Anda di halaman 1dari 9

PENENTUAN AKTIVITAS ENZIM LIPASE

A. TUJUAN PRAKTIKUM

Mahasiswa dapat melakukan penentuan aktivitas enzim lipase yang terdapat pada
kacang – kacangan

B. WAKTU DAN TEMPAT

Hari / tanggal : kamis / 13 september 2018

Waktu : 07.00 – 09.40 WIB

Tempat : laboratorium biokimia FMIPA UNP

C. DASAR TEORI
Minyak dan lemak tidak mengalami hidrolisis didalam mulut dan lambung manusia,
namun terjadi di dalam usus halus karena usus halus mengandung enzim lipase. Enzim lipase
berfungsi untuk menghidrolisis lemak dan lemak menjadi lipid yang lebih sederhana ( tri, di,
dan mono gliserida ). Agar proses hidrolisis berlangsung sempurna, maka perlu diketahui
kondisi optimum enzim seperti pH , suhu, dan waktu optimum.
Pada percobaan ini akan dipelajari aktifitas enzim lipase pada perubahan waktu
kontak dan suhu terhadap hidrolisis lipid. Aktivitas lipase ini dihitung berdasarkan kemampuan
enzim ini untuk menghidrolisa minyak menjdi asam lemak dan gliserol yang setara dengan
jumlah mmol KOH 0,5 N pada kondisi reaksi tertentu (tim biokimia, 2018 : 11).
Enzim adalah golongan protein yang disintesis oleh sel hidup dan mempunyai fungsi
penting sebagai katalisator dalam setiap reaksi metabolisme yang terjadi pada organisasi
hidup. Enzim juga merupakan biokatalisator yang menunjang berbagai proses industri. Hal ini
disebabkan enzim mempunyai efisiensi dan efektifitas yang tinggi, reaksinya tidak
menimbulkan produk samping, serta dapat digunakan berulangkali dengan teknik amobilisasi
(Lehninger, 1995).
Untuk memproduksi enzim dalam jumlah besar dan mempunyai aktivitas yang tinggi, perlu
diperhatikan faktor-faktor penting seperti kondisi pertumbuhan, cara isolasi, serta jenis
substrat yang digunakan. Kondisi pertumbuhan yang menunjang produksi enzim secara
maksimal adalah pH, suhu inkubasi, waktu inkubasi, dan komposisi media pertumbuhan harus
mengandung sumber energi, sumber karbon, sumber nitrogen dan mineral (Wang, 1979).
Pengunaan enzim dalam bioteknologi modern semakin berkembang secara cepat.
Banyak industri-industri yang telah memanfaatkan kerja enzim, meliputi industri pangan dan
non pangan.
Salah satu jenis enzim yang mempunyai peran penting dan tidak ada bandingan dalam
pertumbuhan bioteknologi adalah enzim lipase. Enzim ini memiliki sifat khusus dapat
memecahkan ikatan ester pada lemak dan gliserol. Selain itu, lipase mempunyai kemampuan
mengkatalis reaksi organik baik didalam media berair maupun dalam media non air (Sumarsih,
2004). Enzim lipase sangat berperan dalam pemisahan asam lemak dan pelarutan noda minyak
pada alat industri agar minyak dapat dilarutkan dalam air. Beberapa reaksi yang dikatalisis oleh
enzim lipase diantaranya adalah reaksi hidrolisis, alkoholisis, esterifikasi,dan interesterifikasi
(Dosanjh dan Kaur, 2002).
Pemanfaatan enzim lipase di dalam industri pangan maupun non pangan semakin
meningkat. Pada industri pangan, lipase banyak digunakan dalam industri susu (hidrolisis
lemak susu), industri roti dan kue (meningkatkan aroma dan memperpanjang umur simpan),
industri bir (meningkatkan aroma dan mempercepat fermentasi), industri bumbu
(meningkatkan kualitas/tekstur), serta pengolahan daging dan ikan (meningkatkan aroma dan
mengubah lemak). Sedangkan pada industri non pangan, lipase digunakan pada industri kimia
dan obat-obatan (transesterifikasi minyak alami), industri oleokimia (hidrolisis lemak/minyak),
industri detergen (melarutkan spot minyak/lemak), industri obat-obatan (mempermudah daya
cerna minyak/lemak dalam pangan), kedokteran (analisis trigliserida dalam darah), industri
kosmetik (mengubah lemak), dan industri kulit (mengubah lemak dalam jaringan lemak).
Pemanfaatan lipase pada industri lemak dan minyak untuk mengubah bentuk fisik dan kimia
minyak dan lemak alami menjadi produk yang bernilai tambah lebih tinggi (sumarsi, 2004).
Lipase diklasifikasikan sebagai enzim hidrolase yang menghidrolisis trigliserida
menjadi asam lemak bebas, gliserida parsial (monogliserida), digliserida dan gliserida (Macrae,
1983). Aplikasi lipase untuk hidrolisis, interesterifikasi dan esterifikasi telah menjadi objek
penelitian, dengan perhatian utama pada aplikasi minyak dan lemak. Lipase dapat digunakan
dengan baik sebagai biokatalis dalam proses biologis (Dosanjh and Kaur, 2002).

Enzim lipase bekerja secara spesifik bagi substrat yang memiliki gugus ester.
Enzim ini mengkatalisis hidrolisis dan sintesis bentuk ester dari gliserol dan asam
lemak rantai panjang. Pada penyiapan sampel dilakukan penambahan asam oleat.
Asam ini berfungsi sebagai emulgator dari substrat karena asam oleat sendiri
memiliki gugus hidrofil dan hidrofob didua muka yang berlainan. Gugus hidrofob ini
akan berikatan dengan asam lemak, sementara gugus hidrofilnya akan berikatan
dengan enzim. Hal ini sesuai dengan sifat enzim lipase yang memang larut dalam air.
Enzim ini juga berperan dalam transfer lipid antar membran. Hal ini dikarenakan
lipase memecah triasilgliserida (molekul yang besar) untuk bisa melewati membran
dalam mitokondria agar bisa dioksidasi lebih lanjut. Sayangnya enzim ini sedikit sulit
untuk diekstraksi dan tidak bekerja pada pH rendah.
Aktivitas enzim ini dapat diukur dengan dua metoda, Pada metoda perubahan pH
tidak memberikan akurasi yang baik, hal ini bisa dilihat dari nilai regresi dan juga
nilai pH yang tidak mengalami penurunan secara bertahap. Metode ini mengukur
langsung jumlah asam lemak yang dihasilkan kedalam larutan lewat perubahan pH.
Jika lipase masih memproduksi asam lemak maka larutan akan segera bertambah
asam. Ketika pH larutan menunjukan nilai konstan pada pH yang makin asam maka
aktifitas lipase dalam memprosuksi asam lemak telah berhenti. Perubahan pH yang
tidak signifikan inilah yang membuat galat pengukuran menjadi besar (mitsuda, 1989).

D. ALAT DAN BAHAN


Alat :
 Erlenmeyer 100 ml 2 buah
 Buret 50 ml lengkap 1 set
 Tabung reaksi 12 buah
 Rak tabung reaksi 1 set
 Water batch 1 set
 Batang pengaduk 1 buah
 Lumpang 1 set
 Gelas kimia 50 ml 1 buah
 Gelas piala 250 ml 1 buah
 Pipet takar 10 ml 1 buah
 Pipet tetes 1 buah
 Penjepit tabung reaksi 1 buah
 Botol semprot 1 buah
 Gelas ukur 25 ml 1 buah

bahan :

 Kacang tanah 50% (B/V)


 Minyak
 sampel jenuh gum arab
 buffer fospat Ph 6,8
 larutan KOH 0,5 N
 indikator phenol ptalein
 reagen biuret
 aquades
E. PROSEDUR KERJA

(ekstraksi crude lipase )

Kacan 50 ml aquades

digerus hingga menjadi pasta

pasta

panaskan dengan menggunakan pelarut air

pasta encer di sentrifuse pada 300 rpm selama 20 menit

cream

air

residu

dibuang

uji dengan rwagen biuret

(pembuatan emulsi minyak)

37,5 gum arab 37,5 minyak

75 mlaquades

(Blender kurang lebih 15 menit )

(penentuan aktifitas enzim lipase terhadap waktu)

Sediakan 12 gelas kimia (masing- masing beri label)

Tambahkan kedalam masing- masing tabung sesuai skema berikut

5 ml buffer posfat ph 6,8

5 ml enzim amilase 5 ml emulsi minyak


Tabung Prosedur
Inkubasikan 370C Dipanaskan suhu 1000C
(menit) (menit)

1 a, b 5 -
2 a, b 10 -
3 a, b 15 -
4 a, b 20 -
5 a, b 25 -
6 a, b - 15
Titrasi dengan KOH 0,5 N dengan indikator pp
F. TABEL PENGAMATAN
Tabung Waktu inkubasi (menit) Volume KOH (ml)
1a 5 0,7
1b 5 0,4
2a 10 0,8
2b 10 0,7
3a 15 0,9
3b 15 1
4a 20 1
4b 20 1,1
5a 25 1,1
5b 25 1,1
6a 15 1,2
6b 15 1,4

G. PERHITUNGAN
1. Tabung 1 5. Tabung
V KOH = o,7 ml + 0,4 ml / 2 V KOH = 1,1 ml + 1,1 ml / 2
= 0,55 ml = 1, 1 ml
Mmol KOH = 0,5 M x 0,55 ML mmol KOH = 0,5 M x 1,1 ml
= 0,275 mmol = 0,55 mmol
2. Tabung 2 6. Tabung 6
V KOH = 0,8 ml + 0,7 ml/ 2 V KOH = 1,2 ml + 1,4 ml / 2
= 0,75 ml = 1,3 ml
Mmol KOH = 0,5 M x 0,75ml mmol KOH = 0,5 M x 1,3
= 0,375 mmol = 0,65 mmol
3. Tabung 3
V KOH = 0,9 ml + 1 ml/ 2
= 0,95 ml
Mmol KOH = 0,5 M x 0,95ml
= 0,475 mmol
4. Tabung 4
V KOH = 1 ml + 1,1 ml/ 2
= 1, 05 ml
Mmol KOH = 0,5 M x 1,05ml
= 0,525 mmol

H. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, percobaan yang dilakukan tentang penentuan aktivitas
enzim lipase. Dimana percobaan ini bertujuan untuk melakukan penentuan aktivitas enzim
lipase yang terdapat pada kacang- kacangan.
Pada percobaan pertama hal yang dilakukan yaitu ekstraksi crude lipase. Bahan yang
digunakan adalah kacang tanah, dari kacang tanah inilah enzim lipase dihasilkan. Dimana
kacang tanah dihaluskan dan ditambahkan air hingga berbentuk pasta. Pasta kacang ini
kemudian disentrifuge untuk memisahkan komponennya. Setelah disentrifuge terdapat 3
lapisan pada pasta tadi, dimana lapisan paling atas yang berupa cream adalah enzim lipasenya,
lapisan kedua adalah air, dan lapisan ketiga adalah residu. Ketiga lapisan ini dipisahkan dengan
pipet tetes. Residu yang telah dipisahkan di uji dengan reagen biuret untuk melihat apakah
masih terdapat enzim lipase dalam kacang tersebut. Uji positif dari dari residu yang
ditambahkan reagen biuret ini adalah warna ungu. Setelah ditambahkan reagen biuret, residu
yang tadi berwarna putih menjadi warnah hijau lumut. Hal ini menunjukkan hasil negatif,
artinya pada kacang tanah berhasil disentrifuge.
Selanjutnya dilakukan pembuatan emulsi minyak. Bahan yang digunakan adalah
minyak yang ditambahkan gum arab dan air. Emulsi minyak ini akan digunakan untuk
pengujian aktivitas enzim lipase, dimana miyak akan dihidrolisis menjadi asam lemak dan
gliserol. Penambahan gum arab berfungsi sebagai pengemulsi minyak.
Setelah enzim lipase dan emulsi minyak disiapkan, barulah kita mulai melakukan
pengujian aktivitas enzim lipase terhadap waktu. 5 ml emulsi minyak ditambahkan buffet
fospat ph 6,8 kemudian diinkubasi pada suhu 370C. Penambahan buffer fospat bertujuan untuk
mempertahankan kondisi enzim agar nantinya tidak terjadi perubahan ph dan mencegah
terjadinya denaturasi atau inakativasi enzim. Selain itu inkubasi dilakukan pada suhu 370C
karena enzim bekerja optimal pada suhu tersebut. Waktu inkubasi juga difariasikan yaitu 5
menit, 10 menit, 15 menit, 20 menit dan 25 menit. Variasi waktu ini bertujuan agar kita dapat
melihat perbedaan aktivasi enzimnya.
Setelah dilakukan pengujian inkubasi pada suhu 370C dengan waktu yang berbeda,
juga dilakukan pemanasan enzim lipase yang telah ditambahkan emulsi minyak dan buffer
fospat pada suhu 1000C. Dari pengujian ini kita dapat melihat pengaruh suhu pada aktivitas
enzim lipase. Tabung yang telah ditambahkan enzim lipase dan diinkubasi dengan variasi
waktu berbeda kemudian di titrasi dengan KOH 0,5 N yang terlebih dahulu ditambahkan
indikator pp. Hal yang sama dilakukan juga pada tabung yang dipanaskan pada suhu 1000C.
Indikator pp berguna agar kita dapat melihat perubahan warna hingga tercapainya titik akhir
titrasi. KOH (Dalam ml) yang dibutuhkan pada enzim lipase yang telah diinkubasi selama 5, 10,
15, 20 dan 25 menit berturut turut yaitu 0,55 ml; 0,75 ml; 0,95 ml; 1,05 ml; 1,1 ml ; 1,3 ml.
Sedangkan pada enzim lipase yang dipanaskan hingga 1000C KOH yang dibutuhkan sebanyak.
Dari volume KOH yang terpakai ini dapat ditentukan mol KOH dari aktivitas enzim
lipase, dimana jumlah mol KOH sama dengan aktivitas enzim lipase. Dari hasil perhitungan
didapatkan aktivitasenzim lipase selama 5, 10, 15, 20, dan 25 menit berturut- turut adalah
0,275 :0,375 ; 0,475 ; 0,525 dn 0, 55. Sedangkan pada suhu 1000C aktivitas enzim lipase yaitu 0,
65. Dari data tersebut didapatkan bahwa aktivitas enzim lipase terus meningkat hingga waktu
mencapai 20 menit, aktivitas enzim berlangsung konstan hingga waktu 25 menit. Ini artinya
pada waktu tersebut aktivitas enzim bekerja maksimum. Hal ini sesuai dengan teori karena
pada suhu 1000C aktivitas enzim lipase menurun karena enzim mengalami denaturasi protein
yang dapat merubah konformasi struktur molekul hingga enzim kehilangan sifat alamianya
karena enzim bekerja di atas suhu optimumnya.

I. JAWABAN PERTANYAAN
1. Pada percobaan ini, apa yang merupakan substrat? Jelaskan jawaban anda!
Jawab : yang merupakan substrat adalah minyak. Karena pada percobaan ini kita
menguji aktivitas enzim lipase, dimana enzim lipase akan menghidrolisis minyak menjadi
asam lemak dan gliserol
2. Jelaskan grafik yang diperoleh dari hasil percobaan!
3. Apa guna penambahan buffer fospt 6,8 pda percobaan ini
Jawab : untuk mempertahankan kondisi enzim agar tidak terjadi perubahan ph dan
mencegah terjadinya denaturasi atau inaktivasi enzim.
4. Apa guna indikator pp
Jawab : untuk melihat perubahan warna pada saat titrasi dan untuk menentukan titik
akhir titrasi yang ditandai dengan munculnya warna pink.

J. KESIMPULAN
1. Dalam percobaan ini salah satu faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah suhu
dan waktu inkubasi
2. Aktivitas enzim lipase pada suhu 370C terus meningkat hingga waktu ingkubasi 20 menit
sampai 25 menit yang berlangsung konstan.

DAFTAR PUSTAKA
Dosanjh, N.S., dan Kaur, J. 2002. Immobilization, Stability and esterification Studies of A Lipase From
Bacillus sp. Journal Biotechnology and Applied Biochemistry. Vol. 36. Hlm 7-12. Punjab University.
Chandigarh.

Lehninger, A.L. 1995. Dasar-dasar Biokimia I. Erlangga. Jakarta.

S. Mitsuda, S. Nabeshima, H. Hirhora, Appl. Microbiol. Biotechnol.1989, 31, 334 ±


337.

Sumarsih, S. 2002. Uji Aktivitas Lipolitik Beberapa Bakteri Hasil Isolasi dari Pelabuhan Tanjung Perak
dan Produksi Lipase dari Strain Terpilih. JIPTUNAIR. Surabaya.

Tim biokimia. 2018. Penuntun Praktikum Biokimia. Padang : FMIPA UNP

Wang, I.C. 1979. Fermentation and Enzymes Technology. John Wiley and Sons. New York.