I.

JUDUL PERCOBAAN : Penentuan Jenis Asam Amino dalam Sampel

II. WAKTU PERCOBAAN :
Mulai : Rabu, 19 September 2018, pukul 13.00 WIB
Selesai : Rabu, 19 September 2018, pukul 15.30 WIB
III. TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan asam amino yang terdapat dalam
sampel dengan metode kromatografi kertas.
IV. DASAR TEORI :
Asam Amino
Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh
karena berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat
pembangun dan pengatur. Protein adalah polimer dari asam amino yang
dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung unsur-
umsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang mengandung unsur logam seperti besi
dan tembaga (Winarno, 1992).
Struktur asam amino digambarkan sebagai berikut:

Apabila asam amino larut dalam air, gugus karboksil akan melepaskan
ion H+, sedangkan gugus amina akan menerima ion H+, seperti reaksi berikut:
H H
O O
H2N C H3N+ C
OH O-
R R
Oleh adanya kedua gugus tersebut asam amino dalam larutan dapat
membentuk ion yang bermuatan positif dan juga bermuatan negatif atau
disebut juga ion amfoter (zwitterion). Keadaan ion ini sangat tergantung pada
pH larutan. Apabila asam amino dalam air ditambah dengan basa, maka asam
amino akan terdapat dalam bentuk 1 karena konsentrasi ion OH- yang tinggi

1
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 mampu mengikat ion-ion H+ pada gugus –NH3+. Sebaliknya bila ditambahkan
asam ke dalam larutan asam amino, maka konsentrasi ion H+ yang tinggi
mampu berikatan dengan ion –COO- sehingga terbentuk gugus –COOH
sehingga asam amino akan terdapat dalam bentuk 2 (Anna Poedjiadi, 1994).
H H

R C COO- R C COO- + H+

NH3+ NH2

(Bentuk 1)
H H

R C COO- + H+ R C COOH

NH3+ NH3+

(Bentuk 2)
Gugus karboksil pada asam amino dapat dilepas dengan proses
dekarboksilasi dan menghasilkan suatu amina. Gugus amino pada asam amino
dapat bereaksi dengan asam nitrit dan melepaskan gas nitrogen yang dapat
diukur volumenya. Van Slyke menggunakan reaksi ini untuk menentukan
gugus amino bebas pada asam amino, peptida maupun protein. (Anna
Poedjiadi, 1994).
Asam amino memiliki beberapa fungsi, yaitu:
1. Sebagai penyusun protein, termasuk enzim
2. Kerangka dasar sejumlah senyawa penting dalam metabolism
3. Sebagai pengikat logam penting yang diperlukan dalam reaksi enzimatik
(kofaktor)
(Murray, 2006)
Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetrik,
kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi, dan elektroforesis. Salah satu metode
yang paling banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi.
Macam-macam kromatografi ialah kromatografi kertas, kromatogrfi lapis tipis,
dan kromatografi penukar ion (Poedjiadi, 1994).

2
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas, merupakan salah satu jenis kromatografi partisi,
yaitu pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua
pelarut yang tidak dapat bercampur. Kromatogrfi kertas diterapkan untuk
analisis campuran asam amino karena asam amino memiliki sifat yang larut
dalam air dan tidak mudah menguap sehingga dapat dipisahkan melaui
perpindahan fasa gerak (eluen) pada fasa diam (adsorben).Asam amino akan
terbawa oleh fasa gerak dan akan mengendap atau menempel pada fasa diam
(adsorben) setelah menempuh jarak tertentu. Adsorben dalam kromatografi
kertas adalah kertas saring, yakni selulosa.
Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini cukup sederhana.
Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis diteteskan sedikit
demi sedikit pada kertas kromatografi pada pada titik tertentu (A) dan
kemudian ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut tertentu. Pelarut ini akan
naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa
dalam campuran dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut
dalam pelarut tertentu itu, misalnya pelarut organik, akan terbawa naik lebih
jauh daripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian atas atau garis
akhir, kertas diangkat dari pelarut kemudian dibiarkan kering dengan
sendirinya di udara. Dengan proses ini asam-asam amino akan terpisah satu
dengan yang lain, dengan penyemprotan pereaksi ninhidrin pada kertas
kromatografi tersebut akan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya
asam amino yang terpisah. Jarak yang telah ditempuh oleh suatu asam amino
tertentu (b), dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh suatu pelarut dari
garis awal hingga garis akhir (a) diberi lambang Rf.
jarak yang ditempuh oleh senyawa
Rf 
jarak yang ditempuh oleh pelarut

Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf:

1. Perubahan suhu
2. Perubahan komposisi pelarut
3. Jenis pelarut
4. Kemolaran

3
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 5. Kelarutan
6. Pori-pori kertas saring
(Kurniawati, 2015).
Berikut adalah tabel harga Rf dari asam-asam amino:
Asam Amino Nilai Rf Asam Amino Nilai Rf
Alanin 0,38 Leusin 0,73
Arginin 0,20 Lisin 0,14
Asparagin 0,50 Metionin 0,55
Asam aspartat 0,24 Penilalanin 0,68
Cystein 0,40 Prolin 0,43
Glutamin 0,13 Serin 0,27
Asam glutamat 0,30 Threonin 0,35
Glisin 0,26 Triptofan 0,66
Histidin 0,11 Tirosin 0,45
Isoleusin 0,72 Valin 0,61

Sistein
Sistein merupakan suatu asam amino mengandung
sulfur yang terbentuk secara alami di dalam
makanan, dan juga dapat di produksi oleh tubuh dari
amino acid menthionine. Asam amino non esensial bagi manusia ini memiliki
atom S, Bersama-sama dengan metionina. Atom S ini terdapat pada gugus tiol.
Karena memiliki atom S, sistein menjadi sumber utama dalam sintesis
senyawa-senyawa biologis lain yang mengandung belerang. Sistein dan
mentionin pada protein juga berperan dalam menentukan konformasi protein
Karena adanya ikatan hidrogen pada gugus tiol. Sistein mudah teroksidasi oleh
oksigen dan membentuk sistin (Lestari, 2014).

Histidin
Histidin merupakan satu dari 20 asam amino dasar yang
ada dalam protein. Bagimanusia histidina merupakan
asam amino yang esensial bagi anak-anak. Fungsi
Histidina menjadi prekursor histamin, suatu amina yang
berperan dalam sistem saraf, dan karnosin, suatu asam
amino (Lehninger, 1982).

4
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 Glisin
Glisin atau asam aminoetanoat adalah asam amino
alami paling sederhana. Asam amino ini bagi manusia
bukan merupakan asam amino esensial karena tubuh
manusia dapat mencukupi kebutuhannya. Glisin merupakan asam amino yang
mudah menyesuaikan diri dengan berbagai situasi karena strukturnya
sederhana. Secara umum protein tidak banyak mengandung glisin.
Pengecualiannya ialah pada kolagen yang dua per tiga dari keseluruhan asam
aminonya adalah glisin (Lehninger, 1982).

Pereaksi Ninhidrin
Reaksi Ninhidrin yang digunakan untuk mendeteksi dan menduga asam
amino secara kuantitatif dalam jumlah kecil. Fungsi dari Ninhidrin yaitu untuk
menetapkan letak asam amino pada kertas, dilakukan pengeringan dan
penyemprotan dengan ninhidrin serta pemanasan. Spot berwarna biru atau
ungu, masing-masing menunjukkan adanya asam amino akan muncul pada
kertas. Pemanasan dengan ninhidrin berlebih menghasilkan produk berwarna
ungu pada asam amino yang mempunyai gugus α-amino bebas, sedangkan
produk yang dihasilkan oleh prolin berwarna kuning, karena pada molekul ini
terjadi substitusi gugus α-amino. Pada kondisi yang sesuai intensitas warna
yang dihasilkan dapat dipergunakan untuk mengukur konsentrasi asam amino
secara kalorimetrik (Murray, 2006).
Posisi pelarut dapat ditandai dengan pensil dan kromatogram lalu
dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi
dengan asam amino menghasilkan senyawa berwarna. Adapun reaksi umum
secara keseluruhannya, adalah sebagai berikut :

5
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
V. ALAT DAN BAHAN :
Alat :
1. Kertas kromatografi 1 buah
2. Labu pemisah 1 buah
3. Kaca kapiler 4 buah
4. Bejana / gelas kimia 1 buah
5. Botol semprot 1 buah
6. Oven 1 buah
7. Chamber 1 buah

Bahan :
1. Larutan asam asetat glacial 6 mL
2. Larutan n-butanol 25 mL
3. Aquades 25 mL
4. Larutan asam amino standar secukupnya
5. Larutan sampel secukupnya
6. Larutan ninhidrin secukupnya

VI. ALUR PERCOBAAN :

1. Penentuan larutan pengelusi (fasa gerak)

25 mL n- butanol

- Dicampurkan 6 mL asam asetat glasial dan 25

mL aquades sambil dikocok
- Larutan ditempatkan dalam lemari kromatografi
dan dijenuhkan dengan uapnya

Larutan pengelusi

6
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 2. Penentuan komponen dalam asam amino

Kertas kromatografi

- Disiapkan dengan ukuran 4 x 10 cm, dibuat titik sampel dengan jarak

antara sampel dengan batas atas 0,5 cm dan batas bawah dengan jarak
1 cm
- Dioven selama 5 menit pada suhu 105oC, tiap penotolan dikeringkan
dulu sebelum penotolan selanjutnya
- Ditotolkan asam amino dikertas tersebut dengan besar noda tidak
melebihi diameter 0,4 cm
- Digantungkan kertas tersebut diatas lemari kromatografi untuk
beberapa jam guna menjenuhkan dengan uap eluen hingga batas atas

Kertas jenuh uap eluen

- Dikeluarkan kertas kromatografi

- Dikeringkan pada suhu 105oC – 110oC selama 5 menit
- Disemprot denganlarutan ninhidrin
- Dikeringkan kertas kromatografi kembali pada suhu 105oC – 110oC
selama 5 menit
Noda – noda asam amino terlihat

- Ditandai noda dengan pensil

- Dihitung harga Rf tiap – tiap noda dan dicatat warnanya

Harga Rf dan warna

- Dibandingkan harga Rf dengan Rf asam amino standar

- Ditetapkan komponen asam amino dalam sampel

Komponen asam amino

7
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
VII. HASIL PENGAMATAN :
No. Prosedur Percobaan Hasil Pengamatan Dugaan / Reaksi Kesimpulan
Perc Sebelum Sesudah
1. Penentuan larutan pengelusi  n-butanol =  N-butanol + Terjadi reaksi
larutan tidak asam asetat ( ) esterifikasi berasal
berwarna glasial + (n-butanol) dari reaksi antara n-
25 mL n- butanol
 Asam asetat aquades = ( ) butanol dengan
glasial = laruan tidak (asam asetat) asetat menghasilkan
- Dicampurkan 6 mL asam berwarna n-butil asetat yang
larutan tidak
asetat glasial dan 25 mL berwarna ( ) senyawanya bersifat
aquades sambil dikocok  Aquades =  Eluen = fasa () polar
- Larutan ditempatkan dalam larutan tak gerak (polar) CH3CH2CH2CH2OH
lemari kromatografi dan berwarna  Aquades = (aq) + CH3COOH
dijenuhkan dengan uapnya polar (aq)
 n-butanol = CH3CH2CH2CH2CO
Larutan pengelusi semi polar OCH (aq) + H2O (l)
 Asam asetat
glasial = non
polar
 Aquades > n-
butanol > asam
asetat glasial
 Kepolaran fasa
gerak harus
dengan sampel

8
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
2. Penentuan komponen dalam asam amino Berdasarkan
 Kertas  Kertas Reaksi Ninhidrin praktikum yang
Kertas kromatografi kromatografi = kromatografi telah dilakukan
silica gel berukuran 4x10 dapat disimpulkan
berwarna putih cm dan batas bahwa sampel
- Disiapkan dengan ukuran 4 x 10  Asam amino atas 0,5 cm dan memiliki nilai Rf
cm, dibuat titik sampel dengan sistein= keruh batas bawah 1 yang sama dengan
jarak antara sampel dengan batas tidak berwarna cm noda A sehingga
atas 0,5 cm dan batas bawah (++)  Dioven = kertas sampel merupakan
dengan jarak 1 cm  Asam amino kromatografi jenis asam amino
- Dioven selama 5 menit pada suhu Glisin = keruh kering ( Histidin
105oC, tiap penotolan dikeringkan tidak berwarna berwarna putih )
dulu sebelum penotolan selanjutnya (+)  Ditotoli noda
- Ditotolkan asam amino dikertas  Asam amino A,B,C dan S
tersebut dengan besar noda tidak Histidin = tidak - A = Histidin
melebihi diameter 0,4 cm berwarna - B = Sistein
- Digantungkan kertas tersebut diatas  Sampel = tidak - C = Glisin
berwarna - S = Sampel
lemari kromatografi untuk
 Ninhidrin = Sebanyak 3 kali Reaksi Histidin
beberapa jam guna menjenuhkan = noda tidak
tidak berwarna
dengan uap eluen hingga batas atas berwarna
 Dimasukkan
Kertas jenuh uap eluen dalam pelarut =
noda belum
terlihat
 Dioven selama 5
menit dengan

9
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 suhu 105oC –
110oC = noda
- Dikeluarkan kertas kromatografi belum terlihat
- Dikeringkan pada suhu 105oC –  Disemprot Anion ungu
110oC selama 5 menit larutan
+ CH3CHO (aq) + CO2 (g)
- Disemprot denganlarutan ninhidrin Ninhidrin =
+ 3H2O (l)+ H+
noda belum
- Dikeringkan kertas kromatografi
terlihat Reaksi Sistein
kembali pada suhu 105oC – 110oC
 Dioven lagi =
selama 5 menit noda terlihat
warna kuning
Noda – noda asam amino terlihat pudar
 Warna noda
- Ditandai noda dengan pensil
- A = warna
- Dihitung harga Rf tiap – tiap noda kuning
dan dicatat warnanya kecokelatan
- B = warna soft
Harga Rf dan warna pink
- C = warna
- Dibandingkan harga Rf dengan Rf jingga
asam amino standar - S = warna
- Ditetapkan komponen asam amino kuning
dalam sampel kecokelatan
 Rf
Komponen asam amino - Rf A = 0,233
- Rf B = 0,344
- Rf C = 0,188
- Rf S = 0,255 Reaksi Gilisin

10
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 ( )
 Rf secara teori =
- Sistein = 0,40 O
- Histidin = 0,11
- Glisisn = 0,26 OH

OH
(aq)
O

11
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
VIII. ANALISIS DAN PEMBAHASAN
Percobaan dengan judul “Penentuan Asam Amino dalam Sampel” yang
bertujuan untuk menentukan asam amino dalam sampel dengan menggunakan
metode kromatografi kertas. Kromatografi kertas, merupakan salah satu jenis
kromatografi partisi, yaitu pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan
kelarutan dalam dua pelarut yang tidak dapat bercampur. Prinsip dari metode
kromatografi adalah pemisahannya berdasarkan perbedaan kepolaran. Pada
kromatografi kertas diperleh nilai Rf pada masing-masing noda, dimana dari
nilai tersebut dapat ditentukan jenis asam amino dalam sampel.
Percobaan penentuan asam amino Ada 2 tahapan yaitu pembuatan
larutan pengelusi (fasa gerak) dan penentuan komponen asam amino.

a. Pembuatan Larutan Pengelusi (fasa gerak)

Pada percobaan tahap pertama yaitu pembuatan larutan pengemulsi (fasa

gerak). Pembuatan larutan pengelusi bertujuan untuk memperoleh pemisahan
asam amino yang baik, dalam percobaan ini digunakan tiga fasa pelarut yaitu
n-butanol, asam asetat, dan aquades dengan perbandingan 25:6:25. Dimana
larutan awal tidak berwarna dan setelah dicampurkan tetap tidak berwarna
dengan bau yang sangat menyengat seperti bau balon.
Pemilihan larutan pengelusi berdasarkan kepolaran yang berbeda-beda,
dimana dari ketiga larutan tersebut memiliki tingkat kepolaran sebagai berikut :
kepolaran aquades > kepolaran n-butanol > kepolaran asam asetat glasial.
Dengan perbedaan kepolaran tersebut, kemudian dijadikan dasar dalam
pemisahan senyawa - senyawa asam amino. Karena asam-asam amino tertentu
mempunyai kemampuan untuk larut pada pelarut dengan kepolaran yang
berbeda. Larutan n-butanol dan aquades merupakan pelarut polar dan asam
asetat glasial termasuk pelarut non-polar, maka larutan pengelusi ini bersifat
polar. Pada pembuatan eluen terjadi reaksi esterifikasi yang menghasilkan
ester butil etanoat yang berbau menyengat.

12
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 O

CH3-CH2-CH2-CH2-C-OCH3

CH3-CH2-CH2-CH2-OH + H3C OH 
O + H2O
(butil etanoat)
Kemudian larutan pengemulsi tersebut dimasukkan kedalam chmaber
yang tertutup selama ± 24 jam. Dengan ditutupnya chamber maka kondisi di
dalam chamber akan terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Kondisi jenuh dalam
chamber dapat mencegah penguapan pelarut, sehingga pelarut bergerak lambat
pada kertas kromatografi maka komponen-komponen yang berbeda dari
campuran pewarna akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda dan akan
tampak sebagai noda-noda asam amino.

b. Penentuan Komponen Asam Amino

Pada percobaan tahap kedua yaitu penentuan komponen asam amino
yang bertujuan untuk menentukan komponen asam amino pada sampel dengan
disediakan kertas kromatografi dan berbagai larutan asam amino standar serta
sampel yang akan diidentifikasi. Pemisahan asam amino dengan cara
kromatografi kertas disebabkan adanya perbedaan koefisien partisi antara air
dan pelarut organik. Perbedaan koefisien partisi menunjukkan perbedaan laju
rambatan pada permukaan kertas dari air dan pelarut organik yang merambat
secara perlahan.

Sebelum dilakukan proses kromatografi terlebih dahulu kertas

kromatografi berukuran 4x10 cm diberi tanda batas atas 0,5 cm dan tanda batas
bawah 1 cm. Kertas kromatografi dalam metode ini berfungsi sebagai fasa
diam. Kertas kromatografi berwarna putih dan struktur dasar kertas berupa
serat selulosa. Kemudian pada tanda batas bawah diberi 4 titik (3 titik larutan
standar asam amino A, B, C dan 1 titik larutan Sampel) dengan jarak antar titik
yaitu 1 cm sedangkan jarak titik dengan tepi plat yaitu 0,5 cm. Tujuan dari
diberinya tanda batas bawah adalah untuk mengetahui jarak yang ditempuh
oleh senyawa dan tanda batas atas digunakan untuk mengetahui jarak yang
ditempuh oleh larutan pengemulsi.

13
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 0,5 cm

1 cm 0,5 cm

1 cm

Pada pemberian batas maupun memberi titik pada plat menggunakan pensil.
Hal ini dikarenakan noda pada pensil tidak ikut larut bersama eluen serta
warnanya tidak akan menyebar dan tidak ikut larut pada plat setelah
dimasukkan kedalam eluen,sehingga tidak mempengaruhi hasil pada sampel
yang akan diujikan. Selanjudnya kertas kromatografi di panaskan dalam oven
dengan suhu 105-110ºC selama 5 menit. Penasan dengan suhu tersebut
bertujuan untuk menghilangkan molekul-molekul air dalam permukaan kertas
kromatografi, dimana jika molekul air belum hilang hal tersebut akan
menghambat proses pemisahan kromatografi kertas. Selain itu proses
pemanasan juga bertujuan untuk mengaktifkan daya serap pada kertas
kromatografi terhadap eluen.

Kromatografi akan berjalan dengan baik jika kepolaran antara fasa gerak
dan fasa diam berbeda, sedangkan kepolaran antara fasa gerak dengan sampel
sama. Dimana dalam percobaan ini fasa gerak berupa butil etanoat yang
bersifat polar dan fasa diamnya berupa kertas kromatografi yang bersifat non-
polar, sedangkan sampel asam amino yang diidentifikasi berupa larutan bersifat
polar.

Setelah pemanasan, maka dihasilkan kertas kromatografi kering yang

siap untuk ditotoli larutan standar asam amino A, B, C dan larutan
sampel,dengan keterangan sebagai berikut :
Asam amino A = sistein (Larutan tidak berwarna)
Asam amino B = histidin (Larutan tidak berwarna)
Asam amino C = glisin (Larutan tidak berwarna)

14
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 Larutan S = sampel (Larutan tidak berwarna)
Penotolan sampel menggunakan pipa kapiler dengan penotolan tidak melebihi
diameter 0,4 cm. Pada setiap kali penotolan diusahakan selalu dikeringkan
terlebih dahulu sebelum dilakukan penotolan selanjutnya. Pengulangan
penotolan dilakukan sebanyak tiga kali. Setelah semua totolan larutan kering,
kertas kromatografi dimasukkan kedalam chamber dengan posisi yang tegak
lurus, pada saat dimasukkan dalam chamber kertas kromatografi dijepit
menggunakan penjepit yang dikenai pada bagian atas sehingga tidak akan
merusak kertas kromatografi. Kemudian chamber ditutup kembali agar uap
elusi tidak keluar. Proses elusi dilakukan hingga eluen naik sampai batas atas
kertas kromatografi. Waktu yang dibutuhkan pada percobaan hingga eluen naik
adalah 1 jam lebih 22 menit.
Setelah eluen sudah sampai pada tanda batas atas, kertas kromatografi
dikeluarkan dari chamber dan dipanaskan dengan suhu 105-110ºC selama 5
menit. Proses pemanasan kembali ini bertujuan untuk mengeringkan kertas
kromatografi sekaligus menghilangkan uap elusi yang berada pada kertas
kromatografi. Setelah dipanaskan, tidak ada noda yang tampak pada kertas
sehingga kertas kromatografi disemprot dengan larutan ninhidrin (larutan tidak
berwarna) kemudian dipanaskan kembali. Penyemprotan ini bertujuan untuk
untuk memberikan warna pada noda-noda asam amino yang terpisahkan.
Karena setelah pemanasan belum timbul noda pada kertas kromatografi maka
kertas kromatografi disemprot kembali dengan larutan ninhidrin dan
dipanaskan kembali. Setelah proses pemanasan timbul noda dengan warna
yang berbeda setiap titiknya, adapun warna yang dihasilkan :
Larutan standart A = berwarna kuning kecoklatan
Larutan standart B = berwarna kuning kecoklatan
Larutan standart C = berwarna jingga
Sampel = berwarna kuning kecoklatan
Reaksi ini gunakan sebagai uji bercak untuk mendeteksi adanya asam
amino pada kertas kromatografi yang akan menghasilkan warna ungu yang
khas. Terbentuknya noda berwarna ungu disebabkan karena terjadinya reaksi

15
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 antara hidrat dari triketon siklik (ninhidrin) dengan asam amino. Berikut
reaksinya :

O O O
C OH H
C C N
OH R C COO-
C
NH3+ O-
O +  O
Asam amino (komplek berwarna ungu)

Reaksi antara ninhidrin dengan larutan asam amino sistein

O O O
COO- C
C OH C H2
2 C + +NH C H C N C + CO2(g) + 3H2O(l)+ H(aq)++ HS C CH
2
C OH C C
O CH2 O
O -
O
SH
ninhidrin sistein

Reaksi antara ninhidrin dengan larutan asam amino histidin

O O O H
COO- HC N
C OH C C H2
2 C + +NH + CO2(g) + 3H2O(l)+ H(aq)++
2 C H C N C C C C O (aq)
C OH C HC N
O CH2 C H
H
H O -
C N O
CH
HC N
ninhidrin H
Histidin

Reaksi antara ninhidrin dengan larutan asam amino glisin

O O
COO- O
C C
OH + C
2 C + NH
2 C H C N C + CO2(g) + 3H2O(l)+ H(aq)++ H2C O
C OH
C
O H C
O -
O
ninhidrin Glisin

Asam amino sistein mempunyai gugus tambahan sulfihidril atau thiol (-

SH) sehingga asam amino ini mempunyai gugus R polar tidak bermuatan,
Asam amino histidin mempunyai gugus tambahan berupa cincin aromatik
sehingga asam amino ini bersifat polar bermuatan positif sedangkan pada asam

16
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 amino Glisin mempunyai rantai samping berupa atom H yang berukuran kecil
sehingga asam amino ini mempunyai gugus R polar tidak bermuatan. Urutan
kepolaran pada larutan standart A, B, dan C adalah larutan standar A (Glisin) >
larutan standar B Sistein > larutan standar C Histidin.

Setelah timbul noda maka segera noda yang tampak pada kertas
kromatografi ditandai dengan pensil dan disolasi agar noda yang timbul tidak
hilang. Kemudian dihitung nilai Rf dengan rumus :
jarak yang ditempuh oleh senyawa
Rf 
jarak yang ditempuh oleh pelarut

Berikut tabel hasil nilai Rf dari percobaan

Jarak tempuh Jarak tempuh Rf Rf standar

Sampel
sampel (cm) eluen (cm) percobaan (Poedjiadi, 1994)
A (sistein) 2,1 9,0 0,233 0,40
B (histidin) 3,1 9,0 0,344 0,11
C (glisin) 1,7 9,0 0,188 0,26
S (sampel) 2,3 9,0 0,255 -

Dari data diatas, diperoleh nilai Rf sampel sebesar 0,255. Dimana nilai
Rf sampel tersebut mendekati nilai Rf larutan standar A (sistein) yaitu sebesar
0,233. Hal ini menunjukkan bahwa larutan sampel mengandung asam amino
jenis sistein karena memiliki nilia Rf yang hampir serupa dengan nilai Rf dari
larutan standar A (sistein). Namun jika dibandingkan dengan nilai Rf sistein
secara teori yaitu 0,40 maka nilai Rf sampel sangat jauh berbeda dengan nilai
Rf standar asam amino sistein. Perbedaan nilai Rf tersebut, dapat disebabkan
karena :
 Perbedaan keterikatan sampel terhadap eluen. Eluen yang digunakan
bersifat polar maka sampel yang lebih polar akan terikat lebih kuat pada
eluen dan harga Rf akan semakin besar.
 Perbedaan juga dapat terjadi saat proses pembuatan larutan pengelusi,
larutan dalam chamber sangat jenuh dengan uap eluen akibatnya sampel
akan terbawa eluen dengan jarak yang cukup jauh sehingga nilai Rf nya
tinggi.

17
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
  Selain itu juga bisa disebabkan karena penetesan sampel larutan dalam
jumlah atau diameter yang berlebihan sehingga memberikan hasil
penyebaran noda-noda berbeda sehingga akan mengakibatkan kesalahan-
kesalahan pada nilai Rf.

IX. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil analisis data dan pembahasan, dapat dimpulkan bahwa:
1. Penentuan jenis asam amino dalam sampel dapat ditentukan dengan
metode kromatografi kertas.
2. Asam amino yang terkandung dalam larutan sampel merupakan sistein, hal
ini dikarenakan nilai Rf larutan sampel (0,255) mendekati nilai Rf dari
larutan standar C yaitu sistein (0,233).

X. JAWABAN PERTANYAAN
a. Apa keuntungan dan kerugian metode pemisahan dengan
kromatografi kertas ?
Jawab :
Keuntungan

- Kemudahan dan kesederhanaannya pada pelaksanaan pemisahan,

yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai medium
pemisahan dan penyangga. Untuk kromatografi kertas preparatif
diperlukan kertas yang lebih besar dari pada untuk analisis.
Keuntungan yaitu beban langan bilangan Rf yang besar sehingga
pengukuran Rf merupakan parameter yang berharga dalam
memaparkan senyawa tumbuhan baru.
- Proses pemisahan asam amino dengan menggunakan kromatografi ini
dinilai sangat menghemat waktu, praktis dan tidak mahal. Karena
kertas kromatografi yang digunakan adalah kertas kromatografi
sederhana . Kerugiannya adalah kurang efektif untuk mendapatakan
nilai Rf , karena kesulitan membaca noda sampel yang diuji. Dan
untuk memudahkan membaca noda sampel harus dioven dulu.

18
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 Kelemahan

- Tidak bisa melakukan analisis kuantitatif pada komponen-komponen

sampel hanya terbatas pada analisis kualitatif saja.
b. Apakah metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisis
kuantitatif?
Jawab :
Metode kromatografi kertas dapat digunakan sebagai analisis kuantitatif,
dengan cara mengeruk bagian noda yang timbul dalam kertas kromatografi
dan dilakukan perlakuan sesuai prosedur. Kemudian diuji dengan alat untuk
mengetahui kadarnya.
c. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf?
Jawab:
a. Pelarut: disebabkan oleh pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-
perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat
menyebabkan perubahan- perubahan harga Rf.
b. Kehadiran ion lain, misalnya adanya klorida dalam pemisahan yang
dilakukan dengan larutan-larutan nitrat
c. Sifat dari campuran: berbagai senyawa mengalami partisi diantara
volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Sifat campuran
hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap
lainnya hingga berpengaruh juga terhadap harga Rf
d. Kertas: pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion
dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas
mempengaruhi kecepatan aliran dan mempengaruhi kesetimbangan
partisi.
e. Suhu: perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga
kecepatan aliran.
f. Ukuran dari bejana: volume dari bejana mempengaruhi homogenitas
dari atmosfer sehingga mempengaruhi kecepatan penguapan dari
komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan,
ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi
pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua
faktor yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.
g. Kualitas adsorben
h. Ketebalan lapisan, semakin tebal lapisan Rf nya semakin kecil
i. Kejenuhan ruang kromatografi

19
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
XI. DAFTAR PUSTAKA
Ananda, tyas. 2015. Penentuan Kadar Asam Amino dalam Sampel. (online)
https://www.scribd.com/document/286761243/Laporan-Praktikum-
Asam-Amino. Diakses pada 24 September 2018.

Day, R. A. Jr dan Underwood, A. L., 2002, Analisis Kimia Kualitatif, Edisi

keenam. Jakarta: Erlangga.

Kurniawati, Sari. 2015. Pengertian Kromatografi Lapis Tipis.

(online)https://www.academia.edu/8315572/Pengertian_Kromatog
rafi_Lapis_Tipis_KLT. Diakses tanggan 24 September 2018.

Lehninger.A.L, 1995. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga.

Lehninger, A. L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia jiid 1. Jakarta: Erlangga.

Lestari, Nasti. 2014. Sistein. (online)https://www.academia.edu/8096872/
Sistein. Diakses tanggal 25 September 2018.

Murray, R.K., dkk. 2006. Biokimia Harper. ed.27. Jakarta: EGC

Poedjadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press.

Tim. 2018. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Unesa UniPress.

Winarno, F. G., 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta : Penerbit Gramedia.

20
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
Lampiran 1. (Perhitungan)

Diketahui :

Jarak tempuh Jarak tempuh Rf Rf standar

Sampel
sampel (cm) eluen (cm) percobaan (Poedjiadi, 1994)
A (sistein) 2,1 9,0 0,233 0,40
B (histidin) 3,1 9,0 0,344 0,11
C (glisin) 1,7 9,0 0,188 0,26
S (sampel) 2,3 9,0 0,255 -

Ditanya nilai Rf pada larutan standar dan larutan sampel : . . . ?

1. Niali Rf larutan standar A (Sistein)

Nilai Rf =

2. Niali Rf larutan standar B (Histidin)

Nilai Rf =

3. Niali Rf larutan standar C (Glisin)

Nilai Rf =

4. Nilai Rf larutan sampel

Nilai Rf =

21
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 Lampiran 2. (Gambar Kerja)
No Gambar Kerja Keterangan
1 Persiapan alat dan bahan. Alat dan
bahan yang digunakan adalah
kerts kromatografi, camber, oven,
kaca kapiler, botol semprot, gelas
kimia, n-butanol, asam asetat
glasial, aquades,larutan asam
amino standar, larutan sampel,
ninhidrin.
2 Pemberian tanda dengan pensil
pada kertas kromatografi dengan
jarak bagian bawah 0,5 cm dan
bagian atas 1 cm. Serta pemberian
tanda A, B, C dan S dengan 1 cm
antar noda.

3 Pemanasan dalam oven dengan

suhu 105-110ºC selama 5 menit.

4 Pemberian noda pada masing-

masing tanda sebanyak 3 kali
penotolan dengan diameter tidak
melebihi 0,4 cm.
Noda A = Sistein
Noda B = Histidin
Noda C = Glisin
Noda S = Sampel

22
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
5 Memasukkan kertas kromatografi
dalam chamber yang berisi larutan
pengelusi (25 ml n-butanol, 6 ml
asam asetat glasial, dan 25 ml
aquades).

6 Pengambilan kertas kromatografi

dari chamber.

7 Pemanasan kembali dalam oven

suhu 105-110ºC selama 5 menit.

8  Penyemprotan larutan
ninhidrin pada permukaan
kertas kromatografi.
 Pemanasan kembali dalam
oven suhu 105-110ºC selama
5 menit.
 Timbul noda dalam kertas
kromatografi.

23
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel
 24
Praktikum Biokimia I : Penentuan Jenis Asam Amino dalam sampel