Hidrogel biologis dirakit sendiri melalui pasangan basa Watson-Crick dari timin dan adenin

dari poli (etilen glikol) yang difungsikan. Pekerjaan kami harus memberikan metodologi baru
untuk menghasilkan perancah suntik yang kuat dengan sifat yang dapat disesuaikan untuk
aplikasi biomedis.

Hidrogel biodegradable telah berfungsi sebagai perancah sel fungsional untuk rekayasa
jaringan dan dalam pengiriman pertumbuhan sel faktor (GFs) .1 Secara konvensional,
hidrogel biodegradable telah disintesis dengan metode pengikatan silang kimia menggunakan
agen pengikat silang, photopolymerization, klik kimia dan konjugasi kovalen.2 Sementara
fleksibilitas dari crosslinking telah dieksploitasi secara luas, hidrogel kimia dibatasi oleh
modifikasi ireversibel dan agregasi protein yang terperangkap dan toksisitas potensial dari
moieties kimia reaktif. Masalah utama dalam penggunaan hidrogel dan prosedur rekonstruksi
jaringan pada umumnya adalah pembentukan lingkungan biomimik ke dalam jaringan
direkayasa diperlukan untuk kelangsungan hidup rekayasa jaringan.3 Tujuannya adalah
sintesis hidrogel biologis melalui perakitan sendiri yang mungkin karena itu memungkinkan
manipulasi sifat induktif untuk proliferasi sel. Baru-baru ini, konjugasi self-assembly dalam
bahan polimer telah menjadi semakin menonjol di produksi permukaan bioaktif dan matriks.4
Berbagai metode perakitan mandiri telah dilaporkan untuk konjugasi peptida, protein, DNA,
oligonukleotida dan nanopartikel, yang didasarkan pada interaksi elektrostatik, kompleks
inklusi, interaksi ionik, interaksi hidrofobik, ikatan hidrogen, kristalinitas dan interaksi
afinitas.

Di sini, kami menyajikan cara yang fleksibel untuk merakit sendiri hidrogel polimerik
melalui pasangan spesifik nukleobase yang berfungsi. Self-assembly biologis dari sistem
hidrogel poli (etilena glikol) (PEG) dibentuk oleh pasangan basa Watson-Crick antara timin
(T) dan adenin (A) melalui ikatan hidrogen (Gambar 1). Dibandingkan dengan PEG linear,
PEG berbentuk bintang multi-lengan memiliki kecenderungan untuk menginduksi
pembentukan kompleks stereo, yang menunjukkan janji dalam sistem hidrogel yang relevan
secara biomassa.6 PEG empat lengan di sini dipilih untuk perakitan mandiri, bukan PEG
linear dalam penelitian ini.

Pertama, thiol thymine (T-SH) dan thiol adenine (A-SH) disintesis. Maleimide dihentikan
PEG empat lengan (PEG-Mal) difungsikan dengan baik T-SH atau A-SH fungsionalitas
sebagai prekursor self-assembly(disebut sebagai PEG-T dan PEG-A) melalui penambahan
tipe-Michael (Gambar 1a dan b). Setelah pembubaran dan pencampuran prekursor dalam
lingkungan berair, jaringan hidrogel stereo-PEG dirakit sendiri karena pembentukan
pasangan kompleks (Gambar 1c).

Penyimpanan moduli G0 dari hidrogel yang dirakit sendiri (PEG 20 kDa, 20% berat)
dimonitor sebagai fungsi rasio molar dari PEG-T / PEG-A pada 37 1C dalam PBS (Gambar.
2a). Ketika PEG-T / PEG-A dicampur dengan rasio molar yang berbeda, modul penyimpanan
diukur antara 63 dan 600 Pa. Hasil menunjukkan bahwa penyimpanan modulus dari Hidrogel
5/5 dengan jumlah setara PEG-T / PEG-A adalah yang tertinggi (599,4 Pa), yang
menunjukkan G0 secara signifikan lebih tinggi daripada yang lain (p 0,05). Kurang PEG-T
atau PEG-A dalam campuran dapat menurunkan jumlah unit ligan yang tersedia untuk ikatan
hidrogen, yang mengarah ke jaringan yang tidak sempurna dan modulus penyimpanan yang
lebih rendah.

Gambar

Gambar. 1 (a, b) Empat lengan poli (ethylene glycol) -maleimide (PEG-Mal) difungsikan
dengan thiol thymine (T-SH) dan thiol adenine (A-SH),masing-masing, sebagai prekursor
self-assembly melalui penambahan Michael-type. (c) Skema penyatuan diri secara biologis
dari jaringan hidrogel PEG empat lengan ideal melalui ikatan hidrogen intermolekular dari
pasangan basa Watson – Crick antara fungsi timin dan adenin.

Gambar
Gbr. 2 (a) Modulus penyimpanan hidrogel yang dirakit sendiri sebagai fungsi rasio molar
PEG-T / PEG-A. (B) Penyimpanan modulus hidrogel dirakit sendiri dengan berat molekul
dan konsentrasi yang berbeda. (c) Karakterisasi reologi jaringan hidrogel yang dirakit sendiri.
Gambar inset menggambarkan hidrogel PEG-20K / 20K yang terbentuk dalam PBS.(d) Sifat-
sifat reologi hidrogel yang dirakit sendiri sebagai suatu fungsi suhu.

Dua berat molekul yang berbeda (10 dan 20 kDa) dari PEG fourarm dipelajari untuk self-
assembly dalam larutan berair pada 37 1C (Gambar 2b). Tiga hidrogel rakitan mandiri yang
terdiri dari PEG-T / PEG-A dengan berat molekul 10 atau 20 kDa, mis. PEG-10K / 10K,
PEG-10K / 20K dan PEG-20K / 20K disiapkan. Hidrogel PEG-20K / 20K menunjukkan
penyimpanan tertinggi

modulus, diikuti oleh hidrogel PEG-10K / 20K dan PEG-10K / 10K. Gambar 2b juga
menunjukkan bahwa G0 meningkat secara signifikan dengan meningkatkan konsentrasi
polimer dari 10 hingga 20wt /% berat. Ini menunjukkan bahwa konsentrasi polimer yang
lebih tinggi menciptakan kepadatan cross-link yang lebih efektif dan karena itu mengarah ke
jaringan yang lebih ketat. Karena PEG-20K / 20K (20 wt /% berat) mengandung lebih banyak
rantai polimer dan memberikan modulus penyimpanan terkuat, konsentrasi 20% berat / berat
dan berat molekul 20 kDa digunakan untuk studi selanjutnya, dan diskusi lebih lanjut hanya
mengacu pada hidrogel ini.

Percobaan rheologi menyapu waktu dinamis dilakukan untuk memantau evolusi jaringan dan
mengevaluasi perilaku viskoelastis dari hidrogel (Gambar 2c). Setelah pencampuran larutan
PEG-T dan PEG-A homogen (20% berat / berat) pada 371C, modulus penyimpanan G0
meningkat secara signifikan dan lebih besar dari hilangnya modulus G00 setelah 150 s. Data
menunjukkan modulus penyimpanan akhir G0 nilai B600 Pa setelah 500 s, lebih dari
hilangnya modulus G00 (o), yang menghasilkan hidrogel dengan sifat viskoelastis khas. Inset
pada Gambar. 2c mengilustrasikan hidrogel viskoelastik setelah self-assembly di PBS.
Gambar 2d menunjukkan karakteristik reologi hidrogel yang tergantung pada suhu. Dengan
meningkatnya suhu G0 secara bertahap menurun, yang dikaitkan dengan penurunan G00.
Pada pemanasan hidrogel dengan G0 4 G00, transisi dari gel-ke-sol terjadi pada 72 1C,
transisi gelnya suhu. Di atas 72 1C, G00 mulai melebihi G0, menunjukkan bahwa campuran
berperilaku sebagai cairan kental yang lemah.

Seperti ditunjukkan pada Gambar. 3a, suhu inkubasi memiliki pengaruh yang signifikan
terhadap penurunan berat badan hidrogel yang dirakit sendiri di PBS. Pada suhu yang lebih
rendah, hidrogel menunjukkan tingkat penurunan berat badan lebih lambat daripada suhu
yang lebih tinggi. Pada 50 1C, hidrogel menunjukkan penurunan berat badan secara
signifikan lebih cepat, karena penghancuran ikatan hidrogen, dan benar-benar larut dalam 9
hari. Dibandingkan dengan hasil pada 50 1C, hidrogel kehilangan berat badan terus hingga 18
dan 24 hari pada 37 dan 20 1C, masing-masing. Kinetika pembengkakan hidrogel juga
diselidiki dalam PBS pada suhu yang berbeda sebagai fungsi waktu inkubasi (Gambar 3b).
Hidrogel pada suhu yang lebih rendah menunjukkan rasio pembengkakan yang lebih rendah
daripada suhu yang lebih tinggi, yang konsisten dengan data penurunan berat badan yang
ditunjukkan pada Gambar. 3a. Dibandingkan dengan data 20 dan 37 1C, rasio pembengkakan
hidrogel meningkat secara signifikan setelah 24 jam inkubasi pada 50 1C. Pada 37 1C, rasio
pembengkakan hidrogel meningkat secara signifikan dari 17,3 menjadi 26,8 setelah inkubasi
selama 14 hari.

GFs yang menginduksi proliferasi sel induk yang berasal dari adiposa (ASC) termasuk
insulin, deksametason (Dex) dan vascular faktor pertumbuhan endotel (VEGF) .7 Gambar. 3c
menunjukkan konsentrasi awal insulin, deksametason dan VEGF terperangkap di dalam
hidrogel. Hidrogel menunjukkan pemuatan VEGF dengan efisiensi tertinggi, dan sekitar 96%
VEGF dapat terperangkap di dalam hidrogel, tetapi tidak ada perbedaan yang signifikan
dibandingkan dengan deksametason dan insulin (p 4 0,05). Jumlah kumulatif in vitro GF
yang dilepaskan dari hidrogel pada titik waktu tertentu dikuantifikasi. Seperti yang diamati
pada Gambar. 3d, GFs diinkubasi di PBS menunjukkan pelepasan kumulatif total sekitar 68-
89% selama periode 14 hari, dengan pelepasan total dalam 18-20 hari. Pelepasan
dexamethasone menunjukkan tingkat signifikan lebih cepat daripada insulin dan VEGF (p
0,05).

Gambar
Gambar. 3 (a) Degradasi hidrogel pada temperatur yang berbeda di PBS. (b) Pembengkakan
kinetika hidrogel pada temperatur yang berbeda. (c) GFS yang terpakai dalam hidrogel di
PBS. (D) profil rilis kumulatif GFs dari hidrogel.

Gambar
Gbr. 4 (a) Jumlah ASC yang terlampau ke permukaan hidrogel. (B) Proliferasi ASCs
dibiakkan dalam hidrogel. (c, d) Laser confocalscanning microscopy (CLSM) dan gambar
SEM ASC pada hidrogel setelah 7 hari inkubasi. (E, f) CLSM dan SEM gambar untuk
menunjukkan ASCs berbudaya di hidrogel setelah 7 hari inkubasi.

Adhesi ASC ke permukaan atas kontrol dan GFs menyerap hidrogel setelah kultur selama 24
jam ditandai (Gambar 4a). Semua sampel hidrogel menunjukkan sedikit kurang sel yang
melekat daripada pelat kultur jaringan kontrol (TCP). Nomor sel pada permukaan hidrogel
yang terperangkap GF lebih besar dibandingkan dengan kontrol hidrogel, tetapi tidak ada
perbedaan signifikan yang ditemukan (p 4 0,05). Proliferasi ASCs di hadapan hidrogel
biologis dimonitor dari waktu ke waktu melalui konten DNA. Seperti yang ditunjukkan pada
Gambar. 4b, semua hidrogel menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam proliferasi sel
in vitro setelah 7 hari inkubasi (p0 0,05), sedangkan hidrogel bermuatan insulin menunjukkan
peningkatan yang signifikan dalam proliferasi sel di atas hidrogel kontrol (p 0,05).

Gambar mikroskopi confocal menggambarkan overlaid pewarnaan neon hidup / mati dari
adhesi ASC setelah 7 hari inkubasi. Sel-sel yang terlampir hadir di superficial daerah hidrogel
biologis dan mempertahankan morfologi poligonal mereka dengan ukuran B20 mm (Gambar
4c), yang konsisten dengan pengamatan SEM ditunjukkan pada Gambar. 4d. Sel-sel yang
dikemas dalam hidrogel untuk budaya 3D juga diamati. Sel yang layak diamati setelah 7 hari
kultur (Gambar 4e), dan lebih dari 98% dari ASCs selamat. Sel berbentuk bulat atau bundar
terdistribusi merata di hidrogel, yang merupakan indikator retensi fenotipe ASC dan sangat
penting untuk pembentukan matriks. Suatu gambar SEM dari hidrogel yang dienkapsulasi
dengan ASCs ditunjukkan pada Gambar. 4f. Sel-sel diringkas dalam hidrogel dan memiliki
morfologi bola normal dengan ukuran sel B10 mm. ASC berbentuk bulat didistribusikan di
perancah, menunjukkan sifat biologis hidrogel untuk kelangsungan hidup sel.

Hasil ini menunjukkan bahwa hidrogel biologis mampu mempertahankan proliferasi ASC
terenkapsulasi. Digabungkan dengan data lampiran sel, hasil kami menyarankan mekanisme
potensial baru untuk proliferasi sel induk yang ditargetkan melalui rakitan mandiri biologis.

Seperti yang disajikan, kami telah mengembangkan metodologi baru untuk merakit sendiri
hidrogel PEG berbentuk bintang empat biologis sebagai perancah injeksi yang secara khusus
memungkinkan untuk pengiriman GFs yang ditargetkan dan enkapsulasi sel. Pembentukan
hidrogel dirakit sendiri dikaitkan dengan pasangan basa Watson-Crick melalui ikatan
hidrogen intermolekular antara timin dan adenin. Aplikasi potensial dari hidrogel biologis ini
sebagai scaffold sel dalam rekayasa jaringan lunak dikonfirmasi oleh perilaku enkapsulasi
ASC manusia. Karakteristik unik dari hidrogel biologis ini menjadikannya kandidat yang
menjanjikan sebagai perancah injeksi untuk aplikasi farmasi dan biomedis.

Studi ini didukung secara finansial oleh National Science Foundation Alam Cina (51103071),
Yayasan Ilmu Pengetahuan Alam Provinsi Jiangsu (BK2011714), Fundamental Dana
Penelitian untuk Riset Universitas Pusat (NUST2011ZDJH12) dan program Zijin Star dari
NJUST.