MAKALAH MIKROBIOLOGI LAUT

ISOLASI DAN PEWARNAAN BAKTERI

DOSEN PENGAMPU : Endang Wulandari Suryaningtyas.,S.Pi.,MP

OLEH

NI PUTU YUNI SINTIA DEWI

1514511026

PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN

FAKULTAS KELAUTAN DAN PERIKANAN

UNIVERSITAS UDAYANA

2018
 KATA PENGANTAR

Assalamu ‘Alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh

Puji dan syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT karena atas berkat
rahmat, taufik, dan hidayah-Nya sehingga kami dapat menyelasaikan makalah
ini. Tak lupa Shalawat serta Salam atas junjungan Nabi Besar Muhammad
SAW yang telah diutus kemuka bumi ini sebagai Rahmatanlil Alamin yang kita
nantikan syafaatnya di hari akhir nanti.

Makalah ini disusun untuk mengetahui lebih lanjut tentang isolasi dan
pewarnaan pada bakteri. Dimana dalam makalah ini diharapkan lebih membuka
wawasan berpikir dibidang terkait dengannya.

Kami menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena
itu, kami mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun demi
kesempurnaan makalah ini.

Semoga makalah ini memberikan informasi bagi kita semua dan bermanfaat
untuk pengembangan ilmu pengetahuan.

Wassalamualaikum Warahmatullahi Wabarakatuh

Jimbaran,
Oktober 2018

Penulis
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ......................................................................................................... i
BAB I .............................................................................................................................. 4
PENDAHULUAN ......................................................................................................... 4
1.2 Tujuan Percobaan ................................................................................................... 5
Bab II ................................................................................................................................. 6
Tinjauan pustaka .......................................................................................................... 6
2.1 Isolasi Bakteri ........................................................................................................... 6
2.2. Metode Isolasi ........................................................................................................ 7
2.2 Pewarnaan Bakteri ................................................................................................. 8
1. Pewarnaan sederhana .......................................................................................... 8
2. Pewarnaan Deferensial........................................................................................ 9
Bab III .............................................................................................................................. 14
KESIMPULAN ............................................................................................................... 14
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................... 15
 BAB I
PENDAHULUAN

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-
sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan.
Salah satu cara unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di identifikasi
adalah dengan cara metode pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut berfungsi
untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri
melalui serangkaian pengecetan atau pewarnaan (Dwidjoseputro, 1998).
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam.
Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan
tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus,
sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah
melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro.1998).
Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya
dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada
tempatnya. Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme
(bakteri) dikenal sebagaibiakan murni atau biakan aksenik. Biakan yang berisi
lebih dari satu macam mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan campuran,
jika hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang dengan sengaja dipelihara
satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagai biakan dua-jenis (Alam dkk, 2013)
Pewarna gram atau metode gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang
paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasikan bakteri. Dalam
proses ini, olesan bakteri yang sudah erfiksasi dikenai larutan-larutan berikut :zat
pewarna kristal violet, larutan iodium, larutan alkohol, dan zat pewarna
tandinganberupa zat warna safranin. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuan Denmark Hans Christian Gram (1853- 1938) yang
 mengembangkan teknik ini pada tahun 1884, untuk membedakan antara
pneumokokus dan klebsiella pneumonieae. Bakteri yang terwarnai dengan metode
ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan
karenanya akan tampak berwarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun gram
negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci denan alkohol, dan
sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air safranin
akan tampak berwarna merah. Perbedan warna ini disebabkan oleh perbedaan
dalam struktur kimiawi dinding selnya ( pelezar M J 1989).
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Unutk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)

1.2 Tujuan Percobaan

- Mengetahui isolasi dan pewarnaan bakteri
 Bab II
Tinjauan pustaka

2.1 Isolasi Bakteri

Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan

menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya
dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada
tempatnya. Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme
(bakteri) dikenal sebagaibiakan murni atau biakan aksenik. Biakan yang berisi
lebih dari satu macam mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan campuran,
jika hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang dengan sengaja dipelihara
satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagai biakan dua-jenis (Alam dkk, 2013)
Mikroorganisme tidak memerlukan banyak ruangan untuk
perkembangannya, sebab itu media buatan (agar) dapat dimasukkan ke dalam
sebuah tabung percobaan labu atau cawan Petri. Pada permulaannya tabung atau
cawan Petri harus dalam keadaan steril (bebas dari setiap mikroorganisme hidup)
lalu setelah itu dimasukkan mikrobia yang diinginkan, tabung atau cawan harus
dilindungi terhadap kontaminasi dari luar. Sumber utama pencemaran dari luar
adalah udara, yang banyak mengandung mikroorganisme yang berterbangan.
Bentuk cawan petri, dengan tutup yang saling menyelubungi, dirancang untuk
mencegah pencemaran udara (Alam dkk, 2013)
 Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan
campuran mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisah-
pisah. Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada media
agar memungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya, juga
memungkinkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni, yaitu sekelompok
massa sel yang dapat dilihat dengan mata telanjang. Bahan yang diinokulasikan
pada medium disebut inokulum, dengan menginokulasi medium agar nutrient
dengan metode cawan gores atau media cawan tuang, sel-sel mikroorganisme akan
terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mikroba individu memperbanyak
diri secara cepat sehingga dalam waktu 18-24 jam terbentuklah massa sel yang
dapat dilihat dan dinamakan koloni. Koloni dapat terlihat oleh mata telanjang.
Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme (Joddi, 2006).

2.2. Metode Isolasi

Mikroba yang hidup di alam terdapat sebagai populasi campuran dari bebagai
jenis mikrobia yang berbeda prinsip dari isolasi mikrobia dalam memisahkan satu
jenis mikroba dengan mikroba lainnya dari lingkungannya dialam dan ditumbuhkan
dalam medium buatan. Pertumbuhan mikroba dapat dilakukan dalam medium
padat, karena dalam medium padat sel-sel mikroba akan terbentuk suatu koloni sel
yang tetap pada tempatnya, ada beberapa teknik isolasi mikroba yakni (Wati, 2013)
1. Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan menggoreskannya ke
permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan harapan pada ujung goresan,
hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan menempel ke medium. Sel-
sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang kemudian dapat
dipindahkan ke medium selanjutnya agar didapatkan biakan murni.
2. Metode tuang atau pour plate dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan mencampur
suspensi bakteri dengan medium agar pada suhu 50ºC kemudian menuangkannya
pada petridisk atau dengan menyemprotkan suspensi pada dasar petridisk,
kemudian menuang medium agar keatasnya dan diaduk. Setelah agar mengeras,
bakteri akan berada pada tempatnya masing-masing dan diharapkan bakteri tidak
mengelompok sehingga terbentuk koloni tunggal.
3. Metode sebar atau spread plate dilakukan dengan menyemprotkan suspensi ke
atas medium agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski.
Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara individual, kemudian dapat tumbuh
menjadi koloni tunggal (Wati, 2013)

2.2 Pewarnaan Bakteri

Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa tanpa
yaitu dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan
bergantung,menggunakan kondensor medan gelap dan lain-lain.Tetapi pengamatan
dari pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat bagian-bagian sel
dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan. Melihat dan
mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak
berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal tersebut maka di
kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat terlihat jelas dan
mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah
satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi
(Dwijoseputro, 2005).
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai
organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-
pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa).
Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat
alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-
sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah
metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini
dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

a. pewarnaan asam
 Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan
positif adalah metilen biru dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri
tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau
tinta cina.
2. Pewarnaan Deferensial
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan
gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938)
yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu
bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap
cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding
selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh
bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan
beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini
diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya
sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat
warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode
pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
a. Gram positif dan negative
 Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal
violet) dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan
tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel
bakteri tampak berwarna ungu.
Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna
utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat
diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-
sel bakteri tampak berwarna merah.
b. Pewarnaan acid-fast
Tekhnik pewarnaan bakteri tahan asam ziehl neelsen adalah pewarnaan
Differential yang berguna untuk identifikasi Bacillus Tuberculosis,
Mycobacteria lain dan Nocardia.
Pewarnaan bakteri tahan asam ziehl neelsen ini didasari oleh perbedaan
komposisi kimia dari dinding sel sel bakteri.
Karena sangat sulit melakukan pewarnaan pada mikroorganisme ini dengan
pewarnaan biasa, digunakan pewarnaan dasar dengan tambahan asam pekat.
Secara umum, pemanasan harus dilakukan selama pewarnaan ini. untuk
membantu mempermudah penetrasi pewarnaan.
Mikroorganisme yang memperlihatkan sifat tahan asam, akan sangat sukar
melepaskan pewarna yang sudah menempel. dengan alkohol.
Sedangkan mikroorganisame yang tidak tahan akan mengalami dekolorisasi
dengan asam dan terwarnai dengan pewarna kedua.
3. Pewarnaan Struktur Sel
a. Pewarnaan Spora
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa,
diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora
yang paling banyak digunakan.
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu
dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora ,
seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana
cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam
mycolic dari Mycobacterium .
b. Pewarnaan flagel
 Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak
stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
c. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga
sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika
pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi
warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap

Perbedaan ciri-ciri bakteri gram positif dan gram negative :

Gram Positif Gram Negatif
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15- Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10
80 nm, berlapis tunggal atau monolayer – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

Dinding selnya mengandung lipid yang Dinding selnya mengandung lemak

lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada
yang sebagai lapisan tunggal. Komponen
utama merupakan lebih dari 50% berat
ringan. Mengandung asam tekoat
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
lebih banyak (11-22%), peptidoglikan
terdapat didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan
jumlah sedikit ± 10% dari berat kering,
tidak mengandung asam tekoat.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh Kurang rentan terhadap senyawa

zat-zat warna seperti ungu kristal. penisilin

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih Pertumbuhannya tidak begitu dihambat

rumit. oleh zat warna dasar misalnya kristal
violet.
 Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan
relatif sederhana

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Tidak peka terhadap streptomisin Resistensi terhadap alkali (1% KOH)

lebih pekat

Toksin yang dibentuk Eksotoksin Peka terhadap streptomisin

Endotoksin

Toksin yang dibentuk Endotoksin

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:

1. Fiksasi
Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna
merekatkan sel bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan granula
(butiran) protein menjadi gugusan reaktif (NH3+) membuat sel-sel lebih kuat,
 mencegah terjadinya otolisis sel, mengubah avinitas, fiksasi dapat dilakukan secara
fisik atau dengan bahan kimia.
2. Peluntur zat warna
Peluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik pada
bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih
mudah pula dilunturkan warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan
lebih sukar dilunturkan warnanya.
3. Substrata
Merupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawa-
senyawa tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti protein,
karbohidrat, lemak dan asam nukleat akan mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan
jenis zat warna yang diserap oleh sel, maka dapat dibedakan tiga macam sel yaitu:
sel-sel asidofil, basodill dan sudanofil.
4. Intensifikasi warna
Zat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan,
yaitu zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih
intensif karena zat warna terikat lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi
atas dua macam, yaitu mordan asam dan mordan basa. Mordan asam adalah mordan
yang bereaksi dengan zat-zat warna basa. Sedangkan mordan basa adalah mordan
yang bereaksi dengan anion zat warna asam.
5. Zat warna penutup atau zat warna lawan
Zat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya
dengan zat warna mula-mula yang digunakan. Gunanya adalah untuk memberikan
warna pada sel-sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula. Zat warna
penutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk memberikan kontras
pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama (Sutedjo, 1991).
 Bab III

KESIMPULAN
1. Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan.
2. Pewarnaan bakteri pada umumnya bertujuan untuk mempermudah
dalam pengamatan morfologi bakteri dengan bantuan
mikroskop. Teknik perwarnaan bakteri yaitu Pewarnaan sederhana,
Pewarnaan Negatif, Pewarnaan Diferensial, dan Pewarnaan Khusus.
 DAFTAR PUSTAKA

Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.

Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba.

Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. UI Press. Jakarta.

Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta :
Erlangga.