INSTITUTO DE EDUCACIÓN SUPERIOR TECNOLÓGICO

PÚBLICO “TRUJILLO”

LABORATORIO CLÍNICO IV

MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOLÓGICO II

PROFESOR:

BLGO. MBLGO. FREDDY VALLEJO LEÓN

ALUMNO (A): ERNESTO URQUIZO GOMEZ

TEMA:

“VÍAS DE INOCULACIÓN EN HUEVOS EMBRIONADOS

TRUJILLO – PERÚ
2018
I. INTRODUCCIÓN:

Los virus (en latín, ‘veneno’) son entidades orgánicas compuestas tan sólo de material
genético, rodeado por una envuelta o envoltura protectora. El término virus se utilizó en
la última década del siglo XIX para describir a los agentes causantes de enfermedades
más pequeños que las bacterias. Carecen de vida independiente, pero se pueden replicar
en el interior de las células vivas, perjudicando en muchos casos a su huésped en este
proceso. Los cientos de virus conocidos son causa de muchas enfermedades distintas en
los seres humanos, animales, bacterias y plantas (Encarta, 2003).
Los virus se pueden aislar e identificar durante el curso clínico de una enfermedad,
estableciéndose en esta forma el diagnóstico causativo. Si embargo, por lo general, el
diagnóstico específico no se puede hacer en los primeros días subsiguientes a la
infección; el resultado de muchas de las pruebas diagnósticas para las enfermedades
virales no se obtiene hasta que el paciente se ha recuperado o ha muerto (Pelczar y Reid,
1982).
Los procedimientos de laboratorio empleados en el diagnóstico de las enfermedades
virales en los seres humanos, incluyen los siguientes (Ingraham y cols., 1998):
 Aislamiento e identificación del agente.
 Medición del incremento de la cantidad de anticuerpos durante el curso de la
infección.
 Examen histológico de los tejidos infectados.
 Demostración de antígenos virales en las lesiones, por el uso de anticuerpos
marcados con fluoresceína o peroxidasa.
 Exámenes en el microscopio electrónico de los líquidos de las vesículas o de
extractos de tejidos tratados con colorantes especiales.
Los virus también se pueden estudiar en animales de experimentación, desarrollo en
cultivos celulares y los huevos embrionados. Los huevos con embrión pueden ser
inoculados por varias vías. Después de la inoculación, los huevos se reincuban varios días
a 36 – 38 ºC y se examinan diariamente. La vías de inoculación son la membrana
corioalantoidea, en el saco vitelino, en el saco alantoideo y saco amniótico en donde se
observa el efecto del virus (Tortora, 1997; Jawtez y cols.; 1981).
Entre los lugares de inoculación tenemos:
 Membrana Corioalantoidea: Se emplean embriones de 10 – 12 días y la
cantidad de inóculo es de 0,1 – 0,5 mL. Apropiada especialmente para el
aislamiento y cultivo de virus variolicos; virus de laringotraqueitis aviar y de la
enfermedad de Beyer (Pseudorrabia); que provocan focos o pústulas fácilmente
visibles.
 Cavidad Alantoidea: Se emplean embriones de 9 – 12 días y la cantidad de
inoculo es de 0,1 – 0,2 mL. Entre los virus que desarrollan en el endodermo
alantoideo tenemos: peste, New Castle, virus de la bronquitisinfecciosa,
encefalitis equina occidental y oriental Venezuela, parotiditis. Ventaja:
simplicidad de la inoculación y toma de muestra
 Cavidad Amniótica: Se emplean embriones de 7 – 15 días y la cantidad de
inoculo es de 0,1 – 0,2 mL. La edad de los mismos depende fundamentalmente
del tipo de virus o del estudio que se realiza.
 Saco Vitelino: Se emplean embriones de 5 – 8 días de incubación y la cantidad
de inoculo es de 0,2 – 1 mL. Vía es sumamente adecuada para el aislamiento y
cultivo de los virus de enfermedades venéreas, neumonía y rickettsias. El vitelo
 es empleado para la preparación de vacunas y como antígeno para reacciones
serológicas de los virus ya mencionados.
 Vía Intravenosa: La membrana corialantoidea está irrigada por vasos
sanguíneos, es susceptible de inoculación para casos especiales, virus que
ocasionan cambios hematológicos; por ejemplo, virus de la Leucemia. Son
empleados embriones de 10 - 15 días y la cantidad de inoculo es de 0,02 -0,05
mL.
 Vía Intracerebral (embrión): Se emplea embriones de 8 – 14 días,
específicamente para virus que producen alteraciones cerebrales: la rabia,
herpes, etc.; 0.01 – 0.02 ml
Los objetivos de la presente práctica son:
1. Conocer las vías de inoculación de virus en huevos embrionados.
2. Realizar una inoculación de una suspensión en una cavidad en un huevo
embrionado.
II. MATERIAL Y MÉTODOS:

2.1. Materiales:
2.1.1. Material biológico:
  Embriones de pollo de 5 a 8 días de incubación.
 Embriones de pollo de 9 a 11 días de incubación.
 Embriones de pollo de 10 a 12 días de incubación.
2.1.2. Material de laboratorio:
  Jeringas de tuberculina de 1mL.
 Agujas Nº 22 de 1 pulgada.
 Agujas Nº 22 de 1 ½ pulgada.
 Agujas Nº 26 de ½ pulgada.
 Tubos de 13 x 100 mm.
 Punzón.
 Taladro.
 Bulbo de goma.
 Aplicadores.
 Parafina fundida o cinta adhesiva.
 Lápiz marcador.
 Porta huevos.
 Ovoscopio.
 Mechero.
 Gradilla para tubos.
 Placas Petri.
2.1.3. Reactivos:
 Solución buffer fosfato (PBS).
 Tintura de iodo.
2.1.4. Equipos de laboratorio:
 Centrífuga.

2.2. Procedimiento:
2.2.1. Experimento Nº 01: Inoculación en la cavidad alantoidea:
 Método Nº 1:
 Con ayuda del ovoscopio:
- Verificar la viabilidad del embrión de 9 a 11 días de incubación.
- Ubicar la cámara de aire y marcar con lápiz un aspa en el centro
de ella (la cámara de aire se encuentra en le lado romo del
huevo).
- Manteniendo el huevo en posición vertical, con la cámara de
aire hacia arriba, localizar al embrión. La presencia de grandes
vasos sanguíneos y una zona oscura indican la posición del
embrión.
- Seleccionar una zona que esté libre de grandes vasos sanguíneos
y aproximadamente a 3 mm de la base de la cámara de aire
marcar un aspa, la cual constituirá el punto de inoculación.
 Desinfectar las zonas marcadas, frotando con un aplicador
embebido con tintura de yodo y dejar secar. El área desinfectada
debe ser aproximadamente de 2 cm de diámetro.
 Con un punzón desinfectado con tintura de iodo, perforar
cuidadosamente el cascarón en el centro de cada aspa.
 Utilizando una jeringa de tuberculina de 1 mL, con aguja Nº 26 de
½ pulgada, introducir la aguja a través del orificio en el lado lateral
del huevo hasta una profundidad de aproximadamente ¼ de pulgada
(0,6 cm) e inyectar 0,1 a 0,2 mL del inóculo (PBS). Concluida la
inoculación, sacar la aguja y colocar la jeringa dentro de un tubo
estéril.
  Sellar los orificios con parafina fundida o cinta adhesiva. En primer
lugar el orificio donde se hizo la inoculación.

 Método Nº 2:
 Con ayuda del ovoscopio:
- Verificar la viabilidad del embrión de 9 a 11 días de
incubación.
- Ubicar la cámara de aire y marcar con lápiz un aspa en el
centro de ella.
 Desinfectar la zona marcada frotando un aplicador embebido de
tintura de yodo y dejar secar. El área desinfectada debe ser de
aproximadamente 2 cm de diámetro.
 Con un punzón desinfectado con tintura de iodo, perforar
cuidadosamente el cascarón en el centro del aspa.
 Utilizando una jeringa de tuberculina de 1 mL, con aguja Nº 22 de 1
pulgada, introducir la aguja perpendicularmente a través del orifico
hasta una profundidad de 5/8 de pulgada (1,6 cm) e inyectar 0,1 a
0,2 mL del inóculo (PBS). Concluida la inoculación, sacar la aguja
y colocar la jeringa dentro de un tubo estéril.
 Sellar el orificio con parafina fundida o cinta adhesiva.
2.2.2. Experimento Nº 02: Cavidad Amniótica
 Con ayuda del ovoscopio:
- Verificar la viabilidad del embrión de 9 a 11 días de
incubación.
- Ubicar la cámara de aire y marcar con lápiz un aspa en el
centro de ella.
- Localizar el embrión determinando su posición exacta (girar el
huevo, extremo romo hacia arriba, hasta que los grandes vasos
sanguíneos y una sombra oscura, indiquen la posición del
embrión).
- Marcar un aspa en la zona de la cámara de aire que está
directamente por encima del embrión.
 Desinfectar la zona marcada frotando un aplicador embebido de
tintura de yodo y dejar secar. El área desinfectada debe ser de
aproximadamente 2 cm de diámetro.
 Con un punzón desinfectado con tintura de iodo, perforar
cuidadosamente el cascarón en el centro del aspa.
 Manteniendo el huevo en el ovoscopio. Con una jeringa de
tuberculina de 1 mL, con aguja Nº 22 de 1 ½ pulgada, introducir la
 aguja
a

través del orifico y en dirección al embrión hasta una profundidad

de 5/8 de pulgada (1,6 cm). Inyectar 0,1 mL del inóculo (PBS).
Concluida la inoculación, sacar la aguja y colocar la jeringa dentro
de un tubo estéril.
 Sellar el orificio con parafina fundida o cinta adhesiva.

2.2.3. Experimento Nº 03: Saco Vitelino

 Con ayuda del ovoscopio:
- Verificar la viabilidad del embrión de 5 a 8 días de incubación.
- Ubicar la cámara de aire y marcar con lápiz un aspa en el
centro de ella.
 Desinfectar la zona marcada frotando un aplicador embebido de
tintura de yodo y dejar secar. El área desinfectada debe ser de
aproximadamente 2 cm de diámetro.
 Con un punzón desinfectado con tintura de iodo, perforar
cuidadosamente el cascarón en el centro del aspa.
  Utilizando una jeringa de tuberculina de 1 mL, con aguja Nº 22 de 1
½ pulgada, introducir la aguja perpendicularmente a través del
orifico hasta una profundidad de 1 pulgada (2,54 cm) e inyectar 0,2
a 1 mL del inóculo (PBS). Concluida la inoculación, sacar la aguja y
colocar la jeringa dentro de un tubo estéril.
 Sellar el orificio con parafina fundida o cinta adhesiva.

2.2.4. Experimento Nº 04: Membrana Corioalantoidea:

 Con ayuda del ovoscopio:
- Verificar la viabilidad del embrión de 10 a 12 días de
incubación.
- Ubicar la cámara de aire y marcar con lápiz un aspa en el
centro de ella.
- Localizar el embrión determinando su posición exacta.
- Colocando el huevo horizontalmente con el embrión hacia
arriba, marcar un aspa en una zona equidistante de ambos
polos y que esté libre de vasos sanguíneos.
 Desinfectar la zona marcada frotando un aplicador embebido de
tintura de yodo y dejar secar. El área desinfectada debe ser de
aproximadamente 2 cm de diámetro.
 Con un punzón desinfectado con tintura de iodo, perforar
cuidadosamente el cascarón en el centro del aspa de la cámara de
aire, perforando también la membrana del cascarón.
 Con el taladro, raspar suavemente en e centro del aspa del lado
lateral del huevo, a fin de perforar solamente el cascarón y no la
membrana de l cascarón.
 En ambas zonas marcadas no perforar la membrana corioalantoidea.
 Colocar el huevo con el orificio lateral hacia arriba.
 Colocar 1 a 2 gotas de PBS estéril sobre este orificio.
 Raspar suavemente la membrana del cascarón con una aguja Nº 26
acoplada a una jeringa vacía. Dejar que el PBS se ponga en contacto
con la membrana corioalantoidea. Esto permitirá el desprendimiento
de la membrana corioalantoidea de la membrana del cascarón.
 Con un bulbo de jebe aplicado al lado robo del huevo, sobre a
cámara de aire, hacer un ligero vacío, succionando l aire
suavemente. Esto permite el desprendimiento de la membrana
corioalantoidea alrededor del orificio lateral, creando una cámara de
aire artificial (este paso puede realizarse en el ovoscopio).
 verificar al ovoscopio la “cámara de aire artificial”.
 Sellar con parafina o cinta adhesiva el orificio del lado romo del
huevo.
 Utilizando una jeringa de tuberculina de 1 mL, con aguja Nº 26 de
½ pulgada, inocular 0,1 mL del inóculo (PBS).
 Girar suavemente el huevo para asegurar una distribución uniforme
del inoculo.
 Sellar el orificio por donde se hizo la inoculación con parafina
fundida o cinta adhesiva.
III. RESULTADOS:

Bueno me toco inocular en el membrana Corioalantoidea

Se marco con el lápiz la saco vitelino en centro y se hizo un hueco

Luego marcamos Hacemos una bolsa de arie falsa

IV. DISCUSIÓN:
V. CONCLUSIONES:
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

 CASTAÑEDA y cols. 1991. Manual de Virología. Universidad Nacional de

Trujillo. Departamento de Microbiología y Parasitología. Trujillo. Perú.

 INGRAHAM, J. y cols. 1998. “Introducción a la Microbiología”. Tomo I. Edit.

Reverté, S.A. Barcelona. España.

 JAWETZ, E. y cols. 1981. “Microbiología Médica”. 9º edición. Edit. El Ateneo.

Buenos Aires. Argentina.

 PELZCLAR, M. y R., REID. 1982. “Microbiología General”. 4º edición. Edit. El

Ateneo. Buenos Aires. Argentina. Págs. 6-25.

 TORTORA, G. y cols. 1993. “Introducción a la Microbiología”. 3º edición. Edit.

Acribia. Zaragoza. España.
VII.CUESTIONARIO:

1. ¿Cuáles son los métodos que se emplean para estudiar los virus?

Huevos embrionados , células , ratones

2. ¿Qué efectos producen los virus en los huevos embrionados?

Lesiones en el huevo , pústulas en la cavidad , muerte del embrión
3. ¿Para qué se emplean los huevos embrionados en el estudio de los virus?
Para ver que efectos hace el virus donde se inoculo
4. ¿Por qué varían los días en los huevos embrionados para realizar inoculaciones de
suspensiones virales?

5. ¿Por qué las pruebas inmunológicas son los métodos más estudiados en las
infecciones virales?

6. ¿Se pueden utilizar toros tipos de huevos embrionados además de los de gallina?

7. ¿Qué método de cultivo es el ideal para virus humanos?

Cultivo de células y en enbrionados
8. ¿Se pueden emplear microscopios ópticos para ver los virus, fundamente su
respuesta?
No porque su resolución es bajo y solo emite luz normal solo llega a observar
bacterias , células , levaduras
9. ¿Qué es un virión, fago, profago, provirus y prión?

10. ¿Qué es la solución de buffer fosfato y cuál es su composición?