Anda di halaman 1dari 3

Abomasum dari sapi yang baru dipotong, diambil kemudian dicuci.

Lalu bagian fundus dipotong


dan dibuang. Sedangkan bagian mukosa dipisahkan, dipangkas dan disimpan pada suhu sekitar
50.
Langkah 1: The hash mukosa (9.1 kg) diekstraksi dengan 18 liter 0,1 M buffer sodium fosfat pH
7,3 selama 15 menit. Solca floe BW-20, 4,5 kg, ditambahkan, dan campuran disaring pada tiga
corong Buchner. Filtrat kembali diekstraksi menggunakan 18-liter pH 7,3 buffer sodium fosfat.

Langkah 2: Ammonium Sulfat Fraksinasi-Ekstrak digabungkan. Padat amonium sulfat


ditambahkan ke saturasi 23%, dengan NaOH diperkenalkan sebagai diperlukan untuk menjaga
pH dekat dengan 7,3. Sekali lagi 4,5 kg BW-20 ditambahkan, dan campuran disaring. Kue dicuci
dengan 10 sampai 15 liter larutan penyangga, 23% jenuh dengan amonium sulfat. Filtrat dan
cucian digabungkan. Padat amonium sulfat ditambahkan ke saturasi 63%. Perlite 4106 (500 g)
ditambahkan, dan campuran dibiarkan untuk menetap semalam. supernatan tersedot dan dibuang.
Endapan dikumpulkan pada tiga saluran Buchner dan dikirimkan beku ke laboratorium.

Langkah 3: DEAE-cellulose dan supernatan amonium sulfat dibagi menjadi 600-g batch.
Masing-masing batch disuspensi dalam 500 ml buffer 0,01 M Tris-fosfat pH 7,0. Sentrifugasi
suspensi selama 3 jam pada 13.000xg. Supernatan gabungan kemudian disentrifugasi pada
36.000xg selama 3 sampai 4 jam. Endapan dicuci seperti sebelumnya.
Larutan murni sudah mulai tampak, kemudian disaring melalui ( ) dilipat kertas, dibiarkan untuk
menetap semalam atau lebih.
1,0 sampai 1,5 g pepsinogen dilarutkan dalam 7.900 ml dengan penyangga 0,05 M Tris-fosfat
dan dicampur dengan 2.100 ml DEAE-cellulose. Larutan diaduk mekanis selama 1 jam dan
disaring melalui kain pada corong Buchner. Filtrate kemudian dilarutkan kembali dalam buffer
0,05 M Tris-fosfat segar dan dipindahkan ke kolom kromatografi 7 X 60 cm. Pepsinogen
kemudian dielusi dengan 0,45 M NaCl dalam buffer yang sama.
Langkah 4: desalting pada Sephadex G-% 5-A campuran kasar dan manik-manik Sephadex baik
dalam proporsi 9: 1 digunakan untuk memberikan laju aliran sekitar 180 ml per jam. The, kolom,
5 X 100 cm, disiapkan seperti yang direkomendasikan oleh produsen (28), yang diseimbangkan
dengan penyangga 0,01 M Tris-fosfat. Hingga 250 ml larutan pekat dari Langkah 3 dapat
ditempatkan pada kolom pada satu waktu. protein dielusi dengan 0,01 M penyangga Tris-fosfat.
Kolom ini digunakan berulang kali setelah mencuci garam. protein dihilangkan garamnya itu
dikumpulkan.

Langkah 5: Kedua Batch Penyerapan pada DEAE-cellulose, dengan Gradient Elusi-Solusi


desalted, mengandung 15.180 unit Azso dan 910 mg pepsinogen (Tabel I), diperlakukan seperti
dalam langkah 3 dengan 100 g DEAE-selulosa dalam total volume dari 5 liter. Suspensi disaring
seperti sebelumnya; filtrat terkandung 2.100 unit AQgO, tapi tidak ada pepsinogen. Filter cake
ditangguhkan di 1.200 ml 0,05 M penyangga Tris-fosfat, dan bubur dipindahkan ke kolom (5 x
60 cm) yang berisi dikemas tidur 15-cm segar DEAE-cellulose, diseimbangkan dengan buffer
yang sama. Gradien dijelaskan oleh Arnon dan Perlmann (5) untuk pemurnian pepsinogen babi
kristal telah disesuaikan dengan ukuran kolom yang digunakan. Botol volume konstan pertama
berisi 2.250 ml menyeimbangkan penyangga. Solusi gradien adalah 0,45 M NaCl dalam buffer
yang sama. Profil elusi ditunjukkan pada Gambar. 2. Fraksi dengan aktivitas lambung potensi
lebih dari 100 pg per unit Azso dikumpulkan dalam tiga bagian, seperti yang ditunjukkan oleh
panah. Bagian tengah, digunakan untuk langkah-langkah berikutnya pemurnian, terkandung 348
mg.

Langkah 6: Daur Ulang Gel Filtrasi pada Sephodex G-100-Awalnya filtrasi aliran gravitasi
tunggal diadili, tetapi pemisahan yang tidak sempurna dari aktif dari bahan yang berpotensi aktif
diperoleh (lihat di bawah). Oleh karena itu, perangkat daur ulang (29) digunakan untuk berjalan
berikutnya. Kolom (3,2 x 105 cm), cocok untuk aliran ke atas, dan katup daur ulang diperoleh
dari LKB Instruments. Kolom, disiapkan dengan cara biasa (28), yang diseimbangkan dengan
0,05 M penyangga Tris-fosfat dalam arah ke atas, dengan pompa diastolik. Sampel 50 ml
diperkenalkan melalui pompa pada kecepatan aliran dari 10 ml per jam. Pompa dan pipa dicuci
pada tingkat yang sama dengan tiga bagian 2-ml buffer. Laju aliran kemudian meningkat
menjadi 17 ml per jam; tidak ada tekanan balik yang dikembangkan dalam kolom. Pemisahan
tunggal ditunjukkan pada Gambar. 3 untuk perbandingan dengan eksperimen daur ulang dari
Gambar. 4. Untuk daur ulang, limbah yang dikumpulkan dalam kolektor fraksi sampai puncak
aktif pertama telah muncul. Fraksi berikutnya 120 ml, yang ditunjukkan oleh Zincs vertikal
Gambar. 4, adalah daur ulang. bahan tambahan aktivitas rendah muncul sebelum dan setelah
puncak pepsinogen. Fraksi-fraksi dengan aktivitas lambung potensi yang lebih besar dari 400 pg
per unit A280 dikumpulkan dan dipekatkan dengan ultrafiltrasi untuk 35 ml.
dari filtrasi daur ulang gel dari Langkah 6, 40 ml, termasuk pencucian dari ultrafilter,
ditempatkan pada kolom (2 X 49 cm) dari DEAE-cellulose diseimbangkan dengan penyangga
0,05 M Tris-fosfat. gradien adalah sama seperti untuk Langkah 5, dengan 360 ml buffer
menyeimbangkan dalam botol volume konstan. Ara. 5B menunjukkan bahwa sejumlah kecil
bahan aktif dipisahkan, dan bahwa puncak utama yang diperoleh hampir simetris, dengan
aktivitas potensial seragam. Sampel dikumpulkan dan didialisis 3 liter 0,01 M penyangga Tris-
fosfat, 3 liter 0,01 M buffer sodium fosfat pH 7, dan, akhirnya, tiga perubahan 4-liter air
deionisasi disesuaikan dengan pH 7. Setelah dialisis, yang sampel lyophiliaed. Tidak ada pepsin
aktif terdeteksi. Sebagai perbandingan, rechromatography bahan dari Gambar. 3 ditunjukkan
pada Gambar. 5A. Untuk percobaan ini, kolom (1 X 49 cm) dari DEAE-selulosa digunakan
dengan gradien setara, A 280; A- - -A, aktivitas spesifik. yaitu 90 ml eaAu ilibrating penyangga
dalam botol volume konstan. A, puncak aktif besar tumpang tindih puncak yang diinginkan dari
pepsinogen, pepsinogena, nd mentionedt ia kemungkinan bahwa Somen inhydrinindicating lagi
keuntungan dari daur ulang.