Anda di halaman 1dari 17

BAB I

PENDAHULUAN

11 Latar Belakang

Dalam dunia kesehatan sering ditemukan berbagai penyakit yang dapat mengancam

kesehatan makhluk hidup. Contoh dari penyakit itu adalah HIV/AIDS. Mad-cow disease (sapi

gila), penyakit Lyme yang disebabkan oleh kutu, Hepatitis, FIV yang terjadi pada kucing, dan

masih banyak penyakit lainnya. Penyakit tersebut memiliki gejala-gejala yang mirip dengan

penyakit lainnya, sehingga besar kemungkinan untuk terjadi kesalahan diagnosa penyakit yang

dapat membahayakan bagi penderita. Oleh karena itu, diperlukan suatu teknik yang dapat

mendeteksi keberadaan substrat penyebab suatu penyakit di dalam tubuh secara spesifik. Substrat

tersebut ditemukan ditemukan dalam bentuk protein yang spesifik berupa antigen (antibodi

generator/pemicu antibody).

Antigen merupakan protein asing yang berbahaya dan dapat menyerang tubuh sehingga

akan memicu munculnya antibodi spesifik pada tubuh. Antibodi yang terdapat pada tubuh

merupakan bagian sistem dari kekebalan tubuh yang dapat mencegah tubuh dari serangan

penyakit yang disebabkan oleh antigen yang masuk ke dalam tubuh.

Untuk dapat mendeteksi keberadaan suatu antigen pada tubuh, diperlukan suatu teknik

diagnosa sistematis yaitu Western Blotting. Teknik ini merupakan bagian dari diagnosa

kesehatan dalam disiplin ilmu Biologi Molekuler, Biokimia dan juga immunogenetik. Teknik ini

pertama kali dibuat oleh W.Neal dan dinamai Western Blot. Western blot merupakan teknik

untuk mendeteksi protein spesifik pada jaringan yang homogeny ataupun dari suatu ekstraksi

berdasarkan kemampuan protein tersebut berkaitan dengan antibodi. Teknik ini menggunakan

1|Page
gel elektrofotesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan

struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian ditransfer ke sebuah membran, biasanya

nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian akan dilacak dengan menggunakan antibodi

yang spesifik kepada protein target.

Berdasarkan penjelasan diatas tersebut, maka dalam makalah yang di susun kali ini akan

membahas secara spesifik mengenai pengertian, prinsip kerja, langkah kerja, dan manfaat dari

teknik Western Blot.

12 Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah pada makalah ini yaitu sebagai berikut:

1. Bagaimanakah pengertian atau teori secara umum dari teknik Western blot?

2. Bagaimanakah prinsip kerja dari teknik Western Blot?

3. Bagaimana langkah kerja dari tejnik Western Blot?

4. Manfaat apa saja yang bisa diambil dari teknik Western Blot?

13 Tujuan

Adapun tujuan yang dapat diambil dari penyusunan makalah ini antara lain:

1. Untuk dapat memaparkan serta mengetahui pengertian atau teori secara umum dari teknik

Western Blot.

2. Untuk dapat mengetahui secara rinci mengenai prinsip kerja dari teknik Western Blot.

3. Untuk mengetahui secara rinci langkah kerja Western Blot.

4. Untuk dapat mengetahui aplikasi dan manfaat dari penggunaan teknik Western Blot.

2|Page
14 Manfaat

Mendapatkan informasi lebih lanjut mengenai teknik Western Blot meliputi pengertian,

teknik dasar, proses tahapan, aplikasi dan manfaat. Dari informasi yang didapatkan diharapkan

dapat menjadi tambahan ilmu bagi mahasiswa untuk dapat dipergunakan sebaik mungkin.

3|Page
BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Western Blot

Menurut Fatchiyah, dkk (2011), western blot adalah istilah yang dipakai untuk

proses transfer dan imunodeteksi protein pada gel yang bertujuan untuk : (1) mengetahui

keberadaan dan berat molekul protein sampel dalam suatu campuran, (2) membandingkan

reaksi silang antar protein, (3) mempelajari modifikasi protein selama sintesis. Dengan cara

ini, protein dalam hitungan nanogram dapat terdeteksi. Nur & Adijuwana (1989)

mengemukakan bahwa western blot adalah proses pemindahan hasil protein dari gel hasil

elektroforesis ke membran dan digunakan untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan.

Imunoblot menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli. Hasil

elektroforesis antigen lalu ditransfer ke membran nitroselulosa dengan bantuan arus listrik.

Antigen pada membran selanjutnya akan dikenali oleh antibodi dari sampel. Pita-pita yang

terpisah dapat dideteksi dengan terdatnya warna pada membran.

Menurut Attwood et al., (2006) menyatakan bahwa Western Blot (WB) merupakan

suatu teknik untuk menandai suatu protein pada membran nitroselulosa, nilon, atau

membran transfer lain setelah protein tersebut terpisahkan melalui elektroforesis. Protein

tersebut kemudian dapat dideteksi melalui metode autoradiografi, pelabelan dengan


125
senyawa-senyawa fluoresen, pelabelan dengan I, pelabelan dengan antibodi terikat

protein, lektin atau gen pengikat spesifik lainnya. Western blot digunakan secara luas untuk

menentukan ukuran antigen dan antibodi yang diketahui, serta untuk diidentifikasi. Teknik

ini memiliki beberapa keuntungan seperti :

4|Page
1. Teknik ini mampu mendeteksi protein dengan sensitivitas tinggi karena protein

dipekatkan dalam volume kecil.

2. Waktu yang dibutuhkan efisien.

3. Reagens yang digunakan lebih ekonomis.

2.2 Prinsip Kerja Western Blot

Prinsip kerja western blotting dapat dilihat pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1. Prinsip Kerja Western Blotting .

Berdasarkan Gambar 2.1 tersebut, prinsip teknik western blotting yaitu mendeteksi

protein spesifik pada sampel jaringan yang homogen ataupun dari suatu ekstraksi

berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan antibodi. Teknik ini

menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang

polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian ditransfer ke

sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian akan

dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target.

5|Page
Membran tersebut (PVDF) dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga

protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi.

Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip imunologi

menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah pemberian antibodi sekunder,

deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian kromogen atau secara fluoresensi. Pada

deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi primer dengan antibodi sekunder akan

memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini

dilakukan di kamar gelap.

Immunodeteksi tidak dilakukan langsung pada gel karena sifat gel yang rapuh untuk

dapat melalui proses inkubasi yang lama dan pencucian yang berulang kali. Untuk

mengatasi hal ini, maka protein terlebih dahulu ditansfer dari gel ke membran nitroselulosa

(NC) atau membrane poliviniliden difluorida (PVDF).

Membran digunakan sebagai tempat melekatnya protein yang diuji karena:

1. Mudah manipulasinya

2. Mengurangi lama inkubasi dan pencucian.

3. Hasil protein yang ditrnsfer (hasil blot) dapat dipakai lagi untuk immunodeteksi protein

yang lain (sesudah diinkubasi dengan detergen untuk menghilangkan probing reagent.

4. Blot dapat disimpan sampai 1 bulan

5. Blot sesuai untuk berbagai prosedur deteksi (fatchiyah dkk, 2011).

Proses mendeteksi protein target dapat dilakukan secara direct dan indirect.

Pendeteksian secara direct (langsung) tidak membutuhkan antibodi sekunder karena

antibodi primer sudah langsung dilabeli oleh enzim maupun pewarna fluorescent.

Sedangkan pendeteksian secara indirect (tidak langsung) yaitu antibodi primer

6|Page
ditambahkan lebih dahulu supaya berikatan dengan protein antigen dalam sampel, lalu

diikuti penambahan antibodi sekunder sehingga antibodi sekunder dapat langsung berikatan

dengan antibodi primer. Label yang digunakan adalah konjugat enzim (substrat)

chemiluminescent horseradish peroxidase (HRP). Perbandingan procedur pendeteksian

protein antara direct dan indirect dapat dilihat pada Gambar 2.2. pendeteksian protein

target secara indirect lebih banyak digunakan karena memiliki lelebihan antara lain

antibodi sekunder dapat memperkuat sinyal pendeteksi, pelabelan tidak mempengaruhi

imunoreaktivitas antibodi primer, dan satu antibodi sekunder dapat digunakan untuk

beberapa antibodi primer (Rockoff dan Cole, 2011).

2.3 TAHAPAN WESTERN BLOT

Berdasarkan pengertian tersebut, WB dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap

pertama, elektroforesis. Tahap kedua, elektrotransfer. Tahap ketiga, deteksi (Gambar 1)

(Kindt et al., 2007).

7|Page
2.3.1 Tahap Pertama

Pada tahap pertama, protein yang diinginkan dipisahkan dari sampel secara

elektroforesis. Elektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul

dalam suatu tegangan listrik tertentu. Dalam elektroforesis, biasanya sampel yang

mengandung protein biasanya dicampur dengan SDS. SDS merupakan suatu detergen yang

memiliki muatan negatif. Muatan negatif SDS tersebut mengganggu kestabilan protein,

sehingga protein mengalami denaturasi. Interaksi ionik, jembatan disulfida, ikatan hidrogen

yang menyebabkan suatu protein mengalami folding untuk menjaga kestabilannya menjadi

terganggu akibat adanya SDS. Suatu protein multimer juga akan terurai menjadi monomer

penyusunnya. Akibatnya, protein-protein yang ada dalam sampel membentuk suatu rantai

polipeptida lurus. Semakin besar berat molekul suatu protein, maka rantai polipeptida

tersebut semakin panjang. Sampel dengan protein rantai polipeptida lurus tersebut

8|Page
dimasukkan dalam suatu membran poliakrilamid yang dialiri arus listrik. Protein yang telah

bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif. Laju pergerakan

protein dalam membran poliakrilamid tersebut berbeda-beda tergantung pada daya hambat

antara protein dan membran. Protein yang berukuran lebih besar akan memiliki daya

hambat lebih besar sehingga pergerakannya menjadi lebih lambat dibandingkan dengan

pergerakan protein yang berukuran lebih kecil. Setelah dialiri arus listrik selama beberapa

waktu, masing-masing protein akan terpisah berdasarkan ukuran molekulnya. Protein yang

lebih kecil atau memiliki berat molekul rendah akan bergerak lebih jauh dibanding protein

yang lebih besar. Dalam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita-pita yang

merupakan protein-protein yang telah terpisah berdasarkan berat molekul (Gambar 2)

(Koolman dan Roehm, 2005).

9|Page
2.3.2 Tahap Kedua

Tahap kedua dalam WB yaitu pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel

transfer. Tahap pemindahan tersebut menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong

transfer protein. Oleh karena itu, proses pemindahan tersebut disebut juga elektrotransfer.

Elektrotransfer dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu (Bollag et al., 1996):

1. Blotting semikering

Blotting semikering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi dengan buffer

transfer. Kertas saring tersebut diletakkan di antara gel poliakrilamid dan gel transfer.

Transfer seperti ini dapat dilakukan selama 10-30 menit dengan arus lstrik tertentu.

10 | P a g e
2. Blotting basah

Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid dan gel

transfer, tetapi kedua gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer.

Susunan lapisan-lapisan pada blotting basah diperlihatkan pada Gambar 3 (Wenk dan

Fernandis, 2007). Transfer dengan blotting basah dapat dilakukan 45 menit hingga 1

malam. Metode blotting basah lebih umum digunakan karena fleksibilitas metode

tersebut yang lebih baik.

Gel transfer yang umum digunakan pada WB ada dua, yaitu nitroselulosa dan

nilon. Pada sebagian besar aplikasi, nitroselulosa lebih umum digunakan karena relatif

tidak mahal dan bloking mudah dan cepat dilakukan. Nilon juga digunakan terutama

pada beberapa keadaan khusus. Pertama, kapasitas pengikatan dengan protein yang

dibutuhkan jauh lebih besar dari kapasitas pengikatan nitroselulosa dan protein. Kedua,

protein terikat sangat lemah pada nitroselulosa. Ketiga, adanya kebutuhan resistensi

terhadap tekanan mekanik (Bollag et al., 1996).

11 | P a g e
Transfer protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer merupakan tahap yang

sangat penting dalam WB. Oleh karena itu, ada beberapa faktor yang harus diperhatikan

dalam proses transfer protein tersebut.

1. Arus listrik yang digunakan harus diperhatikan karena arus yang terlalu tinggi dapat

menghasilkan panas selama transfer yang dapat menimbulkan masalah.

2. Kekuatan ion yang rendah buffer transfer yang rendah dapat digunakan pada

tegangan listrik yang tinggi tanpa perlu dikhawatirkan menghasilkan panas yang tinggi.

3. Salah satu arus listrik yang dapat digunakan adalah 200 mA selama 2 jam.

4. Untuk transfer protein dengan ukuran molekul besar, penggunaan gel dengan

konsentrasi poliakrilamid yang rendah.

2.3.3 Tahap Ketiga

Tahap ketiga merupakan deteksi protein yang telah dipindahkan ke membran

transfer. Deteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen dan antibodi

yang bersifat spesifik. Variasi metode-metode tersebut terutama terletak pada

penggunaan antibodi primer dan sekunder, serta penggunaan molekul penanda.

Berdasarkan penggunaan antibodi primer dan antibodi sekunder, ada dua metode

deteksi, yaitu: metode langsung dan metode tidak langsung. Metode langsung

menggunakan antibodi primer yang telah terkonjugasi dengan molekul marker.

Metode tidak langsung menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder.

12 | P a g e
Antibodi primer berfunsi mengikat protein target, sedangkan antibodi sekunder

berfungsi mengikat antibodi primer dan terkonjugasi dengan molekul penanda.

Molekul penanda yang digunakan juga bervariasi. Molekul penanda yang umum

digunakan diantaranya adalah enzim alkalin fosfatase (AP), enzim horsedish

peroksidase (HRP), immunogold, dan 125I. Masing-masing molekul penanda tersebut

memiliki kelebihan dan kekurangan. Molekul penanda immunogold memiliki


125
sensitifitas paling tinggi, yaitu immunogold (1-25 pg). HRP, AP dan I memiliki

sensitivitas relatif rendah yaitu 10-20 pg, 10-50 pg, dan 50-100 pg (Bollag et al.,

1996).

2.4 Aplikasi dan Manfaat Western Blot

2.4.1 Aplikasi Teknik Western Blot

Teknik western blot telah banyak dikembangkan dalam berbagai penelitian,

salah satunya pada penelitian mengenai spesifitas dan sensitifitas antibodi anti eRF3

ragi Saccharomyces cerevisia. Protein eRF3 (eukaryotic release factor-3)

merupakan salah satu protein yang berperan pada proses terminasi translasi. Protein

ini bersama-sama dengan eRF1 (eukaryotic release factor-1) saling berinteraksi

membentuk kompleks release factor dalam memediasi pelepasan rantai polipeptida

dari ribosom.

Untuk memahami mekanisme terminasi translasi dalam sistem eukariot

dilakukan evaluasi struktur fungsi eRF1 yang dilanjutkan dengan studi in vitro eRF1

mutan dan eRF1 wild type dengan eRF3. Namun demikian hasil deteksi dari studi

interaksi in vitro sulit terdeteksi secara kuantitatif. Untuk dapat mengkuantisasi pita-

pita eRF3 hasil studi interaksi in vitro diperlukan antibodi anti eRF3.

13 | P a g e
2.4.2 Manfaat Western Blot

Adapun manfaat secara umum dari analisis westrern blot antara lain:

1.1 Untuk mengidentifikasi dan memposisikan protein berdasarkan kemampuannya

untuk berikatan dengan antibodi yang spesifik

2.1 Dapat memberikan informasi tentang ukuran dari protein

Berdasarkan penguraian aplikasi teknik western blot , salah satu manfaat yang

telah diperoleh dari analisis western blot ini yaitu konstruksi antibodi anti eRF3

telah dilakukan meskipun antibodi belum terkarakterisasi dengan baik. Sehingga

dilakukanlah analisis western blot dengan cara mengukur tingkat spesifitas dan

sensitifitas antibodi anti eRF3 terhadap protein eRF3. Spesifitas antibodi

ditentukan berdasarkan kemampuan antibodi ini dalam mengenali epitop protein

eRF3 dari berbagai protein yang terdapat pada crude extract ragi, sedangkan

sensitifitasnya ditentukan melalui variasi jumlah antigen (eRF3) yang berinteraksi

dengan antibodi tersebut.

2.4.3 Keuntungan Teknik Blot

a. Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan

lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau

matriks.

b. Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan.

c. Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat

lebih singkat.

14 | P a g e
d. Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum

dianalisis.

e. Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak

metode analisis yang dipakai

15 | P a g e
BAB III

KESIMPULAN

3.1 Kesimpulan

Berdasarkan pembahasan yang sudah diuraikan, maka dapat ditarik beberapa kesimpulan

antara lain:

1. Western blot adalah proses pemindahan hasil protein dari gel hasil elektroforesis ke membran

dan digunakan untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan. Imunoblot menggunakan

elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli.

2. Prinsip kerja western blot adalah yaitu mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang

homogen ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan

antibodi.

3. Langkah kerja dalam analisis western blot dapat dilakukan dalam beberapa tahapan yaitu (1)

tahap elektroforesis, (2) tahap elektrotransfer, dan (3) tahap deteksi.

4. Salah satu aplikasi dari teknik western blot yang dapat dilakukan adalah mengenai spesifitas dan

sensitifitas antibodi anti eRF3 ragi Saccharomyces cerevisia.

5. Adapun manfaat dari western blot secara umum yaitu (1) untuk mengidentifikasi dan

memposisikan protein berdasarkan kemampuannya untuk berikatan dengan antibodi yang

spesifik, (2) dapat memberikan informasi tentang ukuran dari protein.

16 | P a g e
DAFTAR PUSATAKA

Atwood, T.K., P.N. Campbell, J.H. Parish, A.D. Smith, J.L. Stirling dan F. Vella (Ed). 2006.
Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised Edition. Oxford.
University Press.

Bollag, D.M., M.D. Rozycki, S.J. Edelstein. 1996. Protein Method. Wiley-Liss. Inc.

Davidson, 2000. Western Blot Procedure.


http://www.bio.davidson.edu/course/genomics/method/westernblot.html. Diakses pada
tanggal 9 November 2016.

Fatchiyah, dkk. 2011. Biologi Molekular. Jakarta. Erlangga.

Kindt, T.J., R.A.Goldsby, B.A. Osborne, J. Kuby. 2007. Kuby Immunology. W.H. Freeman. New
York.

Koolman, J. dan K. Roehm, 2005. Color Atlas of Biochemistry, Second Edition. Revised and
Enlarged. Thieme.

Rockoff, A. dan G.W. Cole. 2011. Hives (urticaria & angioedema).


http://www.medicinenet.com/hives/article.html. Diakses pada tanggal 9 November 2016.

Wenk, M.R. dan A.Z. Fernandis. 2007. Manuals in Biomedical Research : A Manual For
Biochemistry Protocols. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.

Hermanto, S. 2007. Spesifitas dan Sensitifitas Antibodi Anti eRF3 Ragi Saccharomyces cerevisia
Jurnal Valensi, 1(1), 30-36

Santoso. 2008. Protein dan Enzim. Yogyakarta: Yayasan Farmasi Indonesia.

17 | P a g e