Nama : Sri Indah Mulyawan Dewi

NIM : 1313015067

KANDUNGAN METABOLIT SEKUNDER DAN UJI

AKTIVITAS DAUN PILA-PILA (Mallotus paniculotus)

PROSEDUR PENELITIAN

A. Pembuatan Simplisia
1. Sampel daun pila-pila dikumpulkan
2. Sampel disortasi kering untuk menghilangkan bagian yang tidak dibutuhkan
dan memilih daun yang baik serta layak untuk diekstraksi
3. Sampel kemudian dicuci dengan air bersih untuk membersihkan dari pasir dan
kotoran lain
4. Sampel kemudian dipotong kecil untuk mempercepat proses pengeringan
5. Sampel dikeringkan dengan cara diangin-anginkan dalam ruangan yang tidak
terkena cahaya matahari.
6. Sampel daun pila-pila yang telah kering ditimbang

B. Ekstraksi
1. Sampel yang telah kering dan diketahui beratnya diekstraksi dengan
menggunakan metode maserasi yakni menggunakan pelarut metanol p.a
dengan cara merendam sampel sampai sampel terendam sempurna dalam
pelarut di wadah kaca selama ± 24 jam dalam suhu ruang sambil dilakukan
pengadukan sesekali.
2. Setelah filtrat diperoleh, dilakukan remaserasi dengan merendam sampel daun
hasil meserasi pertama menggunakan pelarut metanol p.a yang baru dan
dilakukan remaserasi sampai didapatkan hasil filtrat berwarna bening
3. Selanjutnya disaring dengan menggunakan corong buchner yang diberi kertas
saring
4. Dipekatkan ekstrak dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40 °C
dan ditampung pada wadah kaca yang telah diketahui beratnya lalu diuapkan
dengan cara diangin-anginkan sampai menghasilkan ekstrak kering daun pila-
pila.
5. Ekstrak kering kemudian ditimbang
6. Dihitung berat ekstrak dengan cara mengurangkan berat wadah yang berisi
ekstrak dengan berat wadah kosong
7. Dihitung persen rendamen

C. Fraksinasi
1. Ekstrak kering ditimbang sebanyak 5 gram dan dilarutkan dalam 50 mL
aquades
2. Dimasukkan larutan ke dalam corong pisah dan ditambah pelarut n-Hexana 50
mL lalu digojog sampai tercampur dan diamkan sampai larutan memisah
menjadi dua lapisan yaitu lapisan air dan lapisan n-heksana.
3. Lapisan n-heksana dikeluarkan, ditampung dan diperoleh bagian yang larut
dalam n-heksan. Bagian larut air yang terdapat dalam corong pisah
ditambahkan kembali pelarut n-heksan dan dilakukan penggojokan kembali
hingga terbentuk 2 lapisan,
4. Lapisan n-heksana yang diperoleh ditampung dalam wadah dan dilakukan
beberapa pengulangan hingga diperoleh lapisan n-Hexana terlihat bening.
5. Lapisan yang larut aquadest diambil untuk dilakukan partisi selanjutnya
dengan pelarut etil asetat dan n-butanol.
6. Sampel yang telah dipartisi kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary
evaporator pada suhu 40 °C dan ditampung pada wadah kaca yang telah
diketahui beratnya
7. Ditimbang berat sampel kemudian dilanjutkan dengan fraksinasi dengan
menggunakan kromatografi kolom pada pelarut yang memiliki potensi
toksisitas terhadap Artemia salina Leach dan potensi antioksidan dan fraksi
dimonitoring dengan menggunakan metode KLT (Kromatografi Lapis Tipis)
 untuk mengelompokkan lebih lanjut fraksi-fraksi yang diperoleh berdasarkan
kesamaan kandungan kimia dari bercak KLT.
8. Kolom fraksinasi disiapkan dengan memasukkan 100 g serbuk silika gel 60
GF254 ke dalam sinter glass berdiameter 6 cm selanjutnya divakum dan
ditekan-tekan hingga tinggi silika tersebut kurang lebih setengah dari sinter
glass.
9. Persiapan sampel untuk fraksinasi dilakukan dengan menambahkan 5 g bahan
uji dari pelarut yang berpotensi (aktif) dengan n-heksan kemudian
ditambahkan lagi dengan 10 g silika gel GF254 dan diaduk rata selanjutnya
diangin-anginkan hingga terbentuk serbuk dari silika gel dan sampel yang
kering
10. Serbuk sampel yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan
dielusi dengan menggunakan menggunakan berbagai komposisi eluen dengan
metode kromatografi kolom. Kemudian fraksi-fraksi yang didapat ditampung
dalam vial
11. Fraksi-fraksi yang diperoleh kemudian dimonitoring dengan metode KLT
dengan cara dibuat eluen masing-masing sebanyak 2 mL lalu dijenuhkan eluen
dengan memasukkan kertas saring di dalamnya dan diamati kenaikan eluen
pada kertas saring, lalu ambil kertas saring dan ditutup eluen
12. Dipotong plat KLT menjadi bagian-bagian kecil dengan panjang 6 cm dan
lebar 2 cm lalu diberi garis batas bawah 1 cm dan batas atas 0,5 cm dengan
menggunakan jarum
13. Dilakukan penotolan larutan fraksi-fraksi dengan menggunakan pipa kapiler
pada batas bawah lempeng
14. Dimasukkan plat KLT yang telah ditotol ke dalam chamber yang berisi eluen
yang telah dijenuhkan
15. Diamati kenaikan pelarut pada plat KLT dan jika telah sampai pada batas atas,
diangkat plat KLT
16. Diangin-anginkan plat KLT hingga kering lalu diamati spot warna yang
timbul di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm
17. Digabungkan fraksi yang memiliki profil kandungan senyawa kimia yang
hampir sama, dan kemudian fraksi-fraksi yang didapat dikeringkan dengan
cara diangin-anginkan dalam suhu ruang.

D. Identifikasi Metabolit Sekunder

1. Pembuatan Pereaksi
a) Pereaksi Meyer dibuat dengan menimbang sebanyak 1,4 g merkurium (II)
klorida yang dilarutkan dalam air suling hingga 60 mL. pada wadah lain
ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10 mL air suling.
Kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh 100
mL.
b) Pereaksi Dragendorff dibuat dengan menimbang sebanyak 0,8 g bismut nitrat
yang kemudian dilarutkan dalam asam klorida 20 mL dan dicampurkan
dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 g dalam 50 mL air suling.
Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih diambil dan
diencerkan dengan air suling secukupnya hingga 100 mL.
c) FeCl3 untuk identifikasi senyawa fenolik dibuat dengan cara sebanyak 1 g besi
(III) klorida dilarutkan dalam air suling sampai 100 mL.
d) HCl 2% untuk identifikasi alkaloid dibuat dengan melarutkan 5,4 mL asa
klorida pekat dalam air suling sampai 10 mL.
e) HCl 10% untuk identifikasi saponin dibuat dengan melarutkan asam klorida
sebanyak 27 mL ke dalam air suling sampai 100 mL.
2. Prosedur Identifikasi
a) Identifikasi Alkaloid
1) Ekstrak kering daun pila-pila dilarutkan dalam lebih kurang 1,5 mL asam
klorida 2% di tabung reaksi.
2) Larutan kemudian dibagi ke dalam dua tabung reaksi. Tabung 1 ditambah 3
tetes larutan meyer. Tabung 2 ditambah 3 tetes larutan dragendorff.
3) Adanya alkaloid ditunjukkan dengan terjadinya kekeruhan atau endapan putih
kekuningan pada pereaksi meyer dan endapan jingga kecoklatan untuk
pereaksi Dragendorff.
b) Identifikasi Fenolik
Ekstrak kering daun pila-pila dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditetesi
dengan larutan besi (III) klorida 1%. Ekstrak positif mengandung fenolik
ditujukkan oleh timbulnya warna biru sampai hitam.
c) Identifikasi Flavonoid
1) Ekstrak kering daun pila-pila dilarutkan dalam 1-2 mL metanol dengan
bantuan pemanasan dalam tabung reaksi.
2) Pada larutan ditambahkan pita magnesium dan 4-5 tetes asam klorida pekat.
Adanya flavonoid ditunjukkan dengan tejadinya warna merah atau jingga.
d) Identifikasi Saponin
Ekstrak kering daun pila-pila dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
ditambah 10 mL aquades kemudian dikocok. Bila terdapat senyawa saponin
dalam ekstrak yang diuji maka akan terbentuk buih dan tidak hilang jika
ditambahkan asam klorida 10% selama 15 menit.
e) Identifikasi Steroid dan Triterpenoid
Ekstrak kering daun pila-pila dimasukkan dalam tabung reaksi dan
ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat, kemudian ditambahkan 1 tetes H2SO4
pekat. Warna larutan akan berubah dari warna ungu atau merah kemudian
berubah menjadi biru/hijau menunjukkan adanya steroid dan triterpenoid.

E. Uji Potensi Toksisitas terhadap Artemia salina Leach

1. Penyiapan Hewan Uji
a) Untuk media penetasan larva udang digunakan air laut asli yang telah disaring
dengan kertas saring lalu dimasukkan larva udang sebanyak 1 g dalam wadah
penetasan yang telah berisi air laut 500 mL.
b) Diberi penyinaran dengan lampu yang dipasang di samping wadah media
penetasan dan dimasukkan aerator untuk menyuplai oksigen ke dalam wadah
penetasan.
c) Ditunggu selama waktu 24-48 jam setelah penetasan telur, lalu nauplius siap
diuji
2. Pembuatan Seri Konsentrasi
a) Seri konsentrasi diperoleh dengan uji pendahuluan yaitu dengan cara
menentukan batas atas dan batas bawah LC50 dimana batas bawah merupakan
konsentrasi terkecil yang dapat menyebabkan kematoan 50% hewan uji dan
batas atas merupakan konsentrasi terkecil yang dapat menyebabkan kematian
50% hewan uji.
b) Jika jumlah larva udang yang mati berjumlah 1 atau 2, maka ditetapkan batas
bawah dari L50. Sebaliknya, apabila jumlah larva udang yang mati berjumlah
8 atau 9, maka ditetapkan batas atas dari LC50.
c) Setelah ditetapkan seri konsentrasi maka dibuat larutan stok sebesar 1000 ppm
untuk ekstrak dengan cara melarutkan 50 mg ekstrak dalam 50 mL air laut,
sedangkan untuk bahan uji partisi dan fraksi dibuat larutan stok sebesar 500
ppm dengan melarutkan 25 mg bahan uji dalam 50 mL air laut
d) Dibuat larutan seri konsentrasi dengan pengambilan volume tertentu dari
larutan stok dan dimasukkan dalam vial, lalu dimasukkan air laut sampai
volume 10 mL
e) Dibuat larutan kontrol negatif yang hanya berisi air laut dan DMSO jika
dalam pembuatan larutan stok menggunakan DMSO
3. Pengujian Bioaktivitas Ekstrak Daun Pila-Pila
a) Larva udang Artemia salina Leach sebanyak 10 ekor dimasukkan ke dalam
masing-masing vial yang berisi ekstrak atau fraksi
b) Dibuat stok ragi sebanyak 3 mg dalam 5 mL aquades sebagai sumber
makanan bioaktivitas uji.
c) Ke dalam vial-vial tersebut dimasukkan 1 tetes ragi sebanyak 3 mg/5 mL air
laut sebagai pakan. Vial-vial uji kemudian disimpan di tempat yang cukup
mendapat sinar lampu.
d) Pengamatan dilakukan selama 24 jam dan dihitung jumlah larva udang
Artemia salina Leach yang mati
e) Jumlah larva udang Artemia salina Leach yang mati dicatat dan dihitung LC50
dengan menggunakan analsis Reed and Muench.

F. Uji Potensi Antioksidan terhadap DPPH

1. Pembuatan Larutan DPPH
a) Kristal DPPH ditimbang sebanyak 4 mg untuk dilarutkan dalam 100 mL
etanol di dalam labu ukur gelap atau labu ukur coklat, sehingga didapatkan
larutan DPPH dengan konsentrasi 40 ppm (part per million) yang digunakan
pada pengujian.
b) Larutan disimpan pada tempat tertutup rapat dan terlindung dari cahaya.
2. Penentuan Panjang Gelombang Absorbansi Maksimum
1 mL larutan DPPH 40 ppm ditambah 1 mL metanol ke dalam tabung
reaksi, divortex dan kemudian dimasukkan ke dalam kuvet lalu diamati
absorbansinya pada rentang panjang gelombang (λ) 400-800 nm. Absorbansi
tertinggi adalah panjang gelombang maksimum.
3. Penentuan Seri Konsentrasi
a) Pembuatan larutan stok dilakukan dengan melarutkan 50 mg dalam 50 mL
aquades sehingga didapatkan konsentrasi 1000 ppm untuk ekstrak daun pila-
pila sedangkan untuk bahan uji partisi dan fraksi dibuat larutan stok sebesar
500 ppm dengan melarutkan 25 mg bahan uji dalam 50 mL air laut
b) Penentuan seri konsentrasi dilakukan dengan menetapkan batas atas dan batas
bawah konsentrasi ekstrak daun pila-pila yang akan diuji aktivitias
antioksidannya
c) Penentuan batas bawah dan batas atas dilakukan dengan menguji absorbansi
ekstrak dan fraksi daun pila-pila terhadap DPPH yang dimulai dengan
konsentrasi 10 ppm, 50 ppm, dan 100 ppm.
4. Pengukuran Absorbansi Aktivitas Antioksidan dan Potensi Antioksidan secara
Kuantitatif
a) 1 mL larutan sampel uji dalam berbagai konsentrasi ditambah 1 mL larutan
DPPH 40 ppm ke dalam tabung reaksi, divortex, dan dibiarkan di tempat
gelap pada suhu kamar selama 30-45 menit.
b) Dibuat kontrol negatif dengan 1 mL metanol ditambah 1 mL larutan DPPH 40
ppm.
c) Kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang maksimum lalu data absorbansi yang diperoleh digunakan
untuk menentukan % inhibisi (peredaan) dan IC50.