INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

INGENIERIA EN SISTEMAS AMBIENTALES

PRACTICA 13

“BIODEGRADACION DE SURFACTANTES
ANIONICOS”
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

EQUIPO NO. 3 Grupo: 5AM1

 Aparicio Almazán Brenda Guadalupe

 Vázquez Jiménez Mabel Jirivett

EQUIPO 10:

PROFESOR(ES):
 M. en C. Gisela Boll Argüello
 M. en C. Claudia Paulina Dotor Vázquez
 Dra. Jane Castillo Vera

FECHA DE REALIZACIÓN: 15 al 20 de Febrero del 2018

FECHA DE ENTREGA: 27 de Febrero del 2018

OBJETIVOS.

Determinar la biodegradación de un surfactante aniónico problema (LAS, LSS Y ABS)

utilizando la prueba presuntiva que marca la NOM-AA-39/1980.

RESULTADOS.

Esta práctica fue realizada con el fin de estudiar los principales surfactantes aniónicos que se
encuentran en los detergentes para evaluar su biodegradabilidad y así cualificar el grado de
afectación de los mismos en el medio ambiente.

Tales detergentes contienen fracciones hidrofóbicas (Hidrocarburos) las cuales pueden

presentar estructuras ramificadas o lineales. Los que logran metabolizarse mediante
bacterias en plantas de tratamiento de aguas residuales y se conocen con el nombre de
“detergentes biodegradables”. Por ello se utilizó como material biológico inoculo proveniente
de lodos activados de una planta de tratamiento de aguas residuales.

El surfactante anioico evaluado por el equipo 3 fue Alquil Bencen Sulfonato Lineal (LAS)

El proceso de biodegradación se desarrolla en 2 partes:

 Aclimatacion
 Biodegradacion

No fue necesaria la parte de aclimatación ya que los microorganismos del inoculo ya se

encuentran aclimatados es decir utilizan a los surfactantes como fuente de carbono.

Biodegradación

Para esta parte se realizó el método de sustancias activas al azul de metileno (SAAM),
tomando en matraz 2 ml de la muestra con inoculo y medio basal adicionado con LAS, se
completó a volumen de 100ml con agua destilada y se depositó en embudo de separación,
se adiciono indicador fenolftaleína y alcalinizo el contenido con hidróxido de sodio 1N hasta
coloración rosada, para neutralizar se adiciono ácido sulfúrico hasta neutralizar es decir
desaparición de color, posteriormente se adicionaron 10 ml d cloroformo y 25 ml de solución
azul de metileno, se agito vigorosamente teniendo cuidado de no formar emulsión y dejo
reposar hasta separación de fases, se separó la fase orgánica y se realizaron otros 3 lavados
usando cloroformo limpio, finalmente se combinaron todos los extractos obtenidos y se
agregaron 50ml de solución de lavado, se realizó extracción de la fase orgánica en matraz
volumétrico y se completó aforo con cloroformo. Se leyó absorbancia a una longitud de
652nm utilizando como testigo cloroformo.

Equipo 1 y 3 Laboratorio de Microbiología Ambiental Página 1

Esquema 1. Partes del microscopio óptico de campo claro.

 MORFOLOGÍA COLONIAL

Se realizaron observaciones de morfología colonial de 3 colonias perfectamente aisladas las

cuales fueron cultivadas en la sesión de la Práctica 1 “Ambiente Aséptico y Aislamiento de
microorganismos”. Se tomaron las placas cultivadas por el método de estría cruzada, en las
cuales se logró el perfecto aislamiento de las colonias y en el quipo 3 se seleccionó una
colonia de la placa con dilución 10-4 por la forma interesante de la colonia.

En las siguientes tablas se muestra la morfología colonial de las colonias seleccionadas en

equipo 1 y 3.

CARACTERÍSTICAS COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 3

Tamaño 5 mm 4mm 5mm

Color Blanco Blanco Amarillo

Forma Circular Circular Lobulado

Equipo 1 y 3 Laboratorio de Microbiología Ambiental Página 2

Borde Entero Entero Crenado

Elevación Bajo convexa Bajo convexa Crateriforme

Luz Reflejada Brillante Mate Mate

Luz Transmitida Translucida Opaca Opaca

Superficie Lisa Finamente granular Finamente granular

Aspecto Húmeda Húmeda Seca

Consistencia Suave Blanda Blanda

Pigmento Difusible No No No

Tabla 2. Morfología Colonial “Equipo 1”

Tabla 3. Morfología Colonial “Equipo 3”

CARACTERÍSTICA COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 3

Tamaño 3 mm 12mm 20mm

Color Beige Amarillo claro Beige

Forma Circular Lobulada Rizoide

Borde Entero Lobulado Ramoso

Elevación Bajo convexa Rugoso Plano difusa

Luz Reflejada Brillante Mate Mate

Luz Transmitida Opaca Traslucida Translucida

Superficie Lisa Granulosa Arborescente

Equipo 1 y 3 Laboratorio de Microbiología Ambiental Página 3

Aspecto Húmeda Seca Seca

Consistencia Banda mucosa Butirosa Dura

Pigmento Difusible No No No

TINCION SIMPLE Y DIFERENCIAL (TINCION DE GRAM)

Se prepararon 6 frotis, para realizar tinción simple con colorante safranina y tinción de Gram
de las colonias aisladas seleccionadas con anterioridad, se observaron con el microscopio en
el objetivo de inmersión para una mejor visualización de las colonias

A continuación, se muestran las observaciones de las colonias del equipo 1 y 3.

Tabla 4. Observación al microscopio “Equipo 1”

Tinción simple Tinción de Gram

1 1

Forma: Bacilos
Agrupación: Estreptobacilo Afinidad tintorial: Gram positivo
Agrupación: Estreptobacilo

Equipo 1 y 3 Laboratorio de Microbiología Ambiental Página 4

2 2

Forma: Cocobacilos Afinidad tintorial: Gram Negativo

Agrupación: Estafilococo Agrupación: Estreptococo

3 3

Forma: Cocos Afinidad tintorial: Gram Negativo

Agrupación: Estreptococo Agrupación: Estafilococo

Tabla 5. Observaciones al microscopio “Equipo 3”

Tinción Simple Tinción de Gram

1 1

No se observó ningún microrganismo

Forma: Bacilo

Equipo 1 y 3 Laboratorio de Microbiología Ambiental Página 5

 Agrupación: Sin Agrupación

2
2

Forma: Bacilos y diplococos Afinidad tintorial: Gram Positivo

Agrupación: Diplococos aislados y Agrupación: Bacilos en cadena
agrupaciones en bacilos

3 3

Forma: Bacilos Afinidad tintorial: Gram negativa

Agrupación: Cadena Agrupación: Diplobacilos

DISCUSIÓN.

Se pudieron observar correctamente las colonias aisladas de cada equipo gracias a un

adecuado manejo de la técnica de siembra por estría cruzada; las colonias de cada especie
bacteriana fueron diferentes ya sea en tamaño, color, consistencia etc. Como se puede
observar en las Tabla 2 y 3., en ambos equipos se observó nula presencia de pigmento
difusible (presencia de esporas).

Cada colonia aislada está constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se supone que es
la descendencia de una sola célula y, por tanto, un cultivo puro; a excepción de la colonia 2

Equipo 1 y 3 Laboratorio de Microbiología Ambiental Página 6

en tinción simple del equipo 3 donde se encontraron dos tipos de colonias: bacilos y cocos
se logró con éxito la observación de colonias aisladas.

Una tinción simple es una solución acuosa de un colorante básico único, en esta práctica se
utilizó safranina el propósito general de esta tinción es destacar por completo el
microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras básicas. En la Tabla
2. Y 3. Se observan estas diferentes características en cada colonia seleccionada por los
equipos.

Para el quipo 3 se observo en las colonias teñidas con el método de tinción simple la
presencia, concentración, morfología y el modo de agrupación de las bacterias, por lo que en
la primera imagen podemos observar que hay bacterias en forma de bacilo sin agruparse. La
mayor parte de los miembros de este género es saprofita y vive en la tierra, en el agua y aire,
y en la vegetación (J. A García Rodríguez, 1991). En la segunda imagen se observan tanto
bacilos como diplococos esto ya que las células se dividieron en un plano y permanecieron
unidas en parejas y finalmente en la tercera imagen se muestran bacilos en forma de
cadena.

El método de Gram es un tipo de tinción diferencial que se utiliza tanto para poder referirse a
la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la
diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se
visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o
rojo o grosella. En la Tabla 4. y 5. Se observan estas diferencias ya que esta técnica permite
diferenciar a dos grandes grupos de procariotas en función de la composición de la pared
celular. Las procariotas que contienen un alto contenido de
péptidoglucanas(aproximadamente el 90%) y un bajo contenido de lípidos (aproximadamente
10%), dan reacción de Gram positiva en el equipo 1 se observó este tipo de bacterias en la
colonia 1, así como en el equipo 3 en la colonia 2 colonias seleccionadas. Los procariotes
que contienen un bajo contenido de péptidoglucanas (aproximadamente el 10%) y un alto
contenido de lípidos (aproximadamente 90%), dan la Reacción de Gram negativa, estas se
apreciaron en el equipo 1 en las colonias 2 y 3 y en el equipo 3 en la colonia 2

En el caso de la colonia 1 del equipo 3 no se obtuvo observación ya que no hubo una

correcta técnica en la tinción, se utilizo demasiado alcohol acetona o se atribuye a una mala
fijación de la muestra.

Es importante decir que las colonias a las que se les realizó tinción de Gram eran de una
muestra de suelo, lo cual explica la presencia de estas bacterias, debido ya que en el suelo
predominan las bacterias Gram negativas. Sin embargo, en el suelo también se encuentran
bacterias Gram positivas, pero en menor proporción que las Gram negativas, lo cual también
explica la presencia de estas bacterias en el suelo

CONCLUSION.

Equipo 1 y 3 Laboratorio de Microbiología Ambiental Página 7

Tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram negativas se presentan
morfológicamente como cocos o bacilos, sin embargo al ejecutar tinción de Gram en estas
para identificar su grupo taxonómico, las Gram positivas se tiñen de color violeta mientras
que las Gram negativas se tiñen de color rosado, también se identifican bacterias Gram
positivas y Gram negativas gracias al color que tornan después de ser teñidas; en el caso de
las bacterias Gram positivas se tiñen de violeta, esto se debe a que gracias a que contienen
una pared gruesa de peptidoglicano y gran cantidad de ácidos teicóicos que permiten fijar y
retener rápidamente el colorante inicial el cual es, el cristal violeta y además son resistentes
a la decoloración.

Lo contrario ocurre con el caso de las Gram negativas, las cuales poseen una pared delgada
con menos cantidad de peptidoglicano y lípidos, la cual requiere de un colorante de
contratincion como la safranina, ya que el colorante inicial es fácilmente retirado en la
decoloración con alcohol, debido a que por su delgada pared celular no lo retienen. La tinción
de Gram permite conocer la morfología celular, el tamaño, la forma Tabla 2. Y 3. “Morfología
Colonial” así como su clasificación taxonómica (Gram positivos o Gram negativos) Tablas 4.
Y 5. “Morfología microscópica” de acuerdo con el color que tornan las bacterias después de
la tinción, sin embargo, no permite conocer la especie o género de la bacteria al cual
pertenece.

Las colonias de bacterias a las que se les realizó tinción de Gram se tomaron de una
muestra de suelo, lo cual explica la presencia de estas bacterias, debido a que en el suelo
predominan las bacterias Gram negativas. Sin embargo, en el suelo también se encuentran
bacterias Gram positivas, pero en menor proporción que las Gram negativas, lo cual también
explica la presencia de estas bacterias en el suelo. De acuerdo con esto Fue posible
observar bacterias Gram negativas con forma de bacilo (con forma de barra o vara) y Gram
positivas como Staphylococcus sp.

CUESTIONARIO.

1- ¿Cómo se explica la diferencia en las agrupaciones que presentan las células

bacterianas?

Equipo 1 y 3 Laboratorio de Microbiología Ambiental Página 8

Las células bacterianas, principalmente los cocos, presentan agrupaciones que son
características de la especie, por lo que el tipo de agrupación tiene valor practico en la
identificación.

Los cocos forman diversas agrupaciones, debido a dos factores: el plano de división celular y
la tendencia de las células a permanecer unidas después de la división. Esto da origen a
patrones de agrupamiento conocidos como estreptococos, estafilococos, tetra- cocos o
tétradas y sarcinas.

Los cocos que se separan completamente después de la división se conocen con el nombre
de micrococos. Cuando las células se dividen en un plano y permanecen unidas en parejas,
se llaman diplo- cocos, y si se dividen en un plano, pero permanecen unidas formando
cadenas, se denominan estreptococos. Cuando los cocos se dividen en dos planos
perpendiculares y las células se mantienen unidas, forman paquetes de cuatro. Por eso
reciben el nombre de tétradas o tetracocos. A las agrupaciones que resultan de la división en
tres planos, formando un patrón irregular, como de racimo de uvas, se les conoce con el
nombre de estafilococos. Si las células se dividen en tres planos, pero formando un patrón
uniforme, se producen arreglos en forma de cubo, llamados sarcinas.

Los bacilos no forman agrupaciones tan complejas como los cocos, pero se pueden
presentar en pares (diplobacilos) o en cadenas (estreptobacilos).
Los espirilos, generalmente, no presentan agrupaciones, pero el número de vueltas de la
espiral puede ser característico de la especie.

2- ¿Qué teoría existe para explicar la diferente afinidad tintorial que presentan las
bacterias en la técnica de Tinción de Gram?

La teoría fisicoquímica de que las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias
Gram positivas y Gram negativas son las responsables del comportamiento de las células a
la tinción de Gram, ya que, en dicha tinción, se forma dentro de las células un complejo
cristal insoluble violeta-yodo que en el caso de las Gram negativas pueden extraerse con
alcohol, pero no las Gram positivas. El alcohol deshidrata las bacterias Gram positivas, que
poseen paredes celulares muy gruesas con varias capas de peptidoglicano, lo cual provoca
el cierre de los poros de las paredes impidiendo la salida del complejo cristal violeta- yodo.
En las bacterias Gram negativas, el alcohol penetra rápidamente en la capa externa que es
rica en lípidos y la fina capa de peptidoglicano no impide el paso del solvente por lo que el
complejo se extrae fácilmente.

3- Describa tres técnicas de tinciones diferenciales y/o selectivas, que sean aplicables
a los microorganismos.

Equipo 1 y 3 Laboratorio de Microbiología Ambiental Página 9

 a) Tinción de Ziehl Neelsen (acido-alcohol resistencia): es un tipo especial de tinción
que permite la identificación de microorganismos de los grupos Mycobacterium y
Necardia de gran relevancia clínica.

b) Tinción de esporas (WIRTZ-CONKLIN): algunos tipos de bacterias producen

esporas de resistencia cuya pared celular es característica. La tinción de esporas
permite detectar este tipo de células lo que tiene utilidad en la identificación del
microorganismo en estudio.

c) Tinción de flagelos (Técnica de Kodaka): permite teñir flagelos usando un mordente

para incrementar su grosor y hacerlos visibles al microscopio óptico. Uno de los
grupos a lo que se aplica es campylobacter.

BIBLIOGRAFÍA.

García, V. (2004). introducción a la microbiología. Costa Rica: EUNED.

Martinez Roberto. (2009). Bacteria gram positiva. Disponible: http://martinez-

roberto.blogspot.com/. Consultado: 26/02/2018

Díaz Camilo (2011). Definición de tinción. Disponible:

http://es.scribd.com/doc/52811425/Tinciones-en-Microbiologia-Seminario. Consultado:
24/02/201

López Tévez, Leonor (2006). Comportamiento de las bacterias en la tinción de Gram.

Disponible: http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp6.pdf. Consultado: 26/02/2018.

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