregue colorante de carga concentrado y corra sobre el gel.

Protocolo obtenido de: Joe Horecka & Angela M. Chu. (2017). Yeast Colony PCR.
PCR usando Q5 Hot Start High-Fidelity ADN polimerasa
(M0493)
1. Configurar la reacción:

Componente Reacción con 25 Reacción con 50 Concentración

µL µL final
5X Q5 buffer de 5 µL 10 µL 1X
reacción
10 mM dNTPS 0.5 µL 1 µL 2oo µM
10 µM Primer 1.25 µL 2.5 µL 0.5 µM
Forward
10 µM Primer 1.25 µL 2.5 µL 0.5 µM
Reverse
ADN templado Variable Variable < 1000 ng
Q5 Hot Start High- 0.25 µL 0.5 µL 0.02 U/ µL
Fidelity ADN
polimerasa
5X Q5 Potenciador (5 µL) (10 µL) (1X)
GC (opcional)
Agua libre de Aforar a 25 µL Aforar a 50 µL
nucleasas

2. Mezcle suavemente la reacción.

3. Recoja todo el líquido en el fondo del tubo con un centrifugado rápido si es

necesario y superponga la muestra con aceite mineral si utiliza una máquina de
PCR sin tapa calentada.

4. Transfiera los tubos de PCR a una máquina de PCR y comience a termociclar. Q5

Hot-Fidelity DNA Polymerase de Hot Start no requiere un paso de activación por
separado. Se recomiendan las condiciones de ciclismo estándar Q5.

Protocolo obtenido de: New England Biolabs (NEB). (2015). PCR Using Q5® Hot Start
High-Fidelity DNA Polymerase (M0493).

Metabarcoding de COI de AND ambiental (eDNA) con

Illumina MiSeq NGS – Protocolo para PCR
1. Las reacciones de PCR para COI se realizaron con el protocolo de amplificación
de dos pasos Fluidigm para cada muestra.

2. Las amplificaciones primarias de PCR se llevaron a cabo en reacciones triplicadas

de 25 μl usando:
 1 μl de extracto de ADN (dilución 1:10)
 12,5 μl Mezcla maestra AmpliTaq Gold Fast PCR (Applied Biosystems)
 1 μl de cada uno de los cebadores directo e inverso (5 μM)
 9,5 μl de agua de grado biológico molecular.

3. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos con un NTC

procesado por triplicado para cada placa.

4. Parámetros de ciclado de COI primario:

 95 ° C por 10 minutos
 16 ciclos de los siguientes tres pasos:
 94 ° C por 10 segundos
 62 ° C durante 30 segundos (esto cambia -1 ° C para cada ciclo subsiguiente)
 68 ° C por 60 segundos
 Luego 25 ciclos de los siguientes tres pasos:
 94 ° C por 10 segundos
 46 ° C por 30 segundos
 68 ° C por 60 segundos
 Un paso de elongación final de 72 ° C durante 10 minutos
 Mantener a 4 ° C

5. Cebadores primarios de PCR COI (cebadores listados en la dirección 5 'a 3')

Fluidigm CS1 + mlCOIinfF (forward):
ACACTGACGACATGGTTCTACA
GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
Fluidigm CS2 + HCO2198 (reverse):
TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

6. Después de la amplificación PCR primaria de la región marcadora, los productos

PCR combinados se procesaron a través de un gel de agarosa para confirmar la
presencia de bandas diana y ausencia de amplificación no específica en muestras
ambientales, así como la ausencia de amplificación en controles sin plantilla
(NTCs).

7. Los productos de PCR primaria se purificaron y se seleccionó el tamaño usando

el sistema de cuentas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, EE. UU.).

8. Se ejecutó un segundo gel de agarosa para confirmar la eliminación del cebador y

la retención de los amplicones objetivo después de la purificación.

9. Se envió una alícuota de 20 μl de cada producto de PCR primario purificado a

RTSF Genomics Core en MSU para la amplificación por PCR secundaria con
cebadores que se dirigían a los extremos CS1 / CS2 de los productos de PCR
primarios y se añadieron adaptadores indexados dobles compatibles con Illumina
con códigos de barras.
10. Las amplificaciones de PCR secundarias se llevaron a cabo como reacciones
únicas de 15 μl usando:
 Plantilla de 1 μl de producto primario de PCR (sin dilución)
 μl mezcla maestra OneTaq Hot Start 2X con buffer estándar (NEB)
 1 μl de mezcla de cebador directo e inverso (6 μ M)
 7 μl de agua de grado molecular-biológico

11. Parámetros de ciclado COI secundarios:

 95 ° C por 3 minutos
 15 ciclos de los siguientes tres pasos:
 95 ° C por 15 segundos
 60 ° C por 30 segundos
 72 ° C por 60 segundos
 Luego, un paso de elongación final de 72 ° C durante 3 minutos
 Mantener a 25 ° C

12. Cebadores de PCR Fluidigm secundarios (cebadores listados en la dirección de 5

'a 3')
PE1-BC-CS1 (forward):
AATGATACGGCGACCACCGAGATCT- [i5-BC (índice 2)] -
ACACTGACGACATGGTTCTACA
PE2-BC-CS2 (reverse):
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT- [i7-BC (índice 1)] –
TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT

13. Se ejecutó un gel de agarosa después de una PCR secundaria para confirmar la
presencia de bandas diana y la ausencia de amplificación no específica en
muestras ambientales, así como la ausencia de amplificación en controles sin
plantilla (NTC).

14. Después de la PCR secundaria, los productos se corrieron a través de la placa de

normalización Invitrogen SequalPrep (ThermoFisher Scientific) utilizando el
protocolo del fabricante para crear una biblioteca agrupada.

15. El producto agrupado para el locus genético se cargó en una celda de flujo MiSeq
v2 estándar y se secuenció en un formato de extremo apareado de 2x250 pb
usando un cartucho de reactivo MiSeq de 500 ciclos v2.

16. La ejecución MiSeq se realizó con una espiga PhiX al 10% añadida.

17. Se añadieron cebadores complementarios a los oligómeros Fluidigm CS1 y CS2

a los pocillos apropiados del cartucho de reactivo al servidor como secuenciadores
e iniciadores de lectura de índice.
 18. La llamada base fue realizada por Illumina Real Time Analysis (RTA) v1.18.54
y la salida de RTA fue demultiplexada y convertida a formato FastQ con Illumina
Bcl2fastq v2.18.0.

19. Cebadores de secuenciación COI (dirección 5 'a 3'):

FL1-CS1(read1) A+CA+CTG+ACGACATGGTTCTACA
FL1-CS2 (read2) T + AC + GGT + AGCAGAGACTTGGTCT
FL2-CS1rc T + GT + AG + AACCATGTCGTCAGTGT
FL2-CS2rc (índice) A + GAC + CA + AGTCTCTGCTACCGTA

20. La secuenciación se realiza en la Base de Genómica de la Tecnología de Apoyo a

la Investigación (RTSF) en la Universidad Estatal de Michigan (MSU).

Protocolo obtenido de: Collin Closek, Anni Djurhuus, Katie Pitz, Ryan Kelly, Reiko
Michisaki, Kristine Walz, Hilary Starks, Francisco Chavez, Alexandria Boehm & Mya
Breitbart. (2018). Environmental DNA (eDNA) COI metabarcoding Illumina MiSeq NGS
PCR Protocol.

Knock-out basado en CRISPR / Cas9 en células T primarias

humanas (configuración de 24 pocillos)
1. RNase Zap todo antes de comenzar.

2. Resuspender el crRNA (2 nmol) en 100 ul (fabricación 20 uM) y tracRNA (20

nmol) en 1 ml de buffer de almacenamiento de ARN (hacer 20 uM). Alícuota y
mantener a -80 ° C.

3. Se necesitan 0.375ul de cRNA y 0.375 ul de tracRNA por pocillo (de esta forma,
utilizaremos 7.5 pmol de sgRNA por cada 200K células, como lo sugiere el
protocolo de Neon).

4. Mezcle 1.5 ul de cRNA y 1.5 ul de ARNc (para 4 rxns) en un tubo de PCR.

5. Mantenga la mezcla de ARN a 95 ° C durante 5 minutos.

6. Luego mantenga la mezcla de ARN a 37 ° C durante 25 minutos.

7. Para Cas9, Neon sugiere 1250 ng de proteína Cas9 por cada 200K células. Nuestro
Cas9 tiene una concentración de 5 mg / ml. Por lo tanto, necesitaremos 0.25 ul
Cas9 / 200K células.

8. Después de la incubación de la sgRNA, agregue lentamente 1ul Cas9 (para 4

reacciones) en el tubo de PCR, mezcle e incube a 37 ° C durante 15 minutos.
 9. Se necesitan 200K células para un evento de electroporación. Las células deben
estar en tampón 9 ul T (reacción tampón 9 ul T), de modo que el volumen total (9
ul células + 1 ul mezcla RNP) será de 10ul para la punta Neon 10.

10. Deshacer las perlas y contar las células activadas.

11. Necesitamos 200,000 * 3 * 24 (14.4 millones de células).

12. Para estar seguro, asuma 4 reacciones así que necesitaremos 200,000 * 4 * 24 (19
millones) de células. 19 millones de células son realmente buenas para 96 pozos.
Por lo tanto, necesitamos 96 * 9 = 864 ul T buffer.

13. Después de vaciar y contar las células, hágalos girar a 200 xg durante 7 minutos.

14. Aspirar a la media tanto como sea posible.

15. Resuspender el pellet en 864 ul T buffer.

16. Agregue 36 ul de mezcla de células a cada tubo de PCR y mezcle bien.

17. El Cas9 RNP y las células están listos para la electroporación.

18. Electroporación a 1600 V 10 ms 3 pulsos.

19. Sembrar las células electroporadas en la placa de 24 pocillos preparada con medio
de células T tibio.

20. El tiempo para perfilar la célula tratada con CRISPR / Cas9 depende del ensayo
particular de interés, pero en general, las células pueden perfilarse mediante
citómetro de flujo para proteínas de superficie y a través de Western Blot para
proteínas internas 3 días después de la electroporación.

Protocolo obtenido de: South Carolina Medical University. (2018). CRISPR/Cas9-based

knock-out in human primary T cells (24-well setup).

Protocolo de extracción de proteínas y electroforesis de geles

de poliacrilamida
Preparación de buffer de extracción
1. Realizar una solución de Tris –HCl 50mM a partir de una solución madre de 1.5M,
la cual se realizó a partir de 8.33mL de Tris-HCl 99% 1.5M.
2. La solución madre se realizó a partir de 2.36g de Tris – HCl en 10 mL de solución.
 3. Se agrega 3mg de EDTA en 20 mL de solución seguido de 6.99 µL de
Mercaptoetanol 10Mm que se realiza a partir de una solución madre de 14.3M. Se
afora en 20 µL.
Procedimiento de extracción.
1. Se pesa 1g de muestra fresca, agregando nitrógeno líquido y manteniendo en hielo
hasta completar la trituración en un mortero.
2. Se añade 2.5 mL de buffer de extracción seguido de 3 µL de mercaptoetanol,
seguido de una centrifugación a 10 000 rpm durante 20 min en frío.
3. Se transfiere el sobrenadante a un tubo limpio, rotulando cada extracto.
4. Se guarda en el congelador las muestras para ser usadas posteriormente.
Montaje y preparación del gel
1. Se necesita soluciones de buffer de carga la cual se formará de 5 mL de
Bromofenol, 1.5 mL de β-Mercaptoetanol al 6%, 10 g de sacarosa al 50%, 1.5 g
de SDS al 6% y 0.378 g de Tris – HCl 0.125M a pH 6.8.
2. Se prepara a continuación un buffer de electroforesis usando Tris base 5Mm,
Glicina 250 Mm, SDS al 10%.
3. Se limpia cada una de los cristales con etanol al 70% con papel toalla, que no deje
pelusa. Una vez limpios se procede a montar los 2 cristales con un separador
plástico.
4. Se colocan en la cámara electroforética por medio de pinzas plásticas, llenando
con buffer de corrimiento los espacios de la cámara.
5. Se conectan los electrodos a la cámara para empezar el corrimiento, se lo debe
hacer a 60V el primer gel y cambiar el voltaje a 100 cuando pase al segundo gel.
6. Se tiñe el gel con la solución de tinción y después de 24h se destiñe con la solución
de destinción.

Resolving Gel Stacking Gel

10 mL 25 mL 5 mL 10 mL
H2O 3.3 8.2 3.4 6.8
30% 4 10 830 µL 1.7
acril:bisacrilamida
1.5 M Tris pH 8.8 2.5 3.6 630 µL 1.25 Tris pH
6.8
10% SDS 0.1 250 µL 50 µL 100 µL
10% APS 0.1 250 µL 50 µL 100 µL
TEMED 4 µL 10 µL 5 µL 10 µL
Para dos geles Para 4 geles Para dos geles Para 4 geles

Protocolo obtenido de: Biosystems. (2000). Protein extraction and electrophoresis

protocol.
Protocolo de extracción de DNA de parásitos
1. Partir aproximadamente de 100mL de cultivo en fase logarítmica de crecimiento.

2. Centrifugar los parásitos a 4 000 rpm durante 20 minutos a 4°C.

3. Resuspender el botón de parásitos en 40 mL de solución buffer de fosfato (OBS)

frío en un tubo de 50 mL y centrifugar a 6 000 rpm durante 5 minutos a 4°C.
Repetir el proceso dos veces.

4. Resuspender el botón en 1 mL de PBS frío y centrifugar a 13 000 rpm durante 15

min.

5. Resuspender el precipitado en 1 mL de PBS frío y adicionar 100 µL de NP40 al

10% en agua, mezclar y centrifugar a 13 000 rpm durante 5 minutos a 4°C.

6. Resuspender el botón en 2 mL de PBS, dividir en cuatro tubos y adicionar 50 µL

de SDS al 10% a cada tubo.

7. Adicionar 1 volumen de fenol equilibrado (550 µL), mezclar, centrifugar por 10

minutos a 10 000 rpm y recuperar la fase acuosa en otro tubo.

8. Extraer conun volumen de fenol – cloroformo- aclohol isoamílico (25:24:1, 275

µL de fenol y 275 µL de cloroformo – alcohol- isoamílico ), centrifugar a 10 000
rpm durante 10 min y recoger la fase acuosa.

9. Extraer con un volumen de cloroformo – alcohol isoamílico (24:1, 550 µL),

centrifugar a 10 000 rpm durante 10 minutos y recuperar la fase acuosa.

10. Precipitar con 2 volúmenes y medio de etanol absoluto (1,375 mL), mezclar hasta
visualizar la madeja de DNA, tomar la madeja y pasarla a otro tubo.

11. Lavar la madeja de DNA con 1 mL de etanol al 70%, centrifugar a 10 000 rpm
por 5 minutos y descartar el sobrenadante.

12. Secar el DNA a temperatura ambiente (TA) o por incubación corta a 37°C.

13. Resuspender en 200 a 300 µL de agua destilada y desionizada, según la cantidad

madeja obtenida.

14. Comprobar en el gel de agarosa la calidad de DNA y cuantificarlo mediante

espectofotometría a 260 nm.
Nota: En caso de no obtener madejainicial, incubar toda la noche a -20ªC y centrifugar
por 1 h a 4ªC a 10 000 rpm. Guardar el sobrenadante y continuar con el siguiente paso.
Todas las centrifugaciones se deben hacer a 4ºC.