Ekspresi dan analisis sifat glikosilasi erythropoietin (Matsumoto et al.

, 1995), garis sel Schneider (berasal

manusia rekombinan yang diekspresikan dalam Pichia
dari Drosophila) (Kim et al., 2005) dan sel kelenjar
pastoris
susu (Zhang et al., 2000), telah dieksplorasi. Namun,
Abstrak sebagian besar sistem ini menyajikan masalah serius
Sistem ekspresi Pichia pastoris digunakan untuk
dan tidak dikejar lebih lanjut. Peningkatan
menghasilkan eritropoietin manusia rekombinan, suatu
protein yang disintesis oleh ginjal dewasa dan bertanggung pemahaman kita tentang aktivitas biologis EPO in vivo
jawab untuk pengaturan produksi sel darah merah. Seluruh telah menciptakan kebutuhan akan teknologi yang
gen rekombinan manusia erythropoietin (rhEPO) dibangun
menggunakan Penyambungan dengan Perpanjangan
dapat memberikan hasil yang lebih tinggi,
Overlap dengan teknik PCR (SOE-PCR), dikloning dan memperpanjang waktu paruh EPO rekombinan dan
diekspresikan melalui jalur sekresi dari sistem ekspresi meningkatkan aktivitas protein in vivo.
Pichia. Erythropoietin rekombinan berhasil diekspresikan
pada P. pastoris. Massa molekul yang diperkirakan dariDalam laporan ini, kami menjelaskan kloning, ekspresi
protein yang diekspresikan berkisar dari 32 kDa hingga 75
kDa, dengan variasi ukuran yang dikaitkan dengan dan analisis rhEPO yang diproduksi dalam ragi
metilotrofik Pichia pastoris. Ragi telah lama menjadi
kehadiran analog glikosilasi rhEPO. Analisis fungsional
kasar dari protein terlarut menunjukkan bahwa semua
organisme model untuk studi biokimia dan genetik
bentuk aktif in vivo.
karena keuntungan yang mereka tawarkan
dibandingkan dengan sistem bakteri, termasuk
pengantar kemudahan yang dapat mereka kultur dan
pertahankan, dan fakta bahwa mereka berbagi
Erythropoietin (EPO) adalah hormon glikoprotein
beberapa karakteristik biologis penting dengan
yang bertanggung jawab untuk pengaturan produksi
eukariotik. sel, seperti splicing dan proses lain yang
sel darah merah. Hormon ini memicu proliferasi,
terlibat dalam modifikasi pasca-translasi. Ragi spesies
diferensiasi dan pematangan prekursor eritroid
ragi telah digunakan untuk menghasilkan protein
sumsum tulang belakang ke eritrosit fungsional ketika
rekombinan, termasuk Saccharomyces cerevisiae,
ketersediaan oksigen darah menurun, seperti selama
Hansenula polymorpha dan Pichia pastoris (ditinjau
hipoksia. EPO mengikat dan mengaktifkan reseptor
dalam Böer et al., 2007). Sementara S. cerevisiae
pada sel progenitor erythroid. Perawatan pasien
menawarkan keuntungan yang serupa dengan ragi
anemia dengan EPO secara signifikan mengurangi
lain, misalnya, kemudahan manipulasi DNA, waktu
ketergantungan mereka pada transfusi darah dan
kultivasi lebih pendek dan kemampuan untuk
meminimalkan potensi efek samping seperti
melakukan peristiwa pasca-translasi, kecenderungan
kelebihan zat besi, infeksi dan reaksi yang merugikan
untuk protein heterolog untuk mengalami
terhadap antigen leukosit. Selain perannya dalam
hypermannosylation (dengan penambahan hingga 150
hematopoeisis, EPO bersifat neuroprotektif dalam
mannoses) untuk glikoprotein (Wu et al., 2002)
sistem saraf dan juga dapat melindungi organ lain
meningkatkan risiko imunogenisitas, terutama untuk
(Genc et al., 2004).
produk terapeutik. Glikosilasi atau mannosilasi yang
Sebelum tahun 1980-an, EPO manusia untuk berlebihan juga dapat menghambat sekresi protein
pengobatan gagal ginjal dan gangguan darah terkait rekombinan yang efisien karena ukuran glikogen yang
lainnya harus diekstraksi dari donor. Namun, dalam besar menyebabkan protein dipertahankan dalam
kondisi normal, ekspresi EPO umumnya rendah, yang membran periplasmik, meskipun terdapat urutan
berarti bahwa banyak donor diperlukan untuk sekresi sinyal untuk menunjukkan bahwa protein
mendapatkan bahan yang cukup untuk pengobatan. harus diekspor (Kang et al., 1998). Untuk alasan ini,
Keberhasilan kloning gen epo dan ekspresi ragi metilotrofik seperti Pichia pastoris dan Hansenula
selanjutnya di sel-sel hamster ovarium Cina (CHO) polymorpha lebih disukai karena panjang keseluruhan
menyebabkan produksi beberapa jenis EPO manusia rantai luar mannose lebih pendek dari pada S.
yang dapat dijual secara komersial (rhEPO) untuk cerevisiae (Kang et al., 1998). Spesies lain, seperti
digunakan manusia. Dari dulu, kemungkinan Kluyveromyces lactis dan Yarrowia lipolytica, masih
meningkatkan hasil dan efisiensi produksi dengan diselidiki untuk kegunaannya sebagai sistem kloning
menggunakan sel lain, seperti jalur sel tembakau dan ekspresi.

Material dan metode
Konstruksi in vitro dari gen epo
Seluruh gen erythropoietin manusia dibangun
menggunakan Splicing oleh Overlap-Extension
dengan teknik PCR (SOE-PCR). Empat set primer
dirancang untuk memperkuat empat ekson gen epo
berdasarkan urutan nukleotida GenBank (nomor
akses GenBank: X02158; Jacob et al., 1985). Primer
yang mencakup batas ekson-intron dirancang untuk
mengandung enam nukleotida yang saling
melengkapi dengan ekson yang berdekatan untuk
memfasilitasi tumpang tindih. Sebuah situs EcoRI
(GAATTC) dimasukkan dalam primer di kedua ujung
gen target untuk menghasilkan ujung-ujung lengket
yang akan memfasilitasi klon ing ke vektor ekspresi
pPICZ A. Set primer yang digunakan ditunjukkan
pada Tabel 1.
Keempat ekson gen epo awalnya diamplifikasi secara
tunggal menggunakan DNA genom manusia sebagai
templat. Setelah PCR, produk dimurnikan dengan
ekstraksi gel menggunakan kit komersial (Qiagen,
USA). Exon-exon yang berdekatan disamakan dalam
reaksi PCR kedua dengan memungkinkan ekson untuk
membentuk heterodupleks parsial di daerah yang
tumpang tindih diikuti dengan amplifikasi selektif
menggunakan primer terminal (lihat Gambar 1 untuk
lebih jelasnya). PCR dilakukan menggunakan 1U Pfu
polymerase (Fermentas, Lithuania), 1X reac- tion
buffer, 1,5 mM Mg2 + dan 200 M setiap dNTP
(Fermentas, Lithuania). Kondisi bersepeda PCR
bersisi 10 siklus denaturasi pada 95 ° C selama 45
detik, anneal ing pada 60 ° C selama 45 detik dan
elongasi pada 72 ° C selama 1 menit. Kondisi
bersepeda PCR selektif termasuk sebuah dekasi awal pada 30 ° C dengan gemetar (220 rpm) dan pada
pada 95 ° C selama 3 menit, diikuti oleh 32 siklus yang interval waktu yang berbeda supernatan dikumpulkan
mencakup denaturasi pada 95 ° C selama 45 detik,
annealing pada 60 ° C selama 45 detik dan
pemanjangan pada 72 ° C selama 1 menit, dengan
elonga- tion akhir pada 72 ° C selama 5 menit. Tiga
langkah PCR ini diulang sampai seluruh gen epo
diperoleh.
Kloning gen epo rekombinan
Seluruh pembentukan gen epo dicerna dengan EcoRI
(Promega, USA) dan diikat ke situs yang sesuai dalam
vektor ekspresi plasmid Pichia pPICZ A. Vektor ini
memiliki promotor yang sangat diinduksi (AOX1) dan
sinyal sekresi ( -faktor). Plasmid rekombinan diubah
menjadi E. coli (strain TOP10F) untuk isolasi scale-up.
PPICZ A rekombinan kemudian dilinierisasi oleh
pengobatan dengan SalI (Fermentas, Lituania) dan
ditransformasikan secara kimia menjadi P. pastoris
(strain X-33) dengan mengikuti protokol dalam manual
ekspresi Pichia (Invi- trogen, USA) . Urutan nukleotida
dari pembentukan gen epo rekombinan dikonfirmasi
oleh sekuensing DNA.
Dua gen epo rekombinan (pPICZ -rhEPO-Stop dan
pPICZ -rhEPO-His) dibangun (Gambar 2). Sebuah
kodon stop (TGA) diperkenalkan ke pPICZ -rhEPO-
Stop untuk menghasilkan EPO matang dari 165 asam
amino. Untuk mengekspresikan protein fusi yang
mengandung tag polyhistidine (pPICZ -rhEPO-Nya)
gen rhEPO dikloning dalam bingkai dengan peptida C-
terminal. Kedua vektor mengandung urutan sinyal -
faktor negatif yang menyediakan sekresi yang efisien
dari sebagian besar protein dari P. pastoris.
Ekspresi gen epo rekombinan di P. pastoris
Untuk kultur skala kecil, satu koloni atau kultur stok
beku ditanam semalam dengan pengocokan (220 rpm,
30 ° C) dalam 10 mL BMGY (1% ekstrak ragi, 2%
pepton,
100 mM potasium fosfat, pH 6,0, 1,34% ragi dasar
nitro gen, 4x 10-5% biotin dan 1% gliserol). Sel-sel
kemudian pellet dengan sentrifugasi (3000 g, 10
menit, suhu kamar) dan dipindahkan ke 50 mL BMMY
(ekstrak ragi 1% , 2% pepton, 100 mM kalium fosfat,
pH 6,0, 1,34% ragi dasar nitrogen, 4x 10-5% biotin dan
1% metanol) dalam labu 250 mL. Kultur diinkubasi
dengan sentrifugasi. Supernatan diendapkan dengan
menambahkan tiga volume ace-tone dan diinkubasi
pada -20 ° C semalam. Campuran kemudian
disentrifugasi (10.000 rpm, 4 ° C) dan pelet kemudian
dipecahkan dalam fosfat-buffered saline (PBS).
Table 1 - The sequences of primers used in overlapping extension. The
underlined sequences indicate the EcoRI site.
 Systems, USA) dan antibodi anti-mouse sekunder yang
Exon Primers Sequences
terkonjugasi dengan alkaline phosphatase (diluted 1:
Exon 1 EPO-F 5’-GTCGACGCGGCCGCGGAATTC GCC CCA CCA CGC CTC ATC TGT-3’
EPO-1Ro 5’-GCC CGT CGT6000; Sigma,
GAT ATT CTC USA).
GGC CTC Protein-protein
CTT G-3’ itu dilihat dengan
Exon 2 EPO-2Fo 5’-ATC ACG ACGsubstrat
GGC TGTstabi- litasCAC
GCT GAA Western
TGC -3’Blue® untuk alkalin
EPO-2Ro 5’-CCC GAC CTC CAT CCT CTT CCA GGC ATA G-3’
fosfatase (Promega, AS). Commercial rekombinan EPO
Exon 3 EPO-3Fo 5’-ATG GAG GTC GGG CAG CAG GCC GTA GAA G-3’
EPO-3Ro 5’-TTC CTT CTG(cEPO) digunakan
GGC TCC sebagai
CAG AGC CCG standar dalam analisis
AAG C-3’
Exon 4 EPO-4Fo 5’-GCC CAG AAGelektroforetik
GAA GCC ATC diproduksi
TCC CCT CCAdiG-3’
sel CHO (baik disediakan
EPO-Stop 5’-GCGCTACGTTCACAAGAATTC TCA TCT GTC CCC TGT CCT GCA GGC CT-3’
EPO-His
oleh Duopharma Biotech Bhd., Malaysia).
5’-GCGCTACGTTCACAAGAATTC CA TCT GTC CCC TGT CCT GCA GGC CT-3’

Pemurnian

rhEPO-Nya terkonsentrasi dan dimurnikan pada kolom

GraviTrap-Nya yang berisi Ni Sepharose 6 Fast Flow
(Amersham Biosciences, USA). Setelah pemuatan,
kolom dicuci dengan imidazol 20 mM dan dielusi
dengan imidazol 200 mM dalam 20 mM natrium
fosfat, pH 7,4, mengandung 500 mM NaCl.

Fraksinasi

rhEPO-Stop dan rhEPO-Nya di fraksinasi dalam sel

Mini Prep (Bio-Rad, USA) dengan gel pemecahan 10%.
Aparatus dirakit sesuai dengan instruksi pabrikan dan
elektroforesis dilakukan pada 200 V (~ 3-6 mA) selama
2-2,5 jam. Fraksi terelusi (200-250 L masing-masing)
Figure 1 - Construction of the epo gene via SOE-PCR.
dikumpulkan setiap 15 menit. Semua fraksi dianalisis
dengan SDS-PAGE dan western blotting.

Deglikosilasi

rhEPO-Nya dan rhEPO-stop dicerna dengan PNGase F

Figure 2 - Constructs for erythropoietin production. A: pPICZ-rhEPO-
Stop; B: pPICZ-rhEPO-His (5’AOX1 - alcohol oxidase promoter; -fac- tor
- secretion signal peptide; 6x His - C-terminal polyhistidine tag; 3’AOX1 -
transcriptional termination sequence).
SDS-PAGE dan western blotting
SDS-PAGE dilakukan pada 12,5% gel poliakrilamida.
Setelah elektroforesis, gel itu diwarnai dengan siliver
atau protein dipindahkan ke membran nitrocellulose
(Amersham Biosciences, USA) untuk blotting barat,
seperti yang dijelaskan dalam protokol standar (Bio-
Rad, USA). Protein rekombinan dideteksi
menggunakan antibodi EPO anti-manusia monoklonal
(diencerkan 1: 8000; R & D)
(New England Biolabs, Inggris) dan Endo H (New
England Biolabs, Inggris), sesuai dengan instruksi
pabrikan mereka. Degfosilasi rhEPOs dianalisis dengan
western blotting. CEPO yang diperlakukan dengan
enzim ini digunakan sebagai kontrol positif.
Penilaian aktivitas hematopoietik in vivo
Tikus ICR perempuan (disediakan oleh Rumah Hewan
Universitas Malaya) digunakan untuk menguji aktivitas
hematopoetik rhEPO yang diproduksi di P. pastoris.
Setiap tikus disuntik secara subkutan dengan 0,25 mL
sampel (supernatan terestris dari kultur rhEPO)
selama tiga hari berturut-turut. Tiga tikus (6-8 minggu)
digunakan untuk setiap perlakuan dan dua kelompok
tikus digunakan sebagai kontrol (salah satu dari dua
kelompok ini diobati dengan PBS dan yang lainnya
tidak menerima pengobatan). Sampel darah
dikumpulkan ke 5% natrium EDTA pada hari keempat Kedua versi EPO rekombinan, yaitu, dengan dan tanpa
setelah perawatan. Volume darah yang sama tag polyhistidine (rhEPO-Nya dan rhEPO-Stop),
dicampur dengan biru metilen baru dan diinkubasi berhasil diekspresikan, tetapi pada tingkat yang sangat
pada 37 ° C selama 1 jam. Tujuh mikroliter campuran rendah. Sejumlah kondisi budaya dioptimalkan
pewarna darah ini kemudian digunakan untuk digunakan untuk mencapai hasil yang lebih tinggi
membersihkan noda pada slide kaca. Lima slide (data tidak ditampilkan). Selain itu, dengan
disiapkan untuk setiap tikus (total 15 slide per menurunkan suhu kultur, campuran glycoisoform
perlakuan karena ada tiga tikus per kelompok). dihasilkan yang menghasilkan penampilan smear yang
Retikulosit dihitung dengan bantuan mikroskop (pada luas di blot barat berikutnya (Gambar 4, jalur 3 dan 5).
pembesaran 100X) di lima daerah yang dipilih secara Massa molekul rhEPO-Stop berkisar antara 32-75 kDa
acak dari masing-masing slide dan jumlah mereka sedangkan rhEPO-Nya berkisar antara 37-75 kDa, yang
dinyatakan sebagai relatif terhadap jumlah total sel semuanya lebih besar daripada yang diamati untuk
darah merah yang diamati. cEPO (~ 32-37 kDa). EPO manusia asli sangat glikosilasi
(~ 32-37 kDa) dan sekitar 30% massa molekulernya
Analisis statistik dikaitkan dengan rantai karbohidrat (Dordal et al.,
Hasilnya dinyatakan sebagai mean SEM, jika 1985). Hasil kami menunjukkan bahwa glikosilasi
diperlukan. Perbandingan statistik dilakukan dalam rhEPO yang diekspresikan pada P. pastoris
menggunakan Student t-test, dengan nilai p <0,01 menyumbang ~ 30% -70% dari total massa molekul.
menunjukkan signifikansi. Fenomena ini tidak biasa karena hiperglikosilasi atau
hypermannosylation sering terjadi dalam sistem
ekspresi ragi (Wu et al., 2002). Berbagai studi telah
Hasil dan Diskusi menunjukkan bahwa glikosilasi pada P. pastoris
umumnya menghasilkan protein rekombinan
Ekspresi dan karakterisasi rhEPO
heterolog yang memiliki massa molekul yang lebih
Empat ekson (105, 99, 192 dan 183 pasangan basa) besar daripada protein yang sesuai yang diproduksi
dari gen epo berhasil diligasi melalui SOE-PCR untuk dalam sistem ekspresi mamalia (Braren et al., 2007).
menghasilkan gen panjang penuh dari 543 pasangan Namun, ada kasus di mana protein rekombinan yang
basa (Gambar 3), dengan situs EcoRI yang tergabung diproduksi di P. pastoris memiliki massa molekul yang
di kedua terminal. SOE-PCR adalah alat yang lebih rendah daripada yang diproduksi dalam sistem
sederhana, hemat biaya untuk konstruksi gen mamalia. Sadhukhan dan Sen (1996) mendalilkan
rekombinan, terutama untuk EPO yang umumnya bahwa ini mungkin mencerminkan tidak adanya
memiliki ekspresi rendah di jaringan selain ginjal. proses modifikasi pasca translasi lain dalam ragi,
Prosedur ini mengelakkan kerja ekstraksi mRNA yang misalnya, fosforilasi, sulfidasi dan sialilasi. Contohnya
melelahkan dari sel-sel ginjal manusia. Kesetiaan PCR adalah glikoprotein enve- dari virus demam babi klasik
dan langkah konstruksi gen selanjutnya dikonfirmasi (Erns) yang, bila dinyatakan dalam P. pastoris,
oleh analisis sekuens, yang mengungkapkan bahwa memiliki massa molekul yang lebih rendah dari yang
konstruk rekombinan memiliki urutan yang sama diharapkan (Huang et al., 2006).
persis seperti yang dipublikasikan oleh Jacob et al.
Untuk menyelidiki variasi glikosilasi dari protein-
(1985). Dengan menggunakan pendekatan ini,
protein yang dominan, dua EPO rekombinan ditindesi
wilayah yang tumpang tindih antara dua ekson yang
dengan glikosidase (PNGase F) untuk melepaskan
berdekatan dapat diminimalkan menjadi 12 bp tanpa
karbohidrat-N-linked. Deglycosylation mengurangi
mengurangi efisiensi penyambungan. Tumpang tindih
massa molekul dari kedua EPO rekombinan. Seperti
ini lebih pendek dari yang dilaporkan sebelumnya
yang diperkirakan dari urutan asam amino, massa
dengan menggunakan metode perpanjangan lap
molekul dari tulang punggung polipeptida dari cEPO
diperpanjang (Wurch et al., 2000; Davidson et al.,
dan rhEPO-Stop adalah serupa, yaitu, ~ 18 kDa
2002; Ailenberg et al., 2005).
(Gambar 4A). Untuk rhEPO-Nya, massa molekul
diprediksi dari tulang punggung polipeptida adalah ~
23 kDa karena tambahan 44 asam amino di C-
terminal protein yang termasuk tag polyhistidine
untuk pemurnian. Gambar 4A juga menunjukkan
bahwa dua band diamati untuk EPO komersial,
dengan pita atas yang sesuai dengan protein EPO
dengan karbohidrat O-linked sedangkan pita bawah
adalah EPO non-glikosilasi (Elliott et al., 1994). Dua
band juga diamati untuk dicerna rhEPO-Nya tetapi
massa molekul berbeda ketika dibandingkan dengan
cEPO. Kami mendalilkan bahwa pita bawah (23 kDa)
adalah tulang punggung polipeptida dari rhEPO-Nya,
sedangkan pita atas (~ 26-31 kDa) adalah EPO
deglikosilasi dengan O-linked oli-gosaccharides.
Meskipun saran ini memerlukan konfirmasi hasil yang
sama diperoleh setelah degli-cosylation yang lama
(setidaknya 24 jam), menunjukkan bahwa kehadiran
pita yang lebih besar bukan karena deglikosilasi yang
tidak lengkap (data tidak ditunjukkan).
Figure 3 - Construction of the entire epo gene via SOE-PCR. Lanes 1-4:
Amplification of exons 1, 2, 3 and 4 (105, 99, 192 and 183 bp), respec-
tively; lane 5: Amplification of the entire epo gene (543 bp); the smaller
non-specific bands were eliminated by gel purification.
Figure 4 - Western blots of cEPO, rhEPO-His and rhEPO-Stop after treat-
ment with (A) PNGase F and (B) Endo H. Treatment with PNGase F or
Endo H is indicated with (+) and no treatment is indicated with (-). PM
- protein molecular mass markers.
Untuk menilai lebih lanjut perbedaan glikosilasi
antara cEPO dan rhEPO, glycans N-linked juga dilepas
menggunakan enzim Endo H, yang hanya memotong Analisis aktivitas protein rekombinan
rantai gula mannose tinggi dari N-linked
glycoproteins. Seperti yang diharapkan, pencernaan
rhEPO-Stop dan rhEPO-Nya dengan Endo H
menghasilkan hasil yang serupa dengan yang
diperoleh dengan PNGase F, menunjukkan bahwa
rhEPO yang diekspresikan Pichia mengandung
mannoses tinggi saja dan tidak ada gula kompleks
(Gambar 4A, B). Namun, pencernaan Endo H
tampaknya tidak berpengaruh pada cEPO, yang
menunjukkan bahwa N-glycans tidak dilepas (Gambar
4B). Kurangnya gula kompleks dalam N-gly- cans untuk
protein yang diekspresikan pada P. pastoris juga telah
dilaporkan untuk glycodelin A rekombinan
(Mukhopadhyay et al., 2004) dan equine herpesvirus
glycoprotein D (Rui- tenberg et al., 2001).
Pengaruh deglycosylation pada protein fraksinasi juga
diperiksa. Gambar 5 dan 6 menunjukkan bahwa massa
molekul semua fraksi bentuk yang disekresikan dari
kedua rhEPO direduksi menjadi nilai yang sesuai
dengan massa pra-didik dari tulang punggung
polipeptida non-glikosilasi yang ditunjukkan pada
Gambar 4. Hasil ini mendukung saran. bahwa variasi
dalam massa molekuler (dilihat sebagai smear luas di
blot barat) disebabkan oleh perbedaan kandungan
glycans. Perhatikan bahwa yang lebih besar dari dua
band yang diamati untuk rhEPO-Nya (lihat Gambar 4)
hanya muncul dari fraksi ketiga dan seterusnya
(Gambar 5A), yang menunjukkan bahwa fraksi
sebelumnya tidak mengandung glycoi- soform diduga
O-linked.
Figure 6 - Western blots of fractionated rhEPO-Stop after treatment with
PNGase F (A, B, C and D). Lanes F1-12: samples after fractionation at 15
min intervals, PM – protein molecular mass markers, (+) treated with
PNGase F, (-) not treated with PNGase F
Pada tikus yang disuntik dengan rhEPO-Stop dan direpresentasikan oleh Pichia dapat menjadi faktor risiko penting untuk
peningkatan imunogenisitas.
rhEPO-Nya jumlah retikulosit meningkat sebesar 3,15
0,63 dan Hipermannosilasi pada P. pastoris dimulai oleh
aktivitas -1,6-mannosyltransferase (Och1p) (Dean,
3,03 0,65, masing-masing (Gambar 7). Peningkatan 1999). Inaktivasi gen OCH1, yang mengarah pada
ini secara signifikan (p <0,01) lebih tinggi daripada eliminasi atau minimalisasi glikosilasi N-linked pada P.
yang diamati pada tikus yang disuntik dengan PBS pastoris, telah dianggap sebagai langkah penting
dan kontrol negatif yang tidak diobati. Peningkatan dalam "hu- manisasi" sel inang ini (Bretthauer, 2003;
reticylocytes ini menunjukkan bahwa rhEPO-Stop dan Vervecken et al. ., 2004). Langkah "humanisasi" lain
rhEPO-Nya yang dihasilkan dalam penelitian ini yang relevan termasuk pengenalan gen yang
secara fungsional aktif meskipun variasi glikosilasi jika memberikan aktivitas 1,2-man-nosidase (untuk
dibandingkan dengan EPO asli manusia dan CHO- menghilangkan residu 1,2-mannose) dan gen lain
menyatakan EPO. (GlcNAc transferase I) yang menambahkan 1,2-linked
Glikosilasi adalah peristiwa modifikasi translasi pasca- GlcNAc residu ke lengan 1,3-mannose. Strain P.
translasi umum di jalur sekresi sebagian besar sistem pastoris yang direkayasa yang dapat menghasilkan apa
ekspresi eukariotik; Namun, diketahui spesies, jenis yang disebut 'hybrid-type' N-glycan telah diproduksi,
jaringan dan sel-spesifik (Brooks, 2006). Variabel dengan hasil yang menjanjikan dan efek minimal
glikilasi adalah mungkin salah satu alasan untuk terhadap viabilitas ragi (Bretthauer, 2003; Choi et al.,
massa molekul variabel dilaporkan dalam sistem 2003; Hamilton et al. , 2003; Vervecken et al., 2004).
ekspresi eukariotik yang berbeda. Baru-baru ini, Hamilton dkk. (2006) melaporkan
rekayasa ekstensif P. pastoris yang juga
memungkinkan produksi glikoprotein sialylated yang

Figure 7 - Increase in the number of reticulocytes after multiple

subcuta- neous injections of rhEPO-Stop and rhEPO-His. The results
are the mean

 SEM of five slides examined for each of three mice. The overall
increase in the number of reticulocytes in mice (3/group) treated with
rhEPO-Stop and rhEPO-His was 3.15  0.63 and 3.03  0.65,
respectively. These per- centages were significantly (p < 0.01) greater
than observed in PBS- injected and negative control mice.

Misalnya, rekombinan EPO adalah ~ 35 kDa dalam sel CHO (Lin et al.,
1985), ~ 31 kDa dalam sel tembakau (Matsumoto et al., 1995), ~ 25
kompleks, yang diharapkan dapat meningkatkan
kDa di Drosophila sel S2 (Kim et al., 2005 ),> 29 kDa dalam S. cerevisiae
(Elliott et al., 1989) dan waktu paruh dan potensi terapeutik dari sebagian
besar glikoprotein. Ketersediaan garis sel ragi seperti
~ 30 kDa di Physcomitrella patens (Weise et al., 2007), sementara EPO
urin manusia (atau EPO asli) dilaporkan itu dengan produk protein `ditingkatkan 'akan secara
~ 34 kDa (Dordal et al., 1985). Baru-baru ini, Celik dkk. (2007)
signifikan mengurangi risiko masalah yang terkait
melaporkan bahwa massa molekul rHuEPO adalah 30 kDa dan bahwa dengan imunogenisitas. Properti ini, bersama dengan
glycan utama yang melekat pada ketiga situs glikosilasi N-linked
adalah Man17 (GlcNAc) 2. Curi- menerus, selain untuk rekombinan
pengurangan waktu dan biaya produksi, dapat
EPO diproduksi secara resmi commer- dalam sel CHO, tidak ada menghilangkan kebutuhan untuk menggunakan sel
penelitian lain yang disebutkan di atas mengomentari korelasi
mungkin atau tion associa- antara yang berbeda rhEPO profil glycan
mamalia di masa depan.
dan tivity bioac- protein. Aspek ini layak untuk diselidiki lebih lanjut.

Mungkin masalah yang paling penting untuk ditangani adalah apakah

protein yang diproduksi dalam ragi dapat dibuat menjadi lebih seperti
protein yang sesuai pada manusia. Kedua EPO dan EPO , yang
Ucapan terima kasih
memiliki isoform tions composi- yang berbeda, telah diproduksi dalam
sistem sel mamalia (Storring et al., 1998), dan analisis EPOS ini telah Penelitian ini disponsori oleh Universitas Ma-laya
menunjukkan bahwa dalam kasus ini perbedaan pola glikosilasi
mereka tidak menghasilkan dalam perbedaan imunogenisitas
(Hibah Penelitian Pascasarjana) dan Yayasan Sains
(Hermeling et al., 2003). Protein rekombinan yang diproduksi di P. Toray Malaysia.
pastoris cenderung menjadi hypermannosylated. Meskipun tidak ada
laporan rinci tentang konsekuensi potensial dari hypermannosylation
dalam respon imun manusia, hypermannosylation pada protein yang
References
Ailenberg M, Goldenberg NM and Silverman M (2005) Descrip- (2006) Humanization of yeast to produce complex termi-
tion of a PCR-based technique for DNA splicing and nally sialylated glycoproteins. Science 313:1441-1443.
muta- genesis by producing 5’ overhangs with run
through stop DNA synthesis utilizing Ara-C. BMC
Biotechnology 5:e23.

Böer E, Steinborn G, Kunze G and Gellissen G (2007) Yeast ex-

pression platforms. Appl Microbiol Biotechnol 77:513-523.
Braren I, Greunke K, Umland O, Deckers S, Bredehorst R and
Spillner E (2007) Comparative expression of different anti- body
formats in mammalian cells and Pichia pastoris.

Biotechnol Appl Biochem 47:205-214.

Bretthauer RK (2003) Genetic engineering of Pichia pastoris to

humanize N-glycosylation of proteins. Trends Biotechnol
21:459-462.

Brooks SA (2006) Protein glycosylation in diverse cell systems:

Implications for modification and analysis of
recombinant proteins. Expert Rev Proteomics 3:345-359.

Celik E, Calik P, Halloran SM and Oliver SG (2007) Production

of recombinant human erythropoietin from Pichia
pastoris and its structural analysis. J Appl Microbiol
103:2084-2094.

Choi BK, Bobrowicz P, Davidson RC, Hamilton SR, Kung DH, Li

H, Miele RG, Nett JH, Wildt S and Gerngross TU (2003)
Use of combinatorial genetic libraries to humanize N-
linked glycosylation in the yeast Pichia pastoris. Proc Natl
Acad Sci USA 100:5022-5027.

Davidson RC, Blankenship JR, Kraus PR, Jesus Berrios M, Hull

CM, D’Souza C, Wang P and Heitman J (2002) A PCR-
based strategy to generate integrative targeting alleles
with large regions of homology. Microbiology 148:2601-
2615.

Dean N (1999) Asparagine-linked glycosylation in the yeast Gol-

gi. Biochim Biophys Acta 1426:309-322.

Dordal MS, Wang FF and Goldwasser E (1985) The role of carbo-

hydrate in erythropoietin action. Endocrinology
116:2293- 2299.

Elliott S, Giffin J, Suggs S, Lau EP and Banks AR (1989) Secre-

tion of glycosylated human erythropoietin from yeast di-
rected by the -factor leader region. Gene 79:167-180.

Elliott S, Bartley T, Delorme E, Derby P, Hunt R, Lorenzini T,

Parker V, Rohde MF and Stoney K (1994) Structural re-
quirements for addition of O-linked carbohydrate to
recom- binant erythropoietin. Biochemistry 33:11237-
11245.

Genc S, Koroglu TF and Genc K (2004) Erythropoietin and the

nervous system. Brain Res 1000:19-31.

Hamilton SR, Bobrowicz P, Bobrowicz B, Davidson RC, Li HJ,

Mitchell T, Nett JH, Rausch S, Stadheim TA, Wischnewski
H, et al. (2003) Production of complex human
glycoproteins in yeast. Science 301:1244-1246.

Hamilton SR, Davidson RC, Sethuraman N, Nett JH, Jiang Y,

Rios S, Bobrowicz P, Stadheim TA, Li H, Choi BK, et al.
Hermeling S, Schellekens H, Crommelin DJA and Jiskoot W (2003) Miscelle-associated protein in epoetin formulations: A risk
factor for immunogenicity. Pharm Res 20:1903-1907.

Huang C, Chien MS, Hu CM, Chen CW and Hsieh PC (2006) Se- creted expression of the classical swine fever virus glyco- protein
Erns in yeast and application to a sandwich blocking ELISA. J Virol Meth 132:40-47.

Jacob K, Shoemaker C, Rudersdorf R, Neill SD, Kaufman RJ, Mufson A, Seehra J, Jones SS, Hewick R, Fitch EF, et al. (1985)
Isolation and characterization of genomic and cDNA clones of human erythropoietin. Nature 313:806-810.

Kang HA, Sohn JH, Choi ES, Chung BH, Yu MH and Rhee SK (1998) Glycosylation of human 1-antitrypsin in Saccharomyces
cerevisiae and methylotrophic yeasts. Yeast 14:371-381.

Kim YK, Shin HS, Tomiya N, Lee YC, Betenbaugh MJ and Cha HJ (2005) Production and N-glycan analysis of secreted hu- man
erythropoietin glycoprotein in stably transfected Drosophila S2 cells. Biotechnol Bioeng 92:452-461.

Lin FK, Suggs S, Lin CH, Browne JK, Smalling R, Egrie JC, Chen KK, Fox GM, Martin F, Stabinsky Z, et al. (1985) Cloning and
expression of the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci USA 82:7580-7584.

Matsumoto S, Ikura K, Ueda M and Sasaki R (1995) Characteriza- tion of a human glycoprotein (erythropoietin) produced in
cultured tobacco cells. Plant Mol Biol 27:1163-1172.

Mukhopadhyay D, SundarRaj S, Alok A and Karande AA (2004) Glycodelin A, not glycodelin S, is apoptotically active: Rel-
evance of sialic acid modification. J Biol Chem 279:8577- 8584.

Ruitenberg KM, Gilkerson JR, Wellington JE, Love DN and Whalley JM (2001) Equine herpesvirus 1 glycoprotein D ex- pressed in
Pichia pastoris is hyperglycosylated and elicits a protective immune response in the mouse model of EHV-1 disease. Virus
Res 79:125-135.
Sadhukhan R and Sen I (1996) Different glycosylation require- ments for the synthesis of enzymatically active angioten- sin-
converting enzyme in mammalian cells and yeast. J Biol Chem 271:6429-6434.

Storring PL, Tiplady RJ, Gaines Das RE, Stenning BE, Lamikanra A, Rafferty B and Lee J (1998) Epoetin alfa and beta differ in
their erythropoietin isoform compositions and biological properties. Br J Haematol 100:79-89.

Vervecken W, Kaigorodov V, Callewaert N, Geysens S, Vusser KD and Contreras R (2004) In vivo synthesis of mamma- lian-
like, hybrid-type N-glycans in Pichia pastoris. Appl Environ Microbiol 70:2639-2646.

Weise A, Altmann F, Rodriguez-Franco M, Sjoberg ER, Baumer W, Launhardt H, Kietzmann M and Gorr G (2007) High- level
expression of secreted complex glycosylated recombi- nant human erythropoietin in the Physcomitrella -fuc-t

-xyl-t mutant. Plant Biotechnol J 5:389-401.

Wu JM, Lee CK and Hsu TA (2002) Asparagine-linked glyco- sylational modifications in yeast. In: Al-Rubeai M (ed) Cell
Engineering: Glycosylation. Volume 3. Kluwer Academic Publishers, New York, pp 215-232.

Wurch T, Lestienne F and Pauwels PJ (2000) Optimisation of overlap extension PCR-based mutagenesis of a GC-rich DNA
template: Application to the human 2C-adrenoceptor cDNA. Biotechnol Lett 22:1603-1609.

Zhang XC, Cheng GX, Chen JQ, Cheng Y, Wei YR, Yao WL, Xu SF and Lao WD (2000) Expression of human erythropoietin directed
by mWAP promoter in mammary gland of trans- genic mice. Chin Sci Bull 45:226-228.

Associate Editor: Carlos F.M. Menck

License information: This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution,
and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.