Sari Skripsi 16-03-2017

ISOLASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER FRAKSI ETIL
ASETAT AKTIF ANTIOKSIDAN DARI TUMBUHAN

SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)
DENGAN METODE BIOASSAY-GUIDED ISOLATION
SARI SKRIPSI
Oleh :
ANDI HALIM
1101005
PROGRAM STUDI SI FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU
YAYASAN UNIV RIAU
PEKANBARU
2017
58
DAFTAR ISI
Halaman
BAB I PENDAHULUAN
1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
5
2.1 Monografi Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &
Pav.)
..............................................................................
..............................................................................
5
2.1.1 Klasifikasi Tumbuhan
.....................................................................
.....................................................................
6
2.1.2 Nama Daerah
.....................................................................
.....................................................................
6
2.1.3 Morfologi
.....................................................................
.....................................................................
6
2.1.4 Daerah Penyebaran
.....................................................................
.....................................................................
7
2.1.5 Kegunaan
.....................................................................
.....................................................................
7
2.1.6 Kandungan Kimia dan Aktivitas
Farmakologis
.....................................................................
.....................................................................
8
1
2.2 Metoda Ekstraksi
..............................................................................
..............................................................................
10
2.2.1 Ekstraksi
.....................................................................
.....................................................................
10
2.2.2 Fraksinasi
.....................................................................
.....................................................................
14
2.3 Metode Pemisahan Bahan Alam Menggunakan Kromatografi
..............................................................................
..............................................................................
14
2.4.1 Kromatografi Kolom
.....................................................................
.....................................................................
15
2.4.2 Kromatografi Lapis Tipis
.....................................................................
.....................................................................
15
2.4 Rekristalisasi
..............................................................................
..............................................................................
17
2.5 Uji Kemurnian
..............................................................................
..............................................................................
18
2.6 Spektrofotometri Inframerah
..............................................................................
..............................................................................
18
2.7 Spektrofotometri Ultraviolet
..............................................................................
..............................................................................
19
2.8 Bioassay-Guided Isolation
2
..............................................................................
..............................................................................
20
2.9 Radikal Bebas
..............................................................................
..............................................................................
21
2.9.1 Pengertian Radikal Bebas
.....................................................................
.....................................................................
21
2.9.2 Sumber Radikal Bebas
.....................................................................
.....................................................................
22
2.10 Antioksidan
..............................................................................
..............................................................................
23
2.10.1....................................................................
Pengertian Antioksidan
.....................................................................
.....................................................................
23
2.10.2....................................................................
Manfaat Antioksidan
.....................................................................
.....................................................................
23
2.10.3....................................................................
Mekanisme kerja Antioksidan
.....................................................................
.....................................................................
24
2.11 DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)
..............................................................................
..............................................................................
25
2.12 Vitamin C
3
..............................................................................
..............................................................................
26
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
28
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
..............................................................................
..............................................................................
28
3.2 Metodologi penelitan .....
..............................................................................
..............................................................................
28
3.2.1 Alat dan Bahan
.....................................................................
.....................................................................
28
3.2.2 Rancangan Penelitian
.....................................................................
.....................................................................
29
3.3 Prosedur Kerja
..............................................................................
..............................................................................
29
3.3.1 Penyiapan Sampel
.....................................................................
.....................................................................
29
3.3.2 Uji Kandungan Fitokimia
.....................................................................
.....................................................................
29
3.3.3 Ekstraksi Sampel
.....................................................................
.....................................................................
31
4
3.3.4 Pengujiaan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kental
Metanol
.....................................................................
3.3.5 Fraksinasi Ekstrak Kental Metanol
.....................................................................
.....................................................................
32
3.3.6 Pengujiaan Aktivitas Antioksidan Fraksi Hasil
Fraksinasi
.....................................................................
3.3.7 Pemisahan dengan Kromatografi Kolom
.....................................................................
.....................................................................
33
3.3.8 Pengujian Hasil Kromatografi Kolom
dengan KLT
.....................................................................
.....................................................................
33
3.3.9 Pengujiaan Aktivitas Antioksidan Fraksi Hasil
Kromatografi Kolom
.....................................................................
.....................................................................
34
3.3.10....................................................................
Pemurnian Fraksi Hasil Kromatografi
Kolom..............
3.3.11....................................................................
Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
.....................................................................
.....................................................................
35
3.3.12....................................................................
Pengujian Aktivitas Antiokisidan Senyawa Murni SMF12 dan
SMF14
.......................................................................................
.......................................................................................
37
5
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
...........................................................................................
...........................................................................................
39
4.1 Hasil
39
4.2 Pembahasan
41
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
50
5.1 Kesimpulan
50
5.2 Saran
50
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Gambar Tumbuhan Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
55
2. Hasil Uji Fitokimia Sampel Kering dan Ekstrak Metanol Daun
Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
56
3. Skema Kerja Ekstraksi dan Fraksinasi Daun Sirih Merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav)
57
6
4. Skema Kerja Isolasi Fraksinasi Daun Sirih Merah (piper crocatum
ruiz & pav)
58
5. Skema Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Daun Sirih
Merah (piper crocatum ruiz & pav) dengan Metode DPPH
Menggunakan Alat Micro plate Reader
59
6. Profil Kromatografi Lapis Tipis Fraksi Etil Asetat Daun Sirih
Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
60
7. Profil Kromatografi Lapis Tipis Hasil Kolom Fraksi Etil Asetat
Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
61
8. Profil Kromatografi Lapis Tipis Hasil Kolom Fraksi Etil Asetat
64
9. Profil Kromatografi Lapis Tipis Senyawa SMF12dan SMF14
dengan Tiga Perbandingan Eluen Yang Berbeda
65
10. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Asam Askorbat (Vitamin C)
66
11. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol
68
12. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan F5
70
72
7
74
76
78
80
82
84
86
88
90
92
94
25. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan SMF12
96
98
27. Hasil Identifikasi kristal senyawa SMF12 dan SMF14
8
100
28. Hasil Spektrum Spektrofotometer Ultraviolet
Senyawa Murni SMF12
101
29. Hasil Spektrum Spektrofotometer inframerah
Senyawa Murni SMF12
102
30. Hasil Spektrum Spektrofotometer Ultraviolet
Senyawa Murni SMF14
103
31. Hasil Spektrum Spektrofotometer Inframerah
Senyawa Murni SMF14
104
32. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Daun Tumbuhan
Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) dengan
Metode DPPH Menggunakan Mikroplate Reader
105
9
DAFTAR TABEL
TabelHalaman
1. Tingkat Kekuatan Antioksidan dengan metode DPPH
38
2. Hasil Uji Fitokimia Sampel Kering dan Ekstrak
Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &
Pav.)
56
3. Identifikasi kristal senyawa SMF12 dan SMF14
100
4. Data Hasil Spektrum Spektrofotometer Ultraviolet
Senyawa Murni SMF12
101
5. Data Hasil Spektrum Spektrofotometer inframerah
Senyawa Murni SMF12
102
6. Data Hasil Spektrum UV Senyawa SMF12
103
7. Data Hasil Spektrum Inframerah Senyawa SMF14
104
10
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Struktur Jenis Alkaloid
8
2. Struktur Umum Flavonoid
9
3. Struktur umum Fenolik
9
4. Penentuan Harga Rf (Gritter et al., 1991).
17
5. Reaksi DPPH dan Antioksidan
25
6. Tumbuhan Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
55
7. Daun Tumbuhan Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav)
55
11
8. Skema Kerja Ekstraksi Dan Fraksinasi Daun Sirih
Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav
57
9. Skema Kerja Isolasi dan Fraksinasi Daun SirihMerah
(Piper crocatumRuiz &Pav)
58
10. Skema Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Butanol
Daun Sirih Merah (piper crocatum ruiz & pav)
dengan Metode DPPH Menggunakan Alat
Microplate Reader
59
11. Profil Kromatografi Lapis Tipis Fraksi Etil Asetat
60
12. Gambar hasil KLT Kromatografi Kolom Di Bawah
Lampu UV λ 254 Dengan Berbagai Eluen
63
13. Profil Kromatografi Lapis Tipis Hasil Kolom Fraksi
Etil Asetat Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav.)
64
14. Profil Kromatografi Lapis Tipis Senyawa SM
F12dan SM F14 dengan Tiga Perbandingan Eluen
Yang Berbeda.
65
15. Kurva Persamaan Regresi IC50 Asam Askorbat
( Vitamin C)
66
12
16. Kurva Persamaan Regresi IC50 Ekstrak Metanol
68
17. Kurva Persamaan Regresi IC50 Fraksi 5
70
72
74
76
78
22. Kurva Persamaan Regresi IC 50 Fraksi 10
80
82
84
86
88
90
92
13
94
96
98
32. Spektrum UV Senyawa SMF12 Pada Daerah
Panjang Gelombang 200-400 nm
101
Senyawa Murni SMF12
102
34. Spektrum UV Senyawa SMF14 Pada Daerah
Panjang Gelombang 200-400 nm
103
Senyawa Murni SMF14
104
36. Fraksi 12, Fraksi 13, Fraksi 14 dan Fraksi 14 dengan
Metode DPPH Menggunakan Mikroplate Reader
105
14
BAB I
PENDAHULUAN
Tumbuhan sirih merupakan salah satu tumbuhan yang telah lama
digunakan dan diketahui oleh masyarakat untuk menyembuhkan berbagai macam
penyakit. Diketahui lebih dari 1400 spesies sirih tersebar didaerah tropis dan
subtropik (Salleh et al, 2012).
Tumbuhan sirih biasanya mencapai tinggi 15 m. Batang sirih berwarna
coklat kehijauan, berbentuk bulat, beruas dan merupakan tempat keluarnya akar.
Tumbuhan sirih mempunyai banyak spesies dan memiliki jenis yang beragam,
seperti sirih jingga, sirih hitam, sirih kuning, sirih hijau dan sirih merah. Semua
jenis tumbuhan sirih memiliki ciri yang hampir sama yaitu tumbuh merambat dan
memiliki daun yang berbentuk seperti hati (Damayanti, 2006).
Salah satu tumbuhan sirih yang sering digunakan sebagai bahan obat
adalah sirih merah. Belakangan diketahui daun tumbuhan sirih merah memiliki
berbagai macam khasiat untuk menyembuhkan berbagai macam penyakit.
Kandungan daun sirih merah adalah senyawa flavonoid dan polifenol yang
bersifat antioksidan, antidiabetes, anti kanker, antiseptik dan anti inflamasi.
Secara empiris daun sirih merah dapat menyembuhkan berbagai jenis
penyakit seperti diabetes melitus, hepatitis, batu ginjal, menurunkan kolesterol,
mencegah stroke, asam urat, hipertensi, radang liver, radang prostat, radang mata,
keputihan, magh, kelelahan, nyeri sendi, antikanker tertentu (Agoes, 2010). Air
1
rebusan sirih merah mengandung senyawa alkaloid, flavonoid dan tannin (Safithri
dan Fahma, 2005).
Berdasarkan hasil penelitian, fraksi n-heksan tumbuhan sirih merah ini
memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat karena menunjukkan nilai IC 50
sebesar 2,04 ppm (Emrizal et al, 2014). Penelitian lain juga melaporkan bahwa
daun sirih merah mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi, hasil penelitian ini
menyatakan bahwa ekstrak n-heksan (IC50 ; 43,24 ppm), etil asetat (IC50 ; 36,80
ppm), metanol ( IC50 ; 3,44 ppm) memperlihatkan aktivitas antioksidan yang
tinggi (Irawan, 2009).
Aktivitas antioksidan merupakan kemampuan dari senyawa atau ekstrak
untuk menangkal radikal bebas. Radikal bebas adalah molekul atau senyawa kimia
yang sangat reaktif, mengandung elektron yang tidak berpasangan yang
mengakibatkan stres oksidatif. Stres oksidatif adalah ketidakseimbangan antara
jumlah oksidan dan antioksidan yang berpotensi menyebabkan kerusakan lipid,
protein, enzim, karbohidrat dan DNA dalam sel ataupun jaringan. Kerusakan
tersebut dapat memicu terjadinya kanker, kelainan neurogeneratif, penyakit
jantung, diabetes, dan kelainan autoimun.
Tubuh manusia memiliki pertahanan terhadap radikal bebas dari senyawa
antioksidan enzimatis yang dihasilkan dari dalam tubuh. Superoksida dismutase
(SOD), katalase (CAT), glutathion peroksidase adalah salah satu contoh dari
enzim yang dapat menangkap radikal bebas. Dalam kondisi sakit, pertahanan
terhadap radikal bebas menjadi lemah dan mengakibatkan penambahan jumlah
oksidan. Dalam kondisi tersebut dibutuhkan pertahanan dari luar tubuh sebagai
2
antioksidan yang bisa didapatkan dari bahan alam maupun sintesis (Ratnan et al,
2006).
Penelitian mengenai isolasi dan identifikasi senyawa flavonoid terhadap
ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) juga telah
dilakukan. Tahapan isolasi meliputi ekstrak dengan metode maserasi, fraksinasi
dengan menggunakan metode ekstraksi cair – cair (ECC), subfraksinasi dengan
metode kromatografi cair vacum (KCV), dan pemurnian dengan menggunakan
KLT preparatif. Identifikasi isolat dilakukan menggunakan spektrofotometri ultra
ungu – sinar tampak dan dengan menggunakan pereaksi geser. Hasil identifikasi
menunjukkan isolat daun sirih merah mengandung senyawa flavonoid yang di
duga golongan flavonol (Puzi, 2015).
Ekstrak daun sirih merah hasil proses ekstraksi dengan pelarut campuran
etanol-air dengan perbandingan 75:25% memiliki aktivitas antioksidan yang
paling besar dengan nilai EC yaitu 301,10 μg/mL, jika dibandingkan dengan
50
ekstrak yang dihasilkan dengan pelarut campuran etanol-air pada persentase yang
lain (Lestari, 2014).
Teknik lain dalam menemukan senyawa aktif secara biologis dapat
dilakukan dengan teknik Bioassay guided isolation. Teknik bioassay-guided
isolation ini didasarkan pada teknik dimana ekstrak mentah dari produk alami
dipisahkan menjadi banyak fraksi, kemudian masing-masing fraksi dilakukan
bioassay untuk menentukan fraksi mana saja yang dapat dijadikan target untuk
pemisahan lebih lanjut. Melalui siklus pemisahan dan bioassay, senyawa aktif
murni dapat diisolasi lebih cepat (Cheng et al, 2006).
3
Berdasarkan paparan diatas sirih merah ini sangat berpotensi untuk
dimanfaatkan sebagai salah satu bahan berkhasiat obat khususnya aktivitas
antioksidan, dan sejauh ini belum ditemukan adanya penelitian yang dilakukan
dengan menggunakan metoda bioassay guided ini. Untuk itu, peneliti tertarik
melakukan isolasi senyawa metabolit sekunder dengan menggunakan metoda
bioassay guided dari fraksi etil asetat serta melakukan uji aktivitas antioksidan
fraksi etil asetat dan senyawa isolat dari daun tumbuhan sirih merah. Semoga dari
hasil penelitian ini dapat diperoleh senyawa antioksidan dari tumbuhan sirih
merah sehingga dapat dimanfaatkan sebagai salah satu bahan pengobatan.
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Monografi Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
Tumbuhan sirih mempunyai daerah persebaran yang luas, khususnya di
kawasan tropis dan subtropis. Di Indonesia tumbuhan sirih merah diketahui
tumbuh di berbagai daerah, seperti di lingkungan Keraton Yogyakarta dan di
lereng Merapi sebelah timur, serta di Papua, Jawa Barat, Aceh dan beberapa
daerah lainnya (Sudewo, 2008).
Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti sirih hijau, batangnya
bersulur dan beruas dengan setiap buku tumbuh bakal akar, daunnya bertangkai
membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, mempunyai warna yang khas
yaitu permukaan atas hijau gelap berpadu dengan tulang daun berwarna merah
hati keunguan, daun berasa pahit, berlendir, serta mempunyai bau yang khas
seperti sirih (Duryatmo 2005).
Senyawa fitokimia yang terkandung dalam daun sirih merah yakni alkaloid
flavonoid, saponin, tanin dan minyak atsiri. Senyawa aktif flavonoid dan alkaloid
memiliki aktivitas hipoglikemik atau penurun kadar glukosa darah (Manoi, 2007).
5
2.1.1 Klasifikasi Tumbuhan
Tumbuhan Piper crocatum Ruiz &Pav merupakan spesies tumbuhan yang
termasuk ke dalam famili Piperaceae. Adapun taksonomi tumbuhan ini menurut
Backer (1963) diklasifikasikan sebagai berikut :
Kingdom :Plantae
Divisi :Magnoliophyta
Kelas :Magnoliopsida
Ordo :Piperales
Famili :Piperaceae
Genus :Piper
Spesies :Piper crocatum Ruiz & Pav
2.1.2 Nama Daerah
Nama daerah untuk sirih merah adalah sirih pait (Maluku), tali pait
(Maluku), gumi momadi (Ternate), sulamu tali (Ternate) (Heyne, 1987).
Sedangkan dibeberapa daerah sirih merah dikenal juga dengan nama suruh, sedah
(Jawa); seureuh (Sunda); ranub (Aceh); cambai (Lampung); base (Bali)
(Mardiana, 2004).
2.1.3 Morfologi
Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti sirih hijau, batangnya
bersulur dan beruas dengan setiap buku tumbuh bakal akar, daunnya bertangkai
membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, mempunyai warna yang khas
yaitu permukaan atas hijau gelap berpadu dengan tulang daun berwarna merah
6
hati keunguan, daun berasa pahit, berlendir, serta mempunyai bau yang khas
seperti sirih (Duryatmo 2005).
Tumbuhan sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan
tidak terlalu banyak terkena sinar matahari agar warna merah daunnya tidak
menjadi pudar, buram, kurang menarik (Sudewo 2008).
2.1.4 Daerah Penyebaran
Tumbuhan sirih mempunyai daerah persebaran yang luas, khususnya di
kawasan tropis dan subtropis. Tanaman sirih ditemukan di bagian Timur pantai
Afrika, di sekitar pulau Zanzibar, Madagaskar, India ke Timur meliputi daratan
Cina, kepulauan Bonim, kepulauan Fiji, Malaysia, Indonesia dan kawasan Asia
Tenggara lainnya (Tjitrosoepomoe, 2005).
Di Indonesia tumbuhan sirih merah diketahui tumbuh di berbagai daerah,
seperti di lingkungan Keraton Yogyakarta dan di lereng Merapi sebelah timur,
serta di Papua, Jawa Barat, Aceh dan beberapa daerah lainnya (Sudewo, 2008).
2.1.5 Kegunaan
Penggunaan sirih merah dapat digunakan dalam bentuk segar maupun
simplisia. Secara empiris sirih merah dapat menyembuhkan berbagai jenis
penyakit seperti diabetes millitus, hepatitis, batu ginjal, kolesterol, hipertensi,
asam urat, keputihan, obat kumur, maag, radang mata, nyeri sendi dan
memperhalus kulit. Sirih merah banyak digunakan pada klinik herbal center
sebagai ramuan atau terapi bagi penderita yang tidak dapat disembuhkan dengan
obat kimia (Sudewo, 2008; Safithri & Fahma, 2005).
7
2.1.6 Kandungan Kimia dan Aktivitas Senyawa
Kandungan kimia tanaman sirih merah belum diteliti secara detil. Senyawa
fitokimia yang terkandung dalam daun sirih merah yakni alkaloid, saponin,
flavonoid, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri. (Sudewo, 2006).
Kandungan kimia lainnya yang tedapat didaun sirih merah adalah minyak atsiri,
berupa hidroksikavikol, kavikol, kavibetol, allilpirokatekol, karvakrol, eugenol,
p-cymene, sineol, karyofilen, kadinen, estragol, terpienene, dan fenil propanoid.
Senyawa karvakrol merupakan senyawa yang bersifat desinfektan, anti jamur,
sehingga bisa digunakan untuk obat antiseptik untuk rongga mulut sehingga dapat
menghilangkan bau mulut dan juga untuk pengobatan keputihan. Eugenol dapat
digunakan untuk mengurangi rasa sakit (Sudewo, 2006).
Hidroksikavikol Karvakrol p-cymene
Terpinene Kavibetol kavikol
8
Estragol Kadinen Eugenol
Gambar 1. Struktur minyak atsiri dari sirih merah
2.1.7 Khasiat Sirih Merah
Secara empiris, ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal
atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka
penyakit, seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ tubuh tertentu,
luka yang sulit sembuh, kanker payudara, kanker rahim, leukimia, TBC, radang
pada liver, lemah syahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat
(Sudewo, 2006). Disamping itu, sirih merah juga dapat digunakan untuk
mengatasi sakit mata, eksim, bau mulut, luka, mimisan, sariawan, sakit gigi,
menjaga kesehatan alat kelamin wanita, hepatitis, batu ginjal, menurunkan
kolesterol, mencegah stroke, radang prostat, maag, kelelahan dan memperhalus
kulit (Mursito, 2002; Hidayat, 2013).
9
2.2 Metoda Ekstraksi
2.2.1 Ekstraksi
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi zat
aktif simplisia nabati dan hewani dengan menggunakan pelarut yang sesuai,
kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan (Anonim, 2000).
Ekstraksi merupakan pemisahan bagian aktif dari tumbuhan atau jaringan
hewan menggunakan pelarut yang sesuai dengan prosedur tertentu. Dalam
melakukan penyarian terhadap suatu simplisia terlebih dahulu harus diketahui
sifat-sifat dari simplisia yang digunakan, sehingga dapat dipilih suatu metoda
penyarian yang tepat. Ada beberapa metode yang umum digunakan, yaitu
maserasi, perkolasi, Sokletasi, digestasi (Harborne, 1987).
Metode yang umum digunakan untuk penyarian antara lain:
1. Maserasi (perendaman)
Maserasi adalah proses penyarian sederhana dengan jalan merendam
bahan alam atau tumbuhan dalam pelarut dan waktu tertentu, sehingga bahan akan
menjadi lunak dan larut. Tujuan dari maserasi yaitu agar senyawa kimia yang
diinginkan larut bersama pelarut yang digunakan. Dengan perendaman, dinding
dan membran sel tumbuhan akan pecah karena adanya perbedaan tekanan didalam
dan diluar sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut
dalam pelarut. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan
efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam
dalam pelarut tersebut. Cara ini dipakai untuk senyawa yang tidak tahan panas.
Teknik maserasi digunakan terutama jika senyawa organik metabolit
sekunder ada dalam bahan tersebut cukup banyak persentasenya dan ditemukan
10
suatu pelarut yang dapat melarutkan senyawa tersebut tanpa dilakukan
pemanasan. Biasanya cara ini membutuhkan waktu yang cukup lama dan sulit
mencari pelarut organik yang dapat melarutkan dengan baik senyawa organik
dalam bahan tersebut. Akan tetapi jika struktur senyawa yang akan diisolasi sudah
diketahui, maka metode perendaman ini metode praktis. Dilihat dari alat yang
digunakan juga sederhana yaitu dapat digunakan botol besar berwarna gelap, yang
penting tertutup rapat untuk menghindari penguapan pelarut.
Maserasi biasanya dilakukan untuk bagian tumbuhan yang teksturnya
lunak, seperti bunga dan daun. Senyawa organik metabolit sekunder yang ada
dalam bahan alam tersebut umumnya dalam persentase yang cukup banyak,
perendaman tidak dilakukan dengan pemanasan. Hasil perendaman kemudian
disaring dan filtrat yang didapat diuapkan dengan alat rotary evaporator sampai
diperoleh ekstrak kental tumbuhan.
2. Perkolasi
Perkolasi adalah proses penyarian dengan jalan melakukan pelarut yang
sesuai secara lambat pada simplisia dalam suatu alat perkolator. Pada proses
perkolasi, simplisia harus berukuran agak kasar (1-3 mm) untuk memungkinkan
pembilasan cepat pelarut melalui simplisia. Sebelum proses dimulai simplisia
terlebih dahulu dibasahi dengan pelarut sebelum dimasukkan kedalam perkolator.
Pembasahan dilakukan dengan menggunakan 0,3-1 bagian pelarut dan didiamkan
lebih kurang 2 jam sampai terjadi pengembangan sempurna. Perkolator terdiri dari
kontener berbentuk konikal atau silinder, tertutup pada bagian bawah oleh suatu
sistem penyaringan berbentuk ayakan dengan klep.
11
Alat jenis ini sangat menguntungkan untuk pembuatan ekstrak secara
tradisional seperti ekstrak cair atau ekstrak kental, karena dapat dihasilkan tanpa
terlalu banyak melakukan manipulasi dan dapat menghemat penggunaan pelarut.
Pelarut segar yang digunakan pada tahap penarikan dan kemudian digunakan lagi
untuk ekstraksi simplisia yang segar. Kerugian utama ialah karena simplisia
terlebih dahulu harus dibasahi sebelum dimasukkan kedalam evaporator; dan
massa simplisia dalam evaporator, sering menjadi memadat (kompak) sesudah
beberapa kali tahap ekstraksi, dan hal ini dapat menghalangi kelancaran aliran
pelarut. Hal ini akan memperlambat aliran perkolat dari ekstraktor selanjutnya
sehingga mengganggu kelancaran proses ekstraksi.
Pada prinsipnya perkolasi menggunakan suatu pelarut dimana pelarut
tersebut dilewatkan secara perlahan (tetes demi tetes) kepada bahan alam yang
mengandung senyawa organik tersebut. Pada teknik ini juga digunakan pelarut
yang tidak mudah menguap, tetapi melarutkan senyawa organik yang terkandung
dalam bahan alam tersebut cukup besar.
Perkolasi biasanya digunakan untuk bagian tumbuhan yang keras seperti
akar, biji dan batang. Cara perkolasi digunakan apabila kandungan kimianya
sedikit. Filtrat yang didapat diuapkan pelarutnya dengan alat rotary evaporator.
3. Sokletasi
Sokletasi adalah proses penyarian bahan alam secara kontinu didalam alat
Soklet. Proses Sokletasi berlangsung dimana pelarut mengalami penguapan dan
pendinginan secara berulang-ulang. Pelarut masuk kedalam wadah tempat sampel
membasahi dan merendam evapor yang dibungkus dalam suatu kantung kertas.
12
Setelah pelarut memenuhi batas secara keseluruhan akibat adanya grafitasi pada
sistem pipa kapiler dan pengaruh tekanan dari permukaan sampel pelarut mengalir
kedalam labu dibawahnya sambil mengosongkan wadah evaporator. Wadah
evaporator akan terisi kembali akibat penguapan pelarut dari labu penampung.
Prinsip Sokletasi adalah penyarian dilakukan berulang-ulang sehingga
penyarian lebih sempurna dan pelarut yang digunakan relatif sedikit. Bila
penyarian telah selesai maka pelarutnya diuapkan kembali dan sisanya adalah zat
yang tersari. Metode sokletasi mempunyai keunggulan dari metode lainnya,
karena melalui metode ini penyarian dapat dilakukan beberapa kali dan pelarut
yang digunakan tidak banyak. Tetapi kelemahan utama pada Sokletasi adalah
tidak dapat digunakan pada senyawa termolabil karena Sokletasi merupakan
teknik dengan menggunakan pemanasan.
4. Digestasi
Digestasi adalah proses penyarian yang sama dengan metode maserasi
dengan menggunakan pemanasan pada suhu 300C sampai 400C. Cara ini dilakukan
untuk simplisia yang pada suhu biasa tidak tersari dengan baik. Jika pelarut yang
dipakai mudah menguap pada suhu kamar dapat digunakan alat pendingin tegak,
sehingga penguapan bisa dicegah (Djamal, 1998).
2.2.2 Fraksinasi
Pemisahan komponen senyawa kimia dapat dilakukan dengan cara
fraksinasi. Fraksinasi merupakan metode pemisahan campuran menjadi beberapa
13
fraksi yang berbeda susunannya (Harborne, 1987), fraksinasi pada prinsipnya
adalah proses penarikan senyawa dari suatu ekstrak dengan menggunakan dua
macam pelarut yang tidak saling bercampur. Fraksinasi dilakukan dengan
meningkatkan kepolaran pelarut. Pelarut yang biasa digunakan adalah pelarut
nonpolar seperti n-heksan, petroleum eter, pelarut semi polar seperti etil asetat,
kloroforom, dan terakhir pelarut polar seperti butanol dan etanol, sehingga
diperoleh fraksi yang mengandung senyawa nonpolar, semipolar, dan polar
(Houghton dan Amala, 1998). Metode dari fraksinasi yang biasa digunakan adalah
metode ekstraksi cair-cair dan kromatografi (Harborne, 1987).
2.3 Metode Pemisahan Bahan Alam Menggunakan Kromatografi
Kromatografi adalah suatu metoda pemisahan komponen-komponen di
dalam suatu sampel, dimana komponen-komponen tersebut terdistribusi diantara
dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Pemisahan ini terjadi karena adanya
perbedaan migrasi yang disebabkan oleh perbedaan koefisien distribusi dari
masing-masing komponen. Keuntungan dari kromatografi antara lain adalah
pelaksanaannya yang lebih sederhana, waktu pengerjaannya lebih efisien dan
mempunyai kepekaan yang tinggi serta kemampuan memisahkan yang baik
(Gritter et al, 1991).
2.3.1 Kromatografi kolom
Kromatografi kolom digunakan untuk pemisahan skala preparatif, dari
beberapa milligram sampai puluhan gram sampel. Pemisahan dilakukan dengan
14
menggunakan kolom kaca yang dapat diisi dengan bahan penyerap (adsorben)
seperti alumina atau silika gel dan dialiri dengan pelarut seperti heksana, etil
asetat, metanol, dan lain sebagainya sebagai fase gerak. Sejumlah kecil cuplikan
dari campuran dimasukkan melalui sebelah atas kolom kemudian dielusi sehingga
membentuk pita–pita serapan dari cuplikan tersebut. Kecepatan bergerak dari
suatu komponen tergantung pada beratnya terhambat atau tertahan oleh penyerap
di dalam kolom (Sastrohamidjojo, 1992).
2.3.2 Kromatografi Lapis Tipis (Hostettmann and Marston, 1997)
Kromatografi lapis tipis adalah suatu metoda kromatografi paling
sederhana, yang berguna untuk memisahkan senyawa-senyawa organik dan
umumnya digunakan dalam teknik analisis kimia, antara lain:
1. Untuk mengidentifikasi suatu senyawa
2. Untuk mengetahui berapa banyak jenis senyawa dalam suatu campuran
3. Untuk mengetahui pelarut atau perbandingan pelarut yang cocok untuk
pemisahan pada kromatografi kolom
4. Untuk memonitor pemisahan pada kromatografi kolom
KLT ini terdiri dari fase diam yang berupa lapisan tipis material
pengadsorbsi dan fase gerak berupa cairan. Adsorben yang paling banyak
digunakan adalah silika gel dan aluminium oksida. Untuk fase geraknya, yang
umum digunakan adalah pelarut biner misalnya: perbandingan pelarut n-
heksan:etil asetat.
Pengembangan plat KLT biasa dilakukan dalam bejana kaca (chamber)
yang lebih dahulu telah dijenuhkan dengan fase gerak. Untuk penjenuhan, bagian
15
dalam bejana ditutupi dengan kertas saring yang tercelup dalam fase gerak. Untuk
mencapai efisiensi pemisahan, pengembangan dilakukan beberapa kali. Sebelum
pengembangan yang kedua plat KLT harus dikeringkan terlebih dahulu. Molekul
dengan kepolaran yang tinggi akan berinteraksi (terikat) kuat dengan ikatan polar
pada adsorben, sedangkan molekul yang kurang polar akan terikat lemah dengan
adsorban, sehingga senyawa kurang polar akan lebih cepat melewati adsorban dari
pada senyawa polar.
Visualisasi untuk senyawa yang tidak berwarna harus dideteksi dengan
cara penyinaran lampu UV, atau dengan pereaksi penampak noda seperti
Dragendorff, Lieberman-Bouchard, dan lain-lain. Noda yang diperoleh ditandai
dengan pensil untuk menentukan harga Rf yang berkisar 0-1. Harga Rf dapat
dihitung dengan membandingkan jarak yang ditempuh komponen dengan jarak
yang ditempuh eluen.
B
Jarak yang ditempuh senyawa
Rf = (A)
Jarak yang ditempuh eluen
(B)
A
Gambar 4. Penentuan Harga Rf (Gritter et al., 1991).
2.4 Rekristalisasi
Suatu senyawa dikatakan murni apabila tidak ditemukan pengotor dan
memiliki sifat fisik yang tepat, biasanya hasil isolasi yang diperoleh tidak pernah
16
diinginkan harus larut sempurna dalam pelarut ketika panas dan kelarutan
senyawa tersebut berkurang dalam keadaan dingin (Hostettmann et al, 1995).
Cara rekristalisasi adalah dengan melarutkan zat dalam pelarut yang
melarutkannya sesedikit mungkin kemudian ditambahkan secara bertahap pelarut
yang sukar melarutkannya, lalu biarkan menguap sehingga didapat senyawa yang
lebih langsung murni dan ada pengotornya. Rekristalisasi adalah suatu metode
penting dalam pemurnian senyawa organik yang berupa padatan. Prinsip dasar
dari proses ini yaitu melarutkan padatan dalam keadaan panas dan mengkristal
pada keadaan dingin. Karakteristik penting dari pelarut yang digunakan adalah
senyawa yang murni (Sharp et al, 1989).
2.5 Uji Kemurnian
Hasil rekristalisasi diuji dengan KLT dalam berbagai sistem eluen. Jika
menghasilkan satu noda berarti senyawa tersebut sudah murni. KLT
(Kromatografi Lapis Tipis) ini paling banyak digunakan untuk analisis di
laboratorium farmasi, karena hanya membutuhkan waktu singkat, memerlukan
cuplikan yang sangat sedikit, selain itu hasil palsu yang disebabkan oleh
komponen sekunder lain tidak mungkin terjadi, dan kebutuhan ruangan minimum
serta penanganannya dilakukan secara sederhana (Stahl, 1985).
Uji kemurnian bisa juga dilakukan dengan melihat titik leleh mulai saat
kristal mulai meleleh sampai habis meleleh semuanya, jika selisih harga titik
lelehnya kecil atau sama dengan 2°C maka senyawa tersebut sudah murni (Sharp
et al,1989).
2.6 Spektrofotometri Inframerah
17
Spektrum inframerah sangat penting dalam kimia modern terutama kimia
organik. Penggunaan spektroskopi inframerah untuk menentukan gugus fungsi
suatu senyawa organik dan mengetahui informasi struktur senyawa organik
dengan membandingkan daerah sidik jarinya. Pengukuran spektrum inframerah
dilakukan pada panjang gelombang 4000-200 cm-1 (Silverstein et al, 2005).
Penggunaan spektrofotometri inframerah untuk maksud analisis lebih
banyak ditujukan untuk identifikasi suatu senyawa melalui gugus fungsinya. Hal
ini mungkin disebabkan spektrum inframerah senyawa organik bersifat khas,
artinya senyawa yang berbeda akan mempunyai spektrum yang berbeda pula.
Panjang gelombang IR dapat dibagi menjadi tiga sub daerah, yaitu IR dekat
(4000-1300 cm-1; 250µm-0,8 µm), IR tengah (400-4000 cm-1; 25 µm-2,5 µm) dan
IR jauh 400-40 cm-1; 250 µm-25 µm). Hanya IR tengah yang berguna dalam
analisis struktur senyawa organik. Bila sinar inframerah dilewatkan melalui
cuplikan senyawa organik, maka sejumlah frekwensi diserap sedangkan frekwensi
yang lain diteruskan/ditransmisikan tanpa diserap (Sastrohamidjojo, 1992).
Adanya vibrasi molekul dapat memberikan sifat yang khas dari suatu
senyawa dalam spektroskopi inframerah. Pita-pita dalam suatu spektrum dapat
dikelompokkan menurut intensitasnya, yaitu kuat (strong), medium (middle), dan
lemah (weak). Energi yang terlibat pada vibrasi tergantung pada panjang ikatan
dan massa atom-atom yang saling berikatan (Fessenden dan Fessenden, 1994).
2.7 Spektrofotometri Ultraviolet
Peranan penting spektrum ultraviolet, dalam mengidentifikasi jenis
kromofor dan memperkirakan adanya konjugasi dalam molekul yang tidak
18
diketahui. Oleh karena itu, untuk keperluan penentuan struktur penggunaannya
tidak begitu luas seperti spektroskopi yang lain. Nilai spektrum ultraviolet pada
identifikasi kandungan yang tidak dikenal berkaitan dengan kerumitan relatif
spektrum dan letak ujung panjang gelombang maksimum (Harborne, 1987).
Spektroskopi ini berguna untuk mengetahui adanya ikatan rangkap
terkonyugasi, menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang
maksimum suatu senyawa (Silverstein, 1981). Sinar ultraviolet berada pada
panjang gelombang 200-400 nm, sedangkan sinar tampak berada pada panjang
gelombang 400-800 nm. Spektrum tampak dan ultraviolet digunakan untuk
melacak (mendeteksi) konjugasi. Pada umumnya molekul tanpa ikatan rangkap
dan molekul dengan hanya satu ikatan rangkap tidak menyerap sinar di daerah
200-800 nm. Sistem konjugasi dapat dideteksi di daerah ini, dan semakin banyak
konjugasi semakin panjang gelombang serapan maksimumnya (Hart, 1983).
Identifikasi senyawa yang tidak berwarna pada kromatogram dilakukan dengan
menggunakan spektroskopi ultraviolet (sinar UV) yakni pada panjang gelombang
antara 254-366 nm, ditandai dengan ada atau tidaknya fluoresensi dari suatu
senyawa yang diteliti (Auterhoff dan Kovar, 2002).
2.8 Bioassay-Guided Isolation
Bioassay dapat didefinisikan sebagai sistem biologis untuk mendeteksi
sifat dari ekstrak mentah, fraksi kromatografi, campuran atau senyawa murni.
Bioassay awalnya digunakan untuk tes antibakteri, anti - HIV, antijamur dan
antikanker (Sarker et al, 2006). Bioassay dapat dilakukan menggunakan teknik
baik secara in vivo (uji klinis, seluruh hewan percobaan), contoh in vivo (terisolasi
19
organ atau jaringan), atau sistem in vitro ( kultur sel ). Penelitian in vivo lebih
terkait dengan penerapan klinis dan juga menyediakan data toksisitas senyawa
terhadap manusia atau hewan. Namun in vitro bioassay dapat dengan cepat
mengidentifikasi bioaktivitas dari ekstrak atau senyawa dalam jangka pendek
(Sarker et al, 2006).
Dalam proses Bioassay-Guided Isolation, ekstrak mentah dari produk alami
dipisahkan menjadi banyak fraksi. Kemudian, masing-masing fraksi dilakukan
bioassay untuk menentukan mana saja fraksi yang dapat dijadikan target untuk
pemisahan lebih lanjut. Melalui siklus pemisahan dan bioassay ini, senyawa aktif
murni dapat diisolasi (Cheng et al,2006). Bioassay-guided fractionation adalah
prosedur dimana ekstrak kromatografi difraksinasi dan refraksinasi sampai
senyawa biologis aktif murni terisolasi. Setiap fraksi yang dihasilkan selama
proses fraksinasi dievaluasi dalam sistem bioassay dan hanya fraksi aktif yang
difraksinasi (Atta-ur-Rahman dan Basha, 1988).
Dalam proses penemuan obat, bioassay-guided isolation telah digunakan
sebagai metode yang cepat dan sukses untuk mengisolasi senyawa bioaktif murni
dari produk alami, baik dari tumbuhan, mikroorganisme atau jamur. Metode
menggunakan bioassay ini untuk memantau aktivitas fraksi yang dihasilkan dari
langkah pemisahan kromatografi dalam isolasi senyawa bioaktif (Vlietinck et al,
1995; Rimando et al, 2001) .
Cho et al, (2003) telah menggunakan prosedur bioassay-guided
fractionation untuk mengisolasi senyawa aktif antioksidan dari 23 tanaman obat
dari Korea menggunakan kromatografi gel silika dan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
20
(DPPH). Teknik fraksinasi berturut-turut diikuti dengan uji DPPH itu mengarah ke
isolasi polifenol seperti procyanidin B-3, ( + ) - katekin, asam galat, metil gallate,
quercetin, quercetin-3-O-β-D-glukosida, quercetin-3-O-β- galaktosida, quercetin-
3-O-rutinose dan kaempferol yang dimiliki kuat DPPH aktivitas scavenging
radikal bebas.
2.9 Radikal Bebas
2.9.1 Pengertian Radikal Bebas
Radikal bebas adalah sekelompok bahan kimia yang mempunyai elektron
ganjil atau elektron yang tidak berpasangan pada lingkaran luarnya sehingga
molekul tersebut menjadi tidak stabil dan selalu berusaha mengambil elektron dari
molekul lain atau molekul sel lain. Radikal bebas dapat berasal dari polusi, debu,
maupun diproduksi secara kontinyu sebagai konsekuensi dari metabolisme normal
(Sarastani dkk, 2002).
Radikal bebas masuk kedalam tubuh antara lain berasal dari asap rokok,
polusi udara termasuk timbal dari pembakaran mesin mobil, bahan kimia
pencemar lingkungan, pestisida, obat-obatan, serta makanan olahan yang banyak
mengandung pengawet (Limawati, 2009). Radikal bebas tidak selalu berasal dari
luar tubuh tetapi juga dapat berasal dari proses alami tubuh, seperti metabolisme
sel normal, proses peradangan, dan kekurangan nutrisi (Winarsi, 2009). Untuk
melindungi diri dari radikal bebas, tubuh menghasilkan senyawa anti radikal bebas
atau disebut juga antioksidan. Antioksidan adalah senyawa yang dalam jumlah
kecil dibanding substrat mampu menunda atau mencegah terjadinya oksidasi dari
substrat yang mudah teroksidasi. Antioksidan memberikan elektron atau reduktan.
21
Senyawa antioksidan yang memiliki berat molekul kecil ini mempunyai
kemampuan melepas atom hidrogen dan menurunkan reaktivitas radikal (Winarsi,
2007).
2.9.2 Sumber Radikal Bebas
Sumber radikal bebas dari dalam tubuh kita adalah seperti hasil oksidasi
enzimatik, fagositosis dalam respirasi, oksidasi ion-ion logam transisi, atau
melalui ischemik. Selain itu radikal bebas dapat berasal dari luar tubuh seperti
asap rokok, asap kendaraan bermotor, sinar UV, bahan kimia makanan, dan
polutan (Gitawati, 1995).
2.10 Antioksidan
2.10.1 Pengertian Antioksidan
Antioksidan adalah senyawa pemberi elektron kepada radikal bebas.
Secara biologis pengertian antioksidan yaitu senyawa yang mampu menangkal
radikal bebas di dalam tubuh. Cara kerja antioksidan yaitu mendonorkan satu atau
lebih elektronnya kepada radikal bebas sehingga aktifitas senyawa tersebut di
hambat (Meydani et al, 1995).
Berbagai fungsi utama antioksidan adalah mencegah terjadinya penyakit
degeneratif, mencegah atau menghambat proses penuan dini, memperkecil
terjadinya proses oksidasi dari lemak dan minyak, memperkecil terjadinya proses
kerusakan bahan makanan, memperpanjang masa pemakaian suatu produk
makanan, dan meningkatkan stabilitas lemak yang terkandung dalam makanan
(Ramelan, 2003)
2.10.2 Manfaat Antioksidan
22
Peningkatan konsumsi antioksidan fenolik alami yang terdapat dalam
buah, sayur mayur, dan tanaman serta produk-produknya mempunyai manfaat
besar terhadap kesehatan yakni dapat mengurangi resiko terjadinya penyakit
koroner. Hal ini disebabkan karena adanya kandungan beberapa vitamin (A, C, E
dan Folat), serat dan kandungan kimia lain seperti polifenol yang mampu
menangkap radikal bebas.

Senyawa-senyawa polifenol seperti flavonoid dan galat mampu
menghambat reaksi oksidasi melalui mekanisme penangkapan radikal dengan cara
menyumbangkan satu elektron pada elektron yang tidak berpasangan dalam
radikal bebas sehingga jumlah radikal bebas menjadi berkurang.

Proses penuaan dan penyakit degeneratif seperti kanker, kardiosvaskular,
penyumbatan pembuluh darah yang meliputi hiperlipidemik, aterosklerosis, stroke
dan tekanan darah tinggi serta terganggunya sistem imun tubuh dapat disebabkan
oleh stress oksidatif. Stress oksidatif adalah keadaan tidak seimbangnya antara
prooksidan dan antioksidan dalam tubuh. Keadaan stress oksidatif sebetulnya
dapat diindikasi oleh berbagai faktor, antara lain adalah kurangnya antioksidan
atau kelebihan produksi radikal bebas (Anonim, 2007).

Jenis antioksidan terbagi dua, yaitu antioksidan alami dan antioksidan
sintetik (Cahyadi, 2006). Antioksidan alami banyak terdapat pada tumbuh-
tumbuhan, sayur-sayuran dan buah-buahan (Winarsi, 2007), sedangkan yang
termasuk dalam antioksidan sintetik yaitu butil hidroksilanisol (BHA), butil
hidroksittoluen (BHT), propilgallat, dan etoksiquin (Cahyadi, 2006)
2.10.3 Mekanisme Kerja Antioksidan
Berdasarkan mekanisme kerja antioksidan, maka dapat di golongkan
menjadi 3 kelompok yaitu antioksidan primer, sekunder, dan tersier.
23
a. Antioksidan primer
Antioksidan primer atau antioksidan enzimatis. Suatu senyawa di
katakan antioksidan primer, apabila dapat memberikan atom hidrogen secara cepat
kepada senyawa radikal, kemudian radikal yang terbentuk akan segera berubah
menjadi senyawa yang lebih stabil. Antioksidan primer bekerja dengan cara
mencegah pembentukan senyawa radikal bebas baru, atau mengubah radikal bebas
yang telah terbentuk menjadi molekul yang kurang reaktif.
b. Antioksidan sekunder
Antioksidan sekunder atau antioksidan non enzimatis. Antioksidan dalam
kelompok ini disebut juga sistem pertahanan preventif yaitu pembentukan
senyawa oksigen reaktif dihambat dengan cara pengkelatan mental atau dirusak
pembentukannya. Antioksidan sekunder dapat berupa komponen nutrisi dan
komponen nutrisi dari sayur-sayuran dan buah-buahan. Kerja sistem antioksidan
non enzimatik yaitu dengan cara menangkapnya sehingga radikal bebas tidak akan
bereaksi dengan komponen seluler.
c. Antioksidan tersier
Antioksidan tersier meliputi sistem enzim DNA-repair dan metionin
sulfoksida reduktase. Enzim-enzim ini berfungsi dalam perbaikan biomolekuler
yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas. Kerusakan DNA yang terinduksi
senyawa radikal bebas dicirikan oleh rusaknya single dan double strand, baik
gugus non basa maupun basa (Winarsi, 2007).
2.11 DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)
NO2 NO2
RH H
O2 N N O2 N N + R
N N
24
NO NO2
2
DPPH Radikal (ungu) DPPH Stabil (kuning)
Gambar 5. Reaksi DPPH dan Antioksidan
DPPH atau 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil merupakan radikal bebas yang
dapat diperdagangkan, stabil di dalam suhu kamar, dengan bentuk serbuk ungu
agak kehitaman, dapat cepat teroksidasi oleh suhu dan cahaya, mudah larut dalam
metanol dan memiliki berat molekul 394,3. DPPH disimpan pada suhu dibawah
0oC (Prakash, 2001).
DPPH berfungsi sebagai senyawa radikal bebas yang ditetapkan secara
spektrometri melalui persen peredaman absorbsi. Larutan DPPH berwana ungu,
sedangkan DPPH tereduksi tidak memiliki absorbsi maksimum pada panjang
gelombang sinar tampak. Dengan demikian semakin kuat kapasitas antioksidan
suatu senyawa, maka semakin pudar warna ungu yang dihasilkan jika direaksikan
dengan DPPH ini (Anonim, 2000).
2.12 Vitamin C
25
Vitamin C atau asam askorbat merupakan antioksidan yang larut dalam air.
Vitamin C bekerja dengan cara mencegah oksidasi serta penyusun kulit yaitu
kolagen dan elastin dengan memberikan satu elektronnya untuk teroksidasi oleh
radikal bebas. Disamping itu vitamin C juga merupakan bagian dari sistem
pertahanan tubuh terhadap senyawa oksigen reaktif dalam plasma dan sel. Vitamin
C berbentuk kristal putih dengan berat molekul 176,13 dan rumus molekul
C6H8O6.
Vitamin C apabila terkena pengaruh oksigen, zat-zat pengoksidasi lemah,
atau oleh pengaruh enzim asam askorbat oksidase, mudah mengalami oksidasi
menjadi asam dehidroaskorbat. Karena memiliki sifat mudah teroksidasi, maka
asam askorbat digunakan sebagai antioksidan (Winarsi, 2007)
Tubuh sangat membutuhkan asam askorbat, karena jika tubuh kekurangan
asam askorbat di dalam darah maka dapat menyebabkan beberapa penyakit seperti
asma, kanker, diabetes, dan penyakit hati. Vitamin ini dapat diperoleh oleh tubuh
dalam bentuk sintesis atau dengan cara alami seperti memakan sayur-sayuran dan
buah-buahan yang kaya dengan asam askorbat seperti jeruk, lemon, brokoli,
tomat, anggur, lada hijau, ubi jalar, dan sebagainya. Namun kelebihan asam
askorbat juga dapat memberikan reaksi negatif pada tubuh kita yang dapat
menyebabkan terbentuknya batu ginjal, dan diare (Andarwulan, 1992).
26
BAB III
PELAKSANAAN PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
27
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan April sampai dengan Oktober
2016. Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Sekolah Tinggi Ilmu
Farmasi Riau.
3.2 Metodologi Penelitian
3.2.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: alat
destilasi, satu unit Rotary Evaporator, lumpang, neraca analitik, corong pisah,
kolom kromatografi, plat KLT GF254, chamber, lampu UV penampak noda, vial,
pipa kapiler, alat penentu titik leleh melting point apparatus, spektrofotometer
UV-VIS, microplate reader, spektrofotometer IR, dan peralatan gelas yang umum
digunakan.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah Sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav) sebanyak 3,3 kg yang diambil dari Yogyakarta. Bahan
yang digunakan adalah n-heksana, etil asetat, etanol, metanol, aquadest, asam
asetat anhidrat, kloroform, kloroform amoniak, logam magnesium, pereaksi
Lieberman Bouchardad, larutan FeCl3, HCl 1%, H2SO4 2N, pereaksi Mayer, dan
silika gel 60, DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl), asam askorbat.
3.2.2 Tahapan Penelitian
1. Penyiapan Sampel
2. Uji Kandungan Fitokimia
3. Ekstraksi Sampel
4. Pengujiaan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kental Metanol
5. Fraksinasi Ekstrak Kental Metanol
6. Pengujiaan Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat
28
7. Pemisahan dengan Kromatografi Kolom
8. Pengujiaan Hasil Fraksi Kromatografi Kolom dengan KLT
9. Pengujiaan Aktivitas Antioksidan Fraksi Hasil Kromatografi Kolom
10. Pemurnian Fraksi Hasil Kromatografi Kolom
11. Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
12. Pengujian Aktivitas Antiokisidan Senyawa Murni SMF12 dan SMF14
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Penyiapan Sampel
Sampel kering daun tumbuhan sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
sebanyak 5,7 kg, disortasi kering dan diblender untuk memperkecil ukuran
kemudian ditimbang kembali dan didapat sampel daun sirih merah kering
sebanyak 4,2 kg.
3.3.2 Uji Kandungan Fitokimia
Uji kandungan metabolit sekunder dilakukan terhadap sampel daun
kering tumbuhan sirih merah. Sebanyak 5 g sampel kering dihaluskan, lalu
diekstraksi dengan etanol, kemudian dipekatkan. Ekstrak kental ini ditambahkan
masing-masing 5 ml air suling dan kloroform lalu dikocok kuat dan dibiarkan
beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan air digunakan untuk uji
senyawa flavonoid, fenolik, dan saponin. Lapisan kloroform digunakan untuk uji
senyawa terpenoid, dan steroid.
a. Uji Alkaloid
Pemeriksaan alkaloid, 0,5 gram ekstrak ditambah 5 ml kloroform,
kemudian ditambahkan 5 ml larutan kloroform amoniak 0,05 M, diaduk kemudian
disaring. Kedalam tabung reaksi tambahkan 1 ml asam sulfat 2 N, kocok selama 2
menit, biarkan hingga terbentuk dua lapisan dan terjadi pemisahan. Ambil lapisan
29
asam (atas) dan tambahkan 1–2 tetes pereaksi Mayer, Amati perubahan warna
yang terjadi (Culvenor and Fitzgerald, 1963).
b. Uji Flavonoid
Beberapa tetes lapisan air pada plat tetes ditambah 1-2 butir logam
magnesium dan beberapa tetes asam klorida pekat. Terjadinya warna jingga,
merah muda sampai merah menandakan adanya senyawa flavonoid
(Harborne,1987).
c. Uji Fenolik
Beberapa tetes lapisan air pada plat tetes ditambah 1–2 tetes larutan besi
(III) klorida 1%. Bila terbentuk warna biru/ungu, berarti terdapat senyawa fenolik
(Harborne,1987).
d. Uji Saponin
Lapisan air dalam tabung reaksi dikocok. Apabila terbentuk busa yang
bertahan selama 5 menit, berarti positif adanya saponin (Harborne,1987).
e. Uji Terpenoid dan Steroid
Lapisan kloroform disaring melalui pipet yang berisi norit. Hasil saringan
dipipet 2–3 tetes dan dibiarkan mengering pada plat tetes. Setelah kering
ditambahkan pereaksi Liebermann-Bourchard (2 tetes asam asetat anhidrat dan 1
tetes asam sulfat pekat). Terbentuknya warna merah berarti positif adanya
terpenoid dan warna hijau-biru berarti positif adanya steroid (Harborne,1987).
3.3.3 Ekstraksi Sampel
Sampel kering daun sirih merah sebanyak 3,3 kg, dimasukkan ke dalam
botol gelap dan terlindung dari cahaya. Sampel kemudian direndam dengan
30
pelarut metanol selama 5 hari, sambil sesekali diaduk. Setelah 5 hari, kemudian
dilakukan penyaringan, untuk memisahkan maserat dengan ampas sampel.
Maserasi dilakukan dengan 3 kali pengulangan. Hasil maserasi dari tiga kali
pengulangan digabung, kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary
evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental metanol.
3.3.4 Pengujiaan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kental Metanol
Ekstrak kental metanol selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas
antioksidan. Uji aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode DPPH
(1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) (Zhang, et al., 2006) pada panjang gelombang 517
nm. Ekstrak metanol sebanyak 2 mg dilarutkan dalam 2 mL metanol sehingga
konsentrasi sampel menjadi 1000 µg/mL. Baris A dimasukkan sampel sebanyak
100 µL (plate terdiri dari baris A-H masing-masing berjumlah 12 sumur).
Sebanyak 50 µL metanol dimasukkan pada masing-masing sumur pada baris B-F.
Baris A dipipet sebanyak 50 µL dan dimasukkan kebaris B, baris B dipipet 50 µL
baris C dan dilakukan sampai kebaris F, baris F dipipet 50 µL dan dibuang,
sehingga diperoleh masing-masing konsentrasi 1000, 500, 250, 125, 62,5 dan
31,25 µg/mL. Sedangkan baris G-H diisi dengan MeOH 50 µl. Baris A-G
ditambahkan DPPH sebanyak 80 µL dengan konsentrasi 80 µg/mL, kemudian
diinkubasi selama 30 menit.
Aktivitas penangkapan radikal diukur sebagai penurunan absorbansi DPPH
dengan microplate reader. Kontrol positif yang digunakan sebagai pembanding
yaitu asam askorbat. Asam askorbat diambil 2 mg kemudian dilarutkan dengan 2
31
ml metanol p.a. sehingga didapat konsentrasi dengan konsentrasi 100, 50, 25,
12,5, 6,25, 3,125 µg/mL (Zhang et al, 2006).
3.3.4 Fraksinasi Ekstrak Kental Metanol
Ekstrak kental metanol sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
sebanyak 353,379 gram dihomogenkan dengan aquadest sampai menjadi cairan
yang mudah dituang, dan kemudian difraksinasi dalam corong pisah. Fraksinasi
dilakukan terhadap tiga pelarut berdasarkan tingkat kepolaran yang berbeda.
Pertama, fraksinasi dilakukan dengan pelarut n-heksan yang bersifat non polar,
dengan penambahan n-heksan sebanyak 200 ml dengan tiga kali pengulangan,
kemudian dikocok dan didiamkan hingga terbentuk dua lapisan yang terdiri dari
fraksi n-heksan disebelah atas dan fraksi air dibagian bawah corong pisah,
kemudian selanjutnya dipisahkan. Fraksi air dipisahkan melalui kran bagian
bawah corong pisah, sedangkan fraksi n-heksan dituang dari mulut atas corong
pisah. Fraksinasi dilakukan berulang-ulang sampai ekstrak terfraksi sempurna
yang ditandai dengan telah berkurangnya intensitas kepekatan warna dari fraksi n-
heksan. Fraksi n-heksan hasil beberapa pengulangan ini dikumpulkan dan
dipekatkan dengan rotary evaporator untuk mendapatkan fraksi kental n-heksan.
Selanjutnya, lapisan air ditambah atau difraksinasi dengan pelarut etil
asetat sebanyak 100 ml dengan tiga kali pengulangan kemudian dikocok dan
didiamkan hingga terbentuk dua lapisan yang terdiri dari fraksi etil asetat dan
fraksi air, selanjutnya dipisahkan sebagaimana prosedur fraksinasi dengan pelarut
n-heksan. Fraksinasi dilakukan sebanyak tiga kali atau sampai ekstrak terfraksi
sempurna. Fraksi etil asetat hasil beberapa pengulangan fraksinasi ini
32
dikumpulkan dan dipekatkan dengan rotary evaporator untuk mendapatkan fraksi
kental etil asetat. Setelah di peroleh fraksi kental etil asetat, kemudian fraksi
tersebut dilakukan pengujian terhadap aktivitas antioksidan.
3.3.5 Pengujiaan Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat
Fraksi etil asetat sebanyak 2 mg dilarutkan dalam 2 mL metanol sehingga
konsentrasi sampel 1000 µg/mL. Baris A dimasukkan sampel sebanyak 100 µL.
Sebanyak 50 µL metanol dimasukkan pada masing-masing sumur pada baris B-F.
Baris A dipipet sebanyak 50 µL dan dimasukkan kebaris B, baris B dipipet 50 µL
baris C dan dilakukan sampai kebaris F, baris F dipipet 50 µL dan dibuang,
sehingga diperoleh masing-masing konsentrasi 1000, 500, 250, 125, 62,5 dan
31,25 µg/mL. Sedangkan baris G-H diisi dengan MeOH 50 µl. Baris A-G
ditambahkan DPPH sebanyak 80 µL dengan konsentrasi 80 µg/mL, kemudian
diinkubasi selama 30 menit.
Aktivitas penangkapan radikal diukur sebagai penurunan absorbansi
DPPH. Kontrol positif yang digunakan sebagai pembanding yaitu asam askorbat.
Asam askorbat diambil 2 mg kemudian dilarutkan dengan 2 ml metanol p.a.
didapat larutan dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 µg/mL (Zhang et
al, 2006).
3.4.6 Pemisahan dengan Kromatografi Kolom
Untuk memisahkan senyawa-senyawa yang ada di dalam fraksi etil asetat
dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom. Ukuran diameter kolom yang
digunakan yakni 3 cm dan panjang 30 cm, kromatografi kolom diisi dengan silika
gel 60. Pengisian kolom dilakukan dengan membuat bubur silika terlebih dahulu,
33
lalu dimasukkan ke dalam kolom dengan menggunakan corong, kemudian dielusi
sampai kerapatan silika di dalam kolom maksimum. Ekstrak yang akan dipisahkan
dilakukan preadsorpsi dan dimasukkan dalam kolom. Kemudian dielusi secara
bergradien menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat dan metanol. Pemisahan
dilakukan dengan bantuan gaya gravitasi.
Hasil pemisahan ditampung dalam vial dan diberi nomor. Hasil tetesan
pada kolom ditampung pada vial minimal setengah dari besar vial. Hasil fraksi
dimonitoring dengan KLT pada jarak tertentu, dan fraksi dengan pola KLT yang
sama digabungkan. Vial-vial yang dihasilkan dari kromatografi kolom ini
sebanyak 662 vial.
3.3.6 Pengujian Hasil Kromatografi Kolom dengan KLT
Hasil pemisahan kromatografi kolom dilakukan uji KLT. Vial-vial yang
akan diuji ini diambil secara acak setiap 5 vial, selanjutnya plat KLT diberi garis
0,5cm ditepi atas dan bawahnya, lalu masing-masing fraksi di totolkan pada plat
yang telah diberi nomor sesuai dengan nomor vial kemudian dielusi dengan eluen
yang sesuai sampai garis atas plat KLT, plat dikeluarkan dan dikeringkan. Untuk
melihat noda yang dihasilkan dapat dilakukan dengan penyinaran lampu UV. Vial
yang mempunyai pola noda yang sama dapat digabungkan menjadi satu fraksi.
Hasil penggabungan berdasarkan pola kromatografi kolom ini dihasilkan 17 fraksi
gabungan hasil kolom
3.3.7 Pengujiaan Aktivitas Antioksidan Fraksi Hasil Kromatografi Kolom
Fraksi gabungan 1-17 masing-masing diambil sebanyak 2 mg dilarutkan
dalam 2 mL metanol sehingga konsentrasi sampel menjadi 1000 µg/mL. Baris A
34
dimasukkan sampel sebanyak 100 µL. Sebanyak 50 µL metanol dimasukkan pada
masing-masing sumur pada baris B-F. Baris A dipipet sebanyak 50 µL dan
dimasukkan kebaris B, baris B dipipet 50 µL baris C dan dilakukan sampai kebaris
F, baris F dipipet 50 µL dan dibuang, sehingga diperoleh masing-masing
konsentrasi 1000, 500, 250, 125, 62,5 dan 31,25 µg/mL. Sedangkan baris G-H
diisi dengan MeOH 50 µl. Baris A-G ditambahkan DPPH sebanyak 80 µL dengan
konsentrasi 80 µg/mL, kemudian diinkubasi selama 30 menit. Aktivitas
penangkapan radikal bebas diukur sebagai penurunan absorbansi DPPH.
Kontrol positif yang digunakan adalah asam askorbat. Asam askorbat
diambil 2 mg kemudian dilarutkan dengan 2 metanol p.a. untuk mendapatkan
konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 µg/mL (Zhang et al, 2006). Pengujian
antioksidan dilakukan terhadap masing-masing fraksi gabungan kromatografi
kolom. Kemudian setelah didapatkan fraksi-fraksi yang aktif antioksidan, fraksi-
fraksi tersebut dilanjutkan ketahapan isolasi selanjutnya.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
Senyawa murni hasil isolasi yang didapat dilakukan berbagai macam
pemeriksaan untuk mengidentifikasi senyawa hasil isolasi tersebut. Pemeriksaan
identifikasi tersebut meliputi :
1. Pemeriksaan organoleptis
Pemeriksaan ini dilakukan secara visual dengan mengamati sifat-sifat yang
dapat diketahui dengan bantuan indera seperti bentuk, warna dan bau senyawa
hasil isolasi. Bentuk senyawa hasil isolasi dilihat di bawah mikroskop dengan
perbesaran tertentu.
35
2. Pemeriksaan sifat kimia
Pemeriksaan ini dilakukan dengan mereaksikan senyawa hasil isolasi dengan
pereaksi tertentu yang menunjukkan golongan senyawa kimia.

3. Pemeriksaan sifat fisika
Pemeriksaan ini meliputi pemeriksaan sifat kelarutan dan titik leleh senyawa
hasil isolasi. Pemeriksaan titik leleh dilakukan dengan menggunakan alat melting
point apparatus. Beberapa butir kristal senyawa diletakkan diantara dua kaca
objek, kemudian diletakkan dibawah kaca pembesar dan diatur kenaikan suhunya.
Amati perubahan fisik zat, pencatatan suhu dilakukan saat kristal mulai meleleh
hingga meleleh sempurna.

4. Identifikasi senyawa murni
Identifikasi senyawa murni yang diperoleh dilakukan dengan analisa
spektrofotometer UV yang dilakukan dengan cara senyawa murni sebanyak 1 mg,
lalu dilarutkan dengan metanol p.a sampai larut sempurna. Kemudian lakukan
proses kalibrasi terhadap alat spektrofotometer UV dengan pelarut methanol,
dengan memasukkan metanol pada kedua kuvet. Setelah proses kalibrasi, pelarut
metanol dikeluarkan dari salah satu kuvet dan ganti dengan senyawa murni yang
akan diuji titik lelehnya. Pengukuran sampel dilakukan pada panjang gelombang
200-400 nm. Setelah hasil didapatkan, diamati puncak yang muncul.
Identifikasi lainnya untuk senyawa murni dilakukan dengan mengambil data
spektrum infra merah (IR) dengan alat spektrofotometer inframerah,
menggunakan teknik KBr pelet yaitu dengan cara sejumlah padatan sampel
senyawa murni digerus dalam mortal kecil bersamaan dengan padatan kristal KBr
kering dalam jumlah sedikit (0,5-2 mg sampel + 100 mg KBr kering). Prinsip
kerja Spektrofotometri IR adalah sama dengan Spektrofotometer yang lainnya
36
yaitu interaksi antara energi dengan suatu materi. Spektofotometer IR berfokus
pada radiasi elektromagnetik pada rentang bilangan gelombang 400-4000 cm-1.
3.3.9 Uji Aktivitas Antiokisidan Senyawa Murni

Uji aktivitas antioksidan senyawa murni dilakukan menggunakan metode
DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) (Zhang et al, 2006) pada panjang
gelombang 520 nm. Senyawa murni masing-masing sebanyak 2 mg dilarutkan
dalam 2 mL metanol sehingga konsentrasi sampel menjadi 1000 µg/mL. Baris A
dimasukkan sampel sebanyak 100 µL Sebanyak 50 µL metanol dimasukkan pada
masing-masing sumur pada baris B-F. Baris A dipipet sebanyak 50 µL dan
dimasukkan kebaris B, baris B dipipet 50 µL baris C dan dilakukan sampai kebaris
F, baris F dipipet 50 µL dan dibuang, sehingga diperoleh masing-masing
konsentrasi 1000, 500, 250, 125, 62,5 dan 31,25 µg/mL. Sedangkan baris G-H
diisi dengan MeOH 50 µl. Baris A-G ditambahkan DPPH sebanyak 80 µL dengan
konsentrasi 80 µg/mL, kemudian diinkubasi selama 30 menit.

Aktivitas penangkapan radikal diukur sebagai penurunan absorbansi DPPH
pada microplate reader. Kontrol positif yang digunakan sebagai pembanding yaitu
asam askorbat dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 µg/mL. Pengujian
aktivitas antioksidan dilakukan terhadap ekstrak metanol daun sirih merah, fraksi
etil asetat dan setiap fraksi hasil penggabungan kromatografi kolom dengan
prosedur yang sama. Nilai % inhibisi dihitung dengan rumus sebagai berikut :
sampel
A
❑kontrol−¿
¿
A
¿ ❑
¿
Hambatan=¿
Ket : A Kontrol = Absorbansi tidak mengandung sampel
A
Sampel = Absorbansi sampel
37
Kekuatan antioksidan konsentrasi maksimum uji 1000 µg/mL (Zhang et al.,
2006) yaitu :
Tabel 1. Tingkat Kekuatan Antioksidan dengan metode DPPH
Kekuatan Nilai IC50

Sangat kuat .< 50 µg/mL
Kuat 50-100 µg/mL
Sedang 100-250 µg/mL
Lemah 250-500 µg/mL
Tidak aktif > 500µg/mL
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan terhadap isolasi dan pengujian
aktivitas antioksidan dari fraksi-fraksi dan senyawa murni hasil isolasi dari daun
sirih merah ini, didapatkan hasil sebagai berikut:
1. Sortasi kering dari 5,7 kg sampel kering daun sirih merah (Piper crocatum
Ruiz & Pav) didapat 4,2 kg sampel uji. Sebanyak 3,3 kg dari sampel uji ini
kemudian di maserasi menggunakan metanol selama 5 hari dengan 3 kali
pengulangan. Didapat ekstrak kental metanol sebanyak 517, 558 gram
(15,684 %). Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak metanol ini
memberikan nilai IC50 sebesar 216,76 µg/ml. Sedangkan hasil uji fitokimia
sampel kering dan ekstrak metanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav.) positif mengandung senyawa terpenoid.
38
2. Sejumlah 353,379 gram ekstrak kental metanol difraksinasi dengan n-
heksan, etil asetat, dan butanol, didapat fraksi kental n-heksan sebanyak
131,097 gram (37,098 %), etil asetat sebanyak 36,349 gram (10,286), dan
butanol sebanyak 24,016 gram (6,796 %) (Lampiran 4). Pengujian
aktivitas antioksidan terhadap fraksi etil asetat didapatkan nilai IC50 sebesar
41,51 µg/ml (Lampiran 2). Sedangkan profil KLT fraksi kental etil asetat
ini dengan eluen n-heksana : etil asetat (9:1), n-heksan : etil asetat (6:4), n-
heksan : etil asetat (2:8), dibawah lampu UV pada panjang λ254 nm terlihat
pada Lampiran 6.
3. Pemisahan fraksi kental etil asetat sebanyak 7,713 gram dengan metode
kromatografi kolom dengan eluen secara SGP sampai pada eluen n-
heksana: etil asetat (1:1), diperoleh 17 fraksi gabungan hasil kromatografi
kolom yaitu F1-F17 berdasarkan pola pemisahan KLT nya (Lampiran 4).
4. Aktivitas antioksidan fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom didapatkan
nilai IC50 untuk fraksi F5 sebesar 1475,32 µg/ml, F6 sebesar 5778,65
µg/ml, F7 sebesar 2613,75 µg/ml, F8 sebesar 319,86 µg/ml, F9 sebesar
34,76 µg/ml, F10 sebesar 30,90 µg/ml, F11 sebesar 1,83 µg/ml, F12
sebesar 99,69 µg/ml, F13 sebesar 232,78 µg/ml, F14 sebesar 59,47 µg/ml,
F15 sebesar 163,52 µg/ml, F16 sebesar 30,90 µg/ml, dan F17 sebesar
47,17 µg/ml (Lampiran 12-24). Sedangkan pengujian aktivitas
antioksidan fraksi F1-F5 tidak dapat dilakukan karena jumlah sampel
sangat sedikit sehingga tidak mencukupi untuk pengujian.
39
5. Pemisahan fraksi F12 dan fraksi F14 dengan cara pencucian dan
rekristalisasi dihasilkan dua senyawa murni yang diberi label senyawa
SMF12 dan SMF14, dengan titik leleh masing-masing 160-1620C dan 155-
1570C, dan kedua senyawa tersebut larut dalam etil asetat dalam metanol.
(Lampiran 25).
6. Hasil identifikasi senyawa murni F12 dalam metanol dengan menggunakan
spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200-400 nm menunjukkan
puncak serapan maksimum pada panjang gelombang 265,00 nm dengan
nilai absorbansi sebesar 0,462. (Lampiran 26). Spektrum inframerah
senyawa ini memperlihatkan serapan pada bilangan gelombang 2967, 1617
dan 1425 cm-1. (Lampiran 27). Uji aktivitas antioksidan senyawa murni
SMF12 memberikan nilai IC50 sebesar 1066,27 µg/ml (Lampiran 25).
7. Spektrofotometer UV senyawa SMF14 menunjukkan puncak serapan
maksimum pada panjang gelombang 265,00 nm dengan nilai absorbansi
sebesar 0,263. (Lampiran 28) dan hasil analisis spektrum inframerah dari
senyawa ini terlihat serapan pada bilangan gelombang 3438, 2937, 1684
dan 1458 serta pada 1236 cm-1 (Lampiran 29). Sedangkan uji aktivitas
antioksidan senyawa murni SMF14 ini memberikan nilai IC50 sebesar
923,8701µg/ml (Lampiran 26).
4.2 Pembahasan
Daun tumbuhan sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) kering sebanyak
5,7 kg diambil dari Yogyakarta pada bulan April 2016. Pembuatan simplisia
40
dimulai dengan melakukan sortasi kering untuk memisahkan batang dan daun dari
tumbuhan sirih merah serta membersihkan dari pengotor yang menempel.
Kemudian diperkecil ukurannya dengan menggunakan blender hingga berbentuk
serbuk untuk memperluas permukaan simplisia, sehingga difusi zat aktif yang ada
didalam sel pada saat penyarian lebih mudah dan cepat. Simplisia yang diperoleh
sebanyak 4,2 kg.
Simplisia sebanyak 3,3 kg diekstraksi menggunakan metode maserasi
dengan pelarut metanol selama 5 hari dengan 3 kali pengulangan. Maserasi dipilih
karena merupakan metode ekstraksi yang sederhana serta dapat menarik zat-zat
berkhasiat dari simplisa, baik simplisia yang tahan panas maupun yang tidak tahan
pemanasan. Kemudian dilakukan pemisahan ampas dengan maserat yang disaring
menggunakan kapas, sehingga didapatkan ekstrak cair metanol daun sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav).
Dari proses ekstraksi tersebut diperoleh ekstrak cair metanol yang kemudian
dipekatkan menggunakan rotary evaporator dengan penurunan tekanan sehingga
pelarut dapat menguap dibawah titik didihnya. Hal ini sangat menguntungkan
terutama menghindari rusaknya senyawa-senyawa termolabil oleh proses
pemanasan. Pemekatan dengan rotary evaporator ini diperoleh ekstrak kental
metanol sebanyak 517,558 (353,379) gram dengan rendemen 15,6835 %. Ekstrak
metanol kemudian dilakukan pengujian antioksidan dan memberikan persen
inhibisi sebesar 85,173 % pada konsentrasi 1000 µg/mL dengan nilai IC 50 sebesar
216,76 µg/ml dimana tergolong pada kategori aktivitas antioksidan sedang, hal ini
masih memberikan kesempatan untuk dilanjutkan proses fraksinasi. Selanjutnya
41
ekstrak kental metanol dilanjutkan dengan proses fraksinasi untuk
mengelompokkan komponen senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya.
Fraksinasi dilakukan dengan beberapa pelarut yang berbeda tingkat
kepolarannya dengan pengulangan pada masing-masing pelarut sebanyak tiga kali.
Ekstrak kental metanol sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) sebanyak
353,379 gram dihomogenkan dengan aquadest untuk melarutkan ekstrak menjadi
cairan yang mudah dituang, dan kemudian difraksinasi dalam corong pisah.
Pertama, fraksinasi dilakukan dengan pelarut n-heksan yang bersifat non polar,
dengan penambahan n-heksan sebanyak 300 ml dengan tiga kali pengulangan,
ketiga fraksi hasil fraksinasi dengan pelarut n-heksan ini selanjutnya digabung.
Residu sisa hasil fraksinasi dengan n-heksan selanjutnya difraksinasi
menggunakan pelarut etil asetat sebanyak 300 ml untuk menarik zat-zat atau
komponen senyawa metabolit yang bersifat semi polar. Proses fraksinasi ini juga
dilakukan tiga kali pengulangan dengan jumlah pelarut sama dan hasil ketiga
fraksi juga digabung (Lampiran 3).
Fraksi etil asetat gabungan ini selanjutnya dipekatkan menggunakan rotary
evaporator dengan penurunan tekanan untuk mempertahankan senyawa-senyawa
yang bersifat termolabil, dan didapat fraksi kental etil asetat sebanyak 36,349
gram. Kemudian fraksi etil asetat dan fraksi butanol dilakukan pengujian
antioksidan dengan metoda DPPH menggunakan microplate reader, dari hasil
pengujian ini fraksi etil asetat memberikan persen inhibisi sebesar 91,565 % pada
konsentrasi 1000 µg/mL dengan nilai IC50 sebesar 41,51 µg/ml. Nilai IC50 ini
menunjukkan aktivitas antioksidan yang tergolong kategori sangat kuat,
42
sedangkan dari hasil pengujian pada fraksi butanol memberikan persen inhibisi
sebesar 34,33 % pada konsentrasi 1000 µg/mL dengan nilai IC50 sebesar 13,99
µg/ml. Potensi aktivitas yang sangat kuat ini memberikan peluang untuk
dilanjutkan ke tahap isolasi senyawa murni (Lampiran 4).
Selanjutnya fraksi kental etil asetat ini dilakukan uji KLT untuk melihat pola
senyawa yang terdapat pada fraksi tersebut dan menentukan eluen yang sesuai
yang sesuai untuk pemisahan lebih lanjut. Sebanyak 7,713 gram fraksi etil asetat
selanjutnya dipisahkan dengan teknik kromatografi kolom (dimensi kolom 30 cm
x 3 cm id.) menggunakan perbandingan eluen secara SGP (Step Gradient Polarity)
yang dimulai dengan pelarut non polar (n-heksana), pelarut semi polar (etil asetat)
dan pelarut polar (butanol). Peningkatan kepolaran eluen dilakukan apabila pita
atau pola noda yang turun dengan eluen sebelumnya telah terelusi dan ditampung
dalam vial. Volume pelarut yang digunakan untuk mengelusi bervariasi tergantung
kebutuhan untuk menurunkan pita pada kolom yang dielusi.
Hasil kromatografi kolom ini ditampung dalam vial kemudian dibiarkan
menguap dan sebanyak 662 vial diperoleh yang selanjutnya vial-vial ini dimonitor
dengan KLT setiap jarak 5 vial, pola noda diamati dibawah lampu UV. Setiap
fraksi yang memiliki pola noda yang sama digabung dan diperoleh 17 fraksi
gabungan. 17 Fraksi gabungan tersebut diberi label F1-F17. Fraksi F1 (vial 1-10),
F2 (vial 11-25), F3 (vial 26-80), F4 (vial 81-97), F5 (vial 98-179), F6 (vial 180-
210), F7 (211-240), F8 ( 241-290), F9 (vial 291-300), F10 (vial 301-340), F11
(vial 341-405), F12 (vial 406-470), F13 (vial 471-530), F14 (vial 531-564), F15
(vial 565-610), F16 (vial 611-625) dan F17 (vial 626-662). Fraksi gabungan ini
43
kemudian dimonitor kembali dengan KLT. Pengamatan pola KLT dari masing-
masing fraksi yang didapat, belum memperlihatkan terdapatnya senyawa yang
telah terpisah tunggal, tetapi masih berupa campuran dari beberapa senyawa
(Lampiran 4).
Selanjutnya fraksi gabungan dilakukan pengujian antioksidan menggunakan
metoda DPPH. Pengujian dilakukan terhadap masing-masing fraksi gabungan
kromatografi kolom dimulai dari pengujian kepada F5 sampai F17. Sedangkan
fraksi F1 sampai dengan F4 tidak dilakukan pengujian antioksidan dikarenakan
jumlah fraksi yang diperoleh sangat sedikit dan tidak memungkinkan untuk
dilanjutkan ke tahapan isolasi. Hasil pengujian antioksidan fraksi gabungan ini
memperlihatkan bahwa masing-masing fraksi memberikan aktivitas
penghambatan radikal DPPH yang berbeda-beda pada konsentrasi 1000 µg/mL.
Jika dibandingkan dengan nilai IC50 dari asam askorbat atau vitamin C
sebagai kontrol positif yaitu sebesar 6,66 µg/ml, maka dapat disimpulkan bahwa
aktivitas antioksidan dari ekstrak metanol tergolong sangat lemah, aktivitas fraksi
etil asetat tergolong sangat kuat. Sedangkan untuk fraksi gabungan F5-F7 tidak
aktif sebagai antioksidan, fraksi F8 tergolong lemah, fraksi F9-F11 dan F16-F17
tergolong sangat kuat, F12 dan F14 tergolong kuat, F13 dan F15 tergolong
beraktivitas antioksidan sedang.
Fraksi F9-F11 dan F16-F17 tergolong mempunyai aktivitas antioksidan yang
sangat kuat, tetapi jumlah senyawa dalam vial gabungan sangat sedikit sehingga
tidak memungkinkan untuk dilanjutkan pemisahan menjadi senyawa murni. 2
Fraksi lain yang memberikan aktivitas antioksidan yang kuat yaitu fraksi
44
gabungan F12 dan F14 dan masing-masing fraksi juga memperlihatkan
pembentukan padatan berbentuk amorf, dan padatan berbentuk bunga yang
menempel pada dinding-dinding vial. Disamping itu, pola noda juga
memperlihatkan pola noda yang dominan dan sangat memungkinkan untuk
diisolasi menjadi senyawa murni.
Fraksi F12 dan fraksi F14 masih terlihat bercampur dengan pengotor
berwarna hijau sehingga diperlukan proses pemurnian lebih lanjut yaitu dengan
pencucian. Kedua fraksi ini larut dalam etil asetat dan sukar larut dalam n-heksan,
fraksi ini kemudian dimurnikan dengan cara pencucian untuk menghilangkan
pengotornya. Prinsip pencucian dilakukan dengan cara melarutkan senyawa
dengan pelarut yang tidak melarutkan. Tujuan dari pencucian ini adalah untuk
melarutkan pengotor yang terdapat pada senyawa target. Pencucian dilakukan
dengan melarutkan senyawa dengan n-heksan, tujuannya adalah untuk
menghilangkan pengotor yang masih terdapat pada senyawa target. Proses
pencucian ini diulang beberapa kali sehingga didapatkan dua senyawa murni yang
dimonitor kembali pada plat KLT dibawah lampu UV λ254 nm dan UV λ366 nm, yang
menunjukan satu pola noda yang baik tanpa ada noda lain yang mengganggu.
Untuk lebih memastikan bahwa kedua senyawa isolat sudah merupakan
senyawa murni dilakukan kembali pengecekan pemisahan pola noda dengan KLT
menggunakan 3 perbandingan eluen berbeda yaitu campuran n-heksana : etil
asetat (2:3), etil asetat 100% dan eluen etil asetat : methanol (3:2). Kedua
senyawa murni tetap memperlihatkan pola pemisahan noda yang sama yaitu untuk
senyawa F12 memberikan nilai Rf sebesar 0,625, 0,75 dan 0,8 sedangkan senyawa
45
murni F14 juga memperlihatkan pola pemisahan yang tetap satu noda dengan
menggunakan 3 perbandingan eluen yang sama yaitu dengan Rf sebesar 0,425, 0,7
dan 0,8. Senyawa ini juga boleh dikatakan telah murni (Lampiran 9)
Senyawa murni F12 dan F14 yang diperoleh diuji titik lelehnya
menggunakan alat Stuart melting point apparatus SMP-11. Dari uji ini diperoleh
hasil titik leleh untuk masing-masing senyawa murni F12 dan F14 adalah 160-
1620C dan 155-1570C yang berarti senyawa murni F12 dan F14 dapat dikatakan
murni karena jarak titik leleh tidak lebih dari 20C.
Hasil identifikasi senyawa murni F12 dan F14 dalam metanol dengan
menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200-400 nm
menunjukkan puncak serapan maksimum pada panjang gelombang 265,00 nm
dengan nilai absorbansi sebesar 0,462 dan untuk senyawa murni SMF12
(Lampiran 28) dan puncak serapan maksimum juga pada panjang gelombang
265,00 nm dengan nilai absorbansi sebesar 0,263 untuk senyawa SMF14
(Lampiran 30). Spektrum UV kedua senyawa ini sangat identik, tetapi hanya
berbeda dalam intensitas serapan.
Spektrum inframerah senyawa SMF12 dapat dilihat ada nya gugus C-H
alifatik pada daerah serapan pada bilangan gelombang 2967 cm-1; gugus C=O
(karbonil) pada daerah serapan 1617 cm-1; gugus C-H pada daerah serapan 1425
cm-1. (Lampiran 29). Sedangkan spektrum inframerah senyawa SMF14 terlihat
adanya gugus N-H pada daerah serapan 3438 cm-1; gugus C-H alifatik pada daerah
serapan 2937 cm-1; gugus C=O (karbonil) pada daerah serapan 1684 cm-1 dan
46
gugus C-H pada daerah serapan 1458 cm-1; gugus C-O pada daerah serapan 1236
cm-1. Lampiran 31).
Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas antioksidan terhadap senyawa
murni F12 dan F14. Aktivitas antioksidan senyawa murni hasil isolasi F12
memberikan persen inhibisi sebesar 48,51 % pada konsentrasi 1000 µg/mL
dengan nilai IC50 sebesar 1066,27 µg/ml. Aktivitas antioksidan senyawa murni
F12 ini tergolong tidak aktif sebagai antioksidan. Sedangkan aktivitas antioksidan
senyawa murni hasil isolasi F14 memberikan persen inhibisi sebesar 51,1047 %
pada konsentrasi 1000 µg/mL dengan nilai IC 50 sebesar 923,8701 µg/ml.
Berdasarkan nilai IC50 senyawa murni F14 juga tergolong tidak aktif sebagai
antioksidan. Hal ini terlihat berbeda nyata jika dibandingkan dengan nilai IC50 dari
asam askorbat atau vitamin C digunakan sebagai kontrol pembanding positif pada
pengujian antioksidan, dan jugasangat berbeda signifikan dengan nilai IC50 dari
ekstrak kental metanol dan juga fraksi kental etil asetat. Hal ini bisa saja
disebabkan karena pada ekstrak maupun fraksi masih merupakan gabungan dari
beberapa senyawa sedangkan pada senyawa murni hanya memiliki satu senyawa
tunggal,bisa jadi gabungan dari beberapa senyawa tersebut menyebabkan aktif
antioksidan.
47
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Penelitian yang telah dilakukanterhadap isolasi senyawa dari fraksi etil
asetat daun tumbuhan sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) telah berhasil
diperoleh dua senyawa murni yang diberi label senyawa SMF12 dan SMF14.
SMF12 berwarna putih dan berbentuk bunga, larut dalam etil asetat dan metanol,
sedangkan SMF14 berbentuk kistal jarum yang berwarna putih, larut dalam etil
asetat dan sangat mudah larut dalam methanol. Adapun titik leleh senyawa SMF12
adalah 160-1620C dan untuk senyawa SMF14 mempunyai titik leleh sebesar 155-
1570C.
Pengujian aktivitas antioksidan senyawa murni F12 dan F14, memberikan
persen inhibisi sebesar 48,51 % dengan nilai IC 50 sebesar 1066,27 µg/ml untuk
48
senyawa SMF12. Sedangkan aktivitas antioksidan senyawa murni hasil isolasi
SMF14 memberikan persen inhibisi sebesar 51,1047 % dengan nilai IC 50 sebesar
923,8701 µg/ml. Berdasarkan nilai IC50 senyawa murni SMF12 dan senyawa
SMF14 tergolong tidak aktif sebagai senyawa antioksidan.
5.2 SARAN
Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk dapat melakukan
karakterisasi terhadap kedua senyawa murni hasil isolasi SMF12 dan SMF14
untuk melakukan uji aktivitas biologis lainnya terhadap kedua senyawa hasil
isolasi tersebut, dan juga terhadap fraksi-fraksi lain yang menunjukkan nilai
aktivitas antioksidan yang kategori sedang agar diperoleh senyawa-senyawa
murni yang aktif antioksidan.
49
DAFTAR PUSTAKA
Agoes, A, 2010, Tanaman Obat Indonesia, Salemba Medika, Jakarta.
Andarwulan, N., 1992, Kimia Vitamin, Edisi Pertama. Rajawali Press : Jakarta
Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan I,

Departemen Kesehatan RI, Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan
Makanan, Jakarta.
Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan RI,

Jakarta.
Anonim., 2000, The Merck Index of Chemical and Drugs. New York : Merck and
Co.
Anonim., 2007, Antioksidan dan Peranannya Bagi Kesehatan, www. beritaiptek.

com, Akses 13 juli 2015.
Artha, A., 2016, Isolasi Metabolit Sekunder dan Uji Aktivitas Sitotoksik dari
Ekstrak n-Heksan Daun Sirih Merah, Skripsi Sekolah Tinggi Ilmu
Farmasi Riau, Pekanbaru.
Backer, C.A., Den Brink van B.J.R., 1963, Flora of Java, Published Under The
Auspices of the Rijksherbarium, Leyden. p. : 167. Biodiversitas Vol.8,
No.2. Hal. 136-137.
50
Burda, S and Oleszek, W., 2001, Antioxidant and Antiradical Activities of
Flavonoids, Journal Agric Food Chemistry, Vol.49:2774-2779.
Cahyadi, W., 2006, Analisis dan Aspek Kesehatan Bahan Tambahan Makanan,
Penerbit Bumu Aksara, Jakarta.
Cheng, Y., Wang, Y. & Wang, X., W. (2006). A Causal Relationship Discovery
Based Approach To Identifying Active Components Of Herbal Medicine.
omputational Biology and Chemistry, 30, 146-154.
Damayanti, R., dan Mulyono, 2006, Khasiat dan Manfaat Daun Sirih Obat
Mujarab dari Masa ke Masa, Agro Media Pustaka, Jakarta, 1-12.
Djamal,R.,1998,Prinsip-Prinsip Dasar Isolasi dan Identifikasi, Universitas

Baiturrahmah, Padang.
Duryatmo S. 2005. Dulu Hiasan Kini Obat. Trubus. 427: 37.
Emrizal, Fernando, A, Yuliandari, R, Rullah, k., Indrayani, N.R., Susanty, A.,

Yetri, R., Ahmad, F., M, Hasnah, Sirat and Arbain, D., 2014, Cytotoxic
Activities of Fractions and Two Isolated Compounds from Sirih Merah
(Indonesian red betel), Piper crocatum Ruiz & Pav, J. Procedia
Chemistry vol 13 hal 79-84.
Gitawati, R., 1995, Radikal Bebas, Sifat dan Peran dalam Menimbulkan
Kerusakan atau Kematian Sel. Cermin Dunia Kedokteran. 102:33-36.
Harbone, J. B., 1987, Phytochemical Methods (Metoda Fitokimia), Terbitan II,

Diterjemahkan Oleh K. Padmawinata dan I. Soediro, ITB, Bandung.
Houghton, P.J., and R. Amala. 1998.Laboratory Handbook For The Fractionation

of Natural Extract. Chapman and Hall. London.
Irawan, C, 2009, Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Bioaktif Dalam Daun Sirih
Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav), Warta Akab No,22, 2009., Akademi
Kimia Analisis.
Lestari. A.B.S., Dwiatmaka.Y., 2014. “Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Sirih

Merah (Piper crocatum) Hasil Optimasi Pelarut Etanol-Air”. Jurnal Ilmu
Kefarmasian Indonesia. Vol. 12 (1).
Limawati, S, 2009, Perbandingan Daya Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Dan

Umbi Ketela Rambat (Ipomoea Batatas L.) Ungu Dari Pacet Mojokerto,
Skripsi tidak dipublikasikan, Surabaya, Skripsi Fakultas Farmasi
Universitas Surabaya.
51
Manoi, F., 2007, Sirih Merah Sebagai Tanaman Obat Multi Fungsi,
WartaPuslitbangbun ,Vol.13 No. 2, Agustus 2007.
Mardiana, L. 2004. Kanker pada Wanita : Pencegahan dan Pengobatan dengan

Tanaman Obat. Penebar Swadaya, Jakarta.
Meydani, S.N, D. Wu, M. S. Santos, dan M. G. Hayk., 1995, Antioxidants and

Immune Response in Aged Person: Overview of Present Evidence,
dalam: “The American Journal of Clinical Nutrion”, 62 :1462-1476.
Puzi.H.W.S., Lukmayani.Y., Dasuki.A.U., 2015”Isolasi dan Identifikasi Senyawa

Flavonoid dari Daun Tumbuhan Piper crocatum Sirih Merah (Ruiz & Pav)”.
Prosiding penelitian SPeSIA Unisba. ISSN 2460-6472.
Prakash, A., 2001, Antioxidant Activity, Analitical Progress: Medallion

Laboratories, Volume 19, No.2.
Ramelan, W., 2003, Antioksidan: Peranannya dalam Kedokteran, Jurnal

Kedokteran dan Farmasi, No. 6, 370-371.
Ratnan, D.V., Ankola, D.D., Bhardwaj, V., Sahana, D.K., dan Kumar M.N.V.R.,
2006. Role of Antioxidant In Propilaxis and Theraphy. A Pharmaceutical
Prespective. Journal of Controlles Release. 113: 189-207.
Robinson T., 1994, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, Terjemah oleh K.

Padmawinata, ITB Press, Bandung.
Safithri M, dan Fahma. 2005. Potensi Rebusan Daun Sirih Merah (Piper
crocatum) sebagai Senyawa Antihiperglikemia pada Tikus Putih Galur
Sprague Dawley. [laporan penelitian]. Bogor: LPPM IPB.
Salleh, W. M. N. H. W., Ferediah, A., Hasnah, M. S., Khong, H. Y., 2012,

Chemical Composition and Antibacterial Activity of the Leaf and Steem
Oils of Piper prophyrophillum (Lindl) N.E.Br. Faculty of Science,
University Tecnologi Malaysia, Malaysia.
Sarastani., Dewi., Suwarna, T., dan Soekarto., 2002, Aktivitas Antioksidan Ekstrak
dan Fraksi Biji Atung. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. volume 13,
no.2, 149-156.
Sarker, S. D., Latif, Z. & Gary. A. I. (2006a). Natural Product Isolation 2nd
Edition, Natural product isolation (pp 1-26). New Jersey: Humana press
lnc.
Sarker, S. D., Latif, Z. & Gary. A. I. (2006b). Isolation of Natural Product by

Low-Pressure Column Chromatography. 2nd Edition, Natural Product
Isolation (pp 117-158). New Jersey: Humana press Inc.
52
Sirait, M. (2007). Penuntun Fitokimia Dalam Farmasi. Penerbit IPB. Bandung.
Sudewo B. 2008. Basmi Penyakit dengan Sirih Merah. Agromedia Pustaka, 35-36.
Jakarta.
Sunarni,T., Pramono, S., Asmah, R., Flavonoid Antioksidan Penangkap Radikal

dari Daun Kepel (Stelechocarpus burahol (Bl.)Hook f.&Th.). Majalah
Farmasi Indonesia. 2007. 18(3): 111-16.
Tjitrosoepomo, G., 2005. Taksonomi Tumbuhan (Spermatophyta). UGM-Press,

Yogyakarta.
Vlietinck, A. J., Pieters, A. C. & Vander Berghe, D. A. (1995). Bioassay Guided

Isolation and Structure Elucidation of Pharmacologically Active Plant
Substances, Photochemistry in medicine plant (pp 113-132). New York:
Plenum press.
Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Cetakan ke-5 Kanisius.
Yogyakarta: 122-204.
Lampiran 1. Gambar Tumbuhan Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
53
Gambar 6. Tumbuhan Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
Gambar 7. Daun Tumbuhan Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
Lampiran 2. Hasil Uji Fitokimia Sampel Kering dan Ekstrak Metanol Daun Sirih
Tabel 2. Hasil Uji Fitokimia Sampel Kering dan Ekstrak Metanol Daun Sirih
Kandungan
No Pereaksi Sampel kering Ekstrak methanol
Kimia
54
1. Alkaloid Mayer (-) (-)
(tidak terbentuk (tidak terbentuk
endapan putih) endapan putih)
2. Flavonoid Logam Mg (-) (-)
+ HCl p (tidak terbentuk (tidak terbentuk
warna merah) warna merah)
3. Terpenoid LB (+) (+)
(warna merah (warna merah bata)
bata)
4. Steroid LB (-) (-)
warna hijau) warna hijau)
5. Fenolik FeCl3 (-) (-)
warna biru) warna biru)
6. Saponin Dikocok (-) (-)
sampai ( terbentuk busa) ( terbentuk busa)
terbentuk
busa
Keterangan :
LB : Liebermann-Burchard
+ : Bereaksi
- : Tidak bereaksi
Lampiran 3. Skema Kerja Ekstraksi dan Fraksinasi Daun Sirih Merah (Piper
3,3 kg simplisia kering daun
tumbuhan sirih merah (Piper
- Sortasi kering dan perajangan
- Maserasi dengan metanol selama 3 hari, lalu
disaring ( 3 x pengulangan)
Ekstrak cair metanol - Penyaringan maserat
- Dipekatkan dengan rotary evaporator
Ekstrak kental metanol

55
- 2mg ekstrak metanol diuji antioksidan
- Ekstrak dihomogenkan dengan aquadest
- Difraksinasi dengan n-heksan
(3 x pengulangan)
Fraksi n-heksan Fraksi air

- Ekstrak dihomogenkan dengan aquadest
- Difraksinasi dengan etil asetat
(3 x pengulangan)
Fraksi etil asetat Fraksi air

- 2 mg fraksi diuji antioksidan
- Dipekatkan dengan rotary evaporator
- Monitor dengan KLT
Kromatografi kolom
Gambar 8. Skema Kerja Ekstraksi Dan Fraksinasi Daun Sirih Merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav
56
Lampiran 4. Skema Kerja Isolasi Fraksinasi Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
7,713 g Fraksi etil asetat
Kolom (d=3cm dan p=30cm)

Fase diam :silika gel 60
Fase gerak :berbagai eluen (n-heksana-etil asetat) dengan
metode SGP
F1 F2 (11- F3 (26- F4 (81- F5* F6* F7* F8* F9* F10* F11* F12* F13* F14* F15* F16* F17*
(1-10) 25) 80) 97) (98- (180- (211- (241- (291- (301- (341- (406- (471- (531- (565- (611- (626-
179) 210) 240) 290) 300) 340) 405) 470) 530) 564) 610) 625) 662)
F12 (Vial 406- F14 (Vial 531-

470) 564)
Direkristalisasi
KLT ( 3 eluen yang berbeda)
Uji titik leleh dengan melting point apparatus
Senyawa murni
F12*,F14*
Spektrofotometri UV
Infra Red Identifikasi

KET:
*UJI ANTIOKSIDAN
Gambar 9. Skema Kerja Isolasi dan Fraksinasi Daun SirihMerah (Piper crocatumRuiz &Pav)
Lampiran 5. Skema Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Daun Sirih
Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) dengan Metode DPPH
Menggunakan Alat Microplate Reader.
2 mg sampel dilarutkan dalam 2 mL metanol (larutan

induk)
Pipet 100 μL dari larutan induk dan
masukkan ke baris A
50 μL Metanol ditambahkan pada baris B - H
Baris A dipipet 50 μL dan lalu dimasukkan ke

A baris B, baris B dipipet 50 μL dan masukkan ke
baris C dan seterusnya hingga pada baris ke F,
1000
B dan pada baris F dipipet 50 μL lalu dibuang
mg/mL
500
mg/mL C
250
mg/mL D
125
mg/mL E
62,5
-
mg/mL F
31,25 G H
mg/mL MeOH MeOH
+
DPPH
Tambahkan 80 μL DPPH dengan konsentrasi 80 μg/mL

pada baris A - G
- Diinkubasi selama 30 menit

- Diukur serapan pada panjang gelombang
520 nm
Microplate
Gambar 10. Skema Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Daun Sirih
Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) dengan Metode DPPH
Menggunakan Alat Microplate Reader.
59
Lampiran 6. Profil Kromatografi Lapis Tipis Fraksi Etil Asetat Daun Sirih Merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav.)
Keterangan Gambar :
(A) Fraksi Etil Asetat dengan Pelarut n-Heksan : Etil Asetat (9:1)
(B) Fraksi Etil Asetat dengan Pelarut n-Heksan : Etil Asetat (6:4)
(C) Fraksi Etil Asetat dengan Pelarut n-Heksan : Etil Asetat (2:8)
Gambar 11. Profil Kromatografi Lapis Tipis Fraksi Etil Asetat Daun Sirih Merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav.)
Lampiran 7. Profil Kromatografi Lapis Tipis Hasil Kolom Fraksi Etil Asetat
60
(Heksan : Etil 95:5)
(Heksan : Etil 90:10) (Heksan : Etil 85:15)

Lampiran 7. Lanjutan
61
Lampiran 7.Lanjutan
62
(Heksan : Etil 60:40) (Heksan : Etil 50:50)
Gambar 12. Gambar hasil KLT Kromatografi Kolom Di Bawah Lampu UV λ 254
Dengan Berbagai Eluen
Lampiran 8. Profil Kromatografi Lapis Tipis Hasil Kolom Fraksi Etil Asetat
63
Ket:
F-1 : Fraksi 1 (1-10)
F-2 : Fraksi 2 (11-25)
F-3 : Fraksi 3 (26-80)
F-4 : Fraksi 4 (81-97)
F-5 : Fraksi 5 (98-179)
F-6 : Fraksi 6 (180-210)
F-7 : Fraksi 7 (211-240)
F-8 : Fraksi 8 (241-290)
F-9 : Fraksi 9 (291-300)
Ket:
F-10 : Fraksi
10 (301-340)
F-11 : Fraksi
11 (341-405)
F-12 : Fraksi
12 (406-470)
F-13 : Fraksi
13 (475-530)
F-14 : Fraksi 14 (531-564)
F-15 : Fraksi 15 (565-610)
F-16 : Fraksi 16 (611-625)
F-17 : Fraksi 17 (626-662)
Gambar 13. Profil Kromatografi Lapis Tipis Hasil Kolom Fraksi Etil Asetat
64
Lampiran 9. Profil Kromatografi Lapis Tipis Senyawa SM F12dan SM F14
dengan Tiga Perbandingan Eluen Yang Berbeda
Keterangan Gambar :
(A) Pelarut n-Heksan : Etil Asetat (2ml-3ml)

(B) Pelarut Etil Asetat 100 % (5ml)
(C) Pelarut Etil Asetat : Metanol (3ml-2ml)
Gambar 14. Profil Kromatografi Lapis Tipis Senyawa SM F12dan SM F14

dengan Tiga Perbandingan Eluen Yang Berbeda.
65
Lampiran 10. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Asam Askorbat (Vitamin C)
1 2 3 Rata-rata Abs. DPPH

DPPH+MeOH 0.393 0.396 0.391 0.393 0.299
MeOH 0.098 0.093 0.092 0.094
Konsentrasi In Absorban Absorban Absorban %

IC50
µg/mL konsentrasi 1 2 3 rata-rata sampel inhibisi
100 4.60517 0.097 0.098 0.097 0.0973 0.0030 98.9967
50 3.91202 0.136 0.137 0.131 0.1347 0.0403 86.5106
25 3.21888 0.168 0.165 0.183 0.1720 0.0777 74.0245
6.6612
12.5 2.52573 0.206 0.205 0.204 0.2050 0.1107 62.9877
6.25 1.83258 0.253 0.254 0.255 0.2540 0.1597 46.5998
3.125 1.13783 0.282 0.282 0.283 0.2823 0.1880 37.1237
Keterangan :
 Abs kontrol : 0.299
 Abs sampel : 0.003
120
100
f(x) = 18.14x + 15.62
80 R² = 1
% Inhibisi
60
40
20
0
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
ln Konsentrasi
66
Gambar 15. Kurva Persamaan Regresi IC50 Asam Askorbat ( Vitamin C)
 Persen (%) inhibisi Asam askorbat (Vitamin C)

absorban kontrol−absorban sampel
% inhibisi ¿ x 100 %
absorban kontrol
0.299−0.003
0.299
= 98.9967 %
 Perhitungan IC50 asam askorbat (Vitamin C)
Y = 18.13LnX – 15.62
50 = 18.13LnX – 15.62
LnX = 1.8963
IC50 = Anti LnX = Anti Ln 1.8963
IC50 = 6.6612 µg/ml
67
Lampiran 11. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol
Konsentrasi Pengulangan Rata-rata Abs.sampel % inhibisi IC50

(ug/mL) 1 2 3 (ug/mL)
1000 0,139 0,135 0,132 0,135 0,0487 85,173
500 0,181 0,189 0,189 0,186 0,0997 69,647
250 0,234 0,231 0,234 0,233 0,1464 55,441 216,7661
125 0,286 0,282 0,283 0,284 0,197 40,018
62,5 0,357 0,358 0,359 0,358 0,2714 17,39
31,25 0,401 0,408 0,408 0,406 0,319 2,8792
Keterangan :
 Abs kontrol : 0,3285
 Abs sampel : 0,0487
90
80 f(x) = 24.06x - 79.41
70 R² = 0.99
60
50
% Inhibisi
40
30
20
10
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
Ln Konsentrasi
Gambar 16. Kurva Persamaan Regresi IC50 Ekstrak Metanol
68
 Persen (%) inhibisi ekstrak metanol

absorban kontrol
0,3285−0,0487
0,3285
= 85,173 %
 Perhitungan IC50 ekstrak metanol
Y = 24,059LnX – 79,409
50 = 24,059LnX – 79,409
LnX = 5,3788187
IC50 = Anti LnX = Anti Ln 5,3788187
IC50 = 216,7661 µg/ml
69
Lampiran 12. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan F5
Konsentr Pengulang Rat

asi an a- Abs % IC50
Rat Samp Inhibi
(µg/ml) 1 2 3 a el si (µg/ml)
0.30 0.30 0.30 0.30 0.222 47.10
1000 5 9 7 7 1 2 -
0.32 0.32 0.32 0.32 0.241 42.41
500 6 9 5 7 8 9
0.34 0.34 0.34 0.34 0.260 37.97
250 4 8 4 5 4 3
0.36 0.36 0.36 0.36 0.279 33.44
125 5 7 1 4 4 8
0.38 0.38 0.38 0.38 0.300 28.52
62.5 3 4 8 5 1 6
0.40 0.40 0.41 0.40 0.323 22.96
31.25 1 9 5 8 4 9
Keterangan :
70
50
45 f(x) = 6.88x - 0.19
R² = 1
40
35
30
% Inhibisi
25
20
15
10
5
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
Ln Konsentrasi
Gambar 17. Kurva Persamaan Regresi IC50 Fraksi 5
 Persen (%) inhibisi F5

absorban kontrol
0,4199−0,2221
0,32850,4199
= 47,102 %
 Perhitungan IC50 Fraksi 5
Y = 6,8783LnX – 0,1884
50 = 6,878LnX – 0,1884
LnX = 7,2966285
71
IC50 = 1475,3175 µg/ml
Rata
Konsentrasi Pengulangan - Abs % IC50
(µg/ml) 1 2 3 rata Sampel Inhibisi (µg/ml)
1000 0.344 0.348 0.341 0.344 0.2594 38.211 -
500 0.361 0.368 0.365 0.365 0.2798 33.369
250 0.382 0.387 0.387 0.385 0.3004 28.447
125 0.406 0.408 0.405 0.406 0.3214 23.445
62.5 0.422 0.427 0.426 0.425 0.3401 19
31.25 0.441 0.443 0.445 0.443 0.3581 14.713
Keterangan :
72
45
40
35 f(x) = 6.83x - 9.13
R² = 1
30
25
% Inhibisi
20
15
10
5
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
ln Konsentrasi

absorban kontrol
0,4199−0,2594
0,4199
= 38,211 %
 Perhitungan IC50 F6
Y = 6,826LnX – 9,1263
50 = 6,826LnX – 9,1263
LnX = 8,661925
73
IC50 = 5778,6478 µg/ml
Rata
1000 0.327 0.328 0.312 0.322 0.2374 43.451 -
500 0.343 0.346 0.349 0.346 0.2611 37.814
250 0.362 0.361 0.367 0.363 0.2784 33.686
125 0.381 0.382 0.382 0.382 0.2968 29.32
62.5 0.406 0.409 0.409 0.408 0.3231 23.048
31.25 0.425 0.425 0.424 0.425 0.3398 19.079
Keterangan :
74
50
45
40 f(x) = 7.03x - 5.31
R² = 1
35
30
% inhibisi
25
20
15
10
5
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
ln Konsentrasi

absorban kontrol
0,4199−0,2374
0,4199
= 2613,7539 %
Y = 7,0289LnX – 5,3072
50 = 7,0289LnX – 5,3072
75
LnX = 7,8685427
IC50 = 2613,7539 µg/ml
Rata
1000 0.186 0.188 0.189 0.188 0.101 69.242 319.8621
500 0.221 0.221 0.225 0.222 0.1357 58.688
250 0.261 0.265 0.269 0.265 0.1784 45.7
125 0.303 0.306 0.307 0.305 0.2187 33.422
62.5 0.343 0.348 0.342 0.344 0.2577 21.55
31.25 0.383 0.388 0.382 0.384 0.2977 9.3734
Keterangan :
76
80
70
f(x) = 17.44x - 50.57
60 R² = 1
50
% inhibisi
40
30
20
10
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
ln Konsentrasi

absorban kontrol
0,3285−0,101
0,3285
= 69,242 %
Y = 17,437LnX – 50,574
50 = 17,437LnX – 50,574
77
LnX = 5,76785
IC50 = 319,8621 µg/ml
Rata
(µg/ml) 1 2 3 Rata Sampel Inhibisi (µg/ml)
1000 0.104 0.106 0.115 0.108 0.0324 91.21 34.7642
500 0.131 0.133 0.134 0.133 0.0568 84.618
250 0.161 0.167 0.167 0.165 0.0891 75.858
125 0.209 0.202 0.206 0.206 0.1298 64.84
62.5 0.242 0.245 0.249 0.245 0.1694 54.094
31.25 0.286 0.288 0.288 0.287 0.2114 42.715
Keterangan :
78
100
90 f(x) = 14.22x - 4.72
80 R² = 0.99
70
60
% Inhibisi
50
40
30
20
10
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
Ln Konsentrasi

absorban kontrol
0,3691−0,0324
0 ,3691
= 91,21 %
Y = 14,223LnX – 4,7156
50 = 14,223LnX – 4,7156
79
LnX = 3,5485875
IC50 = 34,7642 µg/ml
Rata
1000 0.087 0.096 0.087 0.09 0.0141 96.177 30.9042
500 0.117 0.116 0.116 0.116 0.0404 89.043
250 0.147 0.146 0.147 0.147 0.0708 80.825
125 0.185 0.188 0.189 0.187 0.1114 69.807
62.5 0.221 0.213 0.223 0.219 0.1431 61.228
31.25 0.267 0.269 0.269 0.268 0.1924 47.863
Keterangan :
80
120
100
f(x) = 13.85x + 2.48
80 R² = 0.99
% Inhibisi
60
40
20
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
ln Konsentrasi

absorban kontrol
0,3691−0,0141
0 , 3691
= 96,177 %
Y = 13,851LnX – 2,4787
81
50 = 13,851LnX – 2,4787
LnX = 3,4308931
IC50 = Anti LnX = Anti Ln3,4308931
IC50 = 30,9042 µg/ml
Rata
1000 0.088 0.086 0.092 0.089 0.0128 96.538 1.8325
500 0.108 0.101 0.109 0.106 0.0301 91.842
250 0.125 0.123 0.122 0.123 0.0474 87.146
125 0.148 0.146 0.142 0.145 0.0694 81.186
62.5 0.164 0.164 0.161 0.163 0.0871 76.4
31.25 0.182 0.184 0.184 0.183 0.1074 70.891
Keterangan :
82
120
100
f(x) = 7.44x + 45.49
80 R² = 1
% inhibisi
60
40
20
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
ln Konsentrasi

absorban kontrol
0 ,3691−0,0128
0 , 3691
= 96,538 %
Y = 7,4412LnX –45,493
83
50 = 7,4412LnX – 45,493
LnX = 0,6056819
IC50 = 1,8325 µg/ml
Rata
1000 0.098 0.101 0.101 0.1 0.0264 93.554 99.6973
500 0.131 0.132 0.139 0.134 0.0604 85.265
250 0.194 0.192 0.199 0.195 0.1214 70.395
125 0.266 0.262 0.233 0.254 0.1801 56.094
62.5 0.326 0.327 0.328 0.327 0.2534 38.218
31.25 0.389 0.377 0.363 0.376 0.3028 26.192
Keterangan :
84
100
90 f(x) = 20.29x - 43.38
R² = 0.99
80
70
60
% Inhibisi
50
40
30
20
10
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
Ln Konsentrasi

absorban kontrol
0 , 4102−0,0264
0,4102
= 93,554 %
Y = 20,291LnX – 43,382
50 = 20,291LnX – 43,382
85
LnX = 4,6021389
IC50 = 99,6973 µg/ml
Konsentrasi Pengulangan Rata- Abs % IC50

1000 0.138 0.145 0.141 0.1413 0.0673 86.545 232.7831
500 0.246 0.248 0.243 0.2457 0.1717 65.695
250 0.314 0.317 0.316 0.3157 0.2417 51.707
125 0.406 0.404 0.393 0.4010 0.3270 34.654
62.5 0.487 0.491 0.481 0.4863 0.4123 17.602
31.25 0.546 0.548 0.547 0.5470 0.4730 5.4788
Keterangan :
86
100
90 f(x) = 20.29x - 43.38
R² = 0.99
80
70
60
% Inhibisi
50
40
30
20
10
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
Ln Konsentrasi

absorban kontrol
0 ,5004−0,0673
0,5004
= 86,545 %
Y = 23,35LnX – 77,26
50 = 23,35LnX – 77,26
LnX = 5,45011
87
IC50 = 232,7831 µg/ml

1000 0.096 0.093 0.092 0.0937 0.0197 96.07 59.4775
500 0.131 0.136 0.132 0.1330 0.0590 88.21
250 0.187 0.183 0.189 0.1863 0.1123 77.552
125 0.256 0.255 0.256 0.2557 0.1817 63.697
62.5 0.326 0.329 0.326 0.3270 0.2530 49.442
31.25 0.386 0.383 0.381 0.3833 0.3093 38.185
Keterangan :
88
120
100
f(x) = 17.3x - 20.64
R² = 0.99
80
% inhibisi
60
40
20
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
ln Kons

absorban kontrol
0 ,5004−0,0197
0,5004
= 96,07 %
Y = 17,29LnX – 20,64
50 = 17,29LnX – 20,64
LnX = 4,0856
89
IC50 = 59,4775 µg/ml

1000 0.123 0.123 0.126 0.1240 0.0500 90.008 163.5221
500 0.198 0.192 0.193 0.1943 0.1203 75.953
250 0.273 0.271 0.272 0.2720 0.1980 60.433
125 0.368 0.368 0.364 0.3667 0.2927 41.515
62.5 0.431 0.435 0.431 0.4323 0.3583 28.393
31.25 0.504 0.502 0.504 0.5033 0.4293 14.205
Keterangan :
90
100
90
f(x) = 22.28x - 63.57
80 R² = 1
70
60
% inhibisi
50
40
30
20
10
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
Ln Kons

absorban kontrol
0 ,5004−0,0500
0,5004
= 163,5221 %
Y = 22,28LnX – 63,56
50 = 22,28LnX – 63,56
91
LnX = 5,09695
IC50 = 163,522 µg/ml

1000 0.099 0.095 0.105 0.1 0.0261 93.635 30.9042
500 0.141 0.142 0.145 0.143 0.0691 83.153
250 0.179 0.175 0.175 0.176 0.1028 74.946
125 0.203 0.206 0.201 0.203 0.1298 68.364
62.5 0.234 0.239 0.231 0.235 0.1611 60.726
31.25 0.276 0.272 0.265 0.271 0.1974 51.869
Keterangan :
92
100
90
f(x) = 11.65x + 11.81
80 R² = 1
70
60
% Inhibisi
50
40
30
20
10
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
ln Konsentrasi

absorban kontrol
0 , 4102−0,0261
0,4102
= 93,635 %
Y = 11,653LnX – 14,815
50 = 11,653LnX – 14,815
LnX = 3,0193941
93
IC50 = 30,9042 µg/ml

1000 0.091 0.099 0.096 0.095 0.0218 94.691 47.1782
500 0.122 0.122 0.121 0.122 0.0481 88.272
250 0.168 0.165 0.167 0.167 0.0931 77.302
125 0.216 0.213 0.216 0.215 0.1414 65.52
62.5 0.268 0.262 0.268 0.266 0.1924 53.088
31.25 0.306 0.307 0.305 0.306 0.2324 43.337
Keterangan :
94
100
90 f(x) = 15.42x - 9.43
80 R² = 0.99
70
60
% inhibisi
50
40
30
20
10
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
ln Konsentrasi

absorban kontrol
0 , 4102−0,0218
0,4102
= 94,691 %
Y = 15,421LnX – 9,4315
50 = 15,421LnX – 9,4315
LnX = 3,8539329
95
IC50 = 47,1782 µg/ml
Lampiran 25. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan SMF12

1000 0.331 0.332 0.332 0.3317 0.2577 48.51 -
500 0.372 0.371 0.379 0.3740 0.3000 40.05
250 0.416 0.416 0.414 0.4153 0.3413 31.79
125 0.454 0.456 0.451 0.4537 0.3797 24.13
62.5 0.501 0.503 0.507 0.5037 0.4297 14.138
31.25 0.557 0.561 0.555 0.5577 0.4837 3.3472
Keterangan :
96
60
50
f(x) = 12.83x - 39.39
R² = 1
40
% Inhibisi
30
20
10
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
Ln Kons
Gambar 30. Kurva Persamaan Regresi IC50 Fraksi SMF12
 Persen (%) inhibisi SMF12

absorban kontrol
0,5004−0,2577
0,5004
= 48,51 %
 Perhitungan IC50 SMF12
Y = 12,82LnX – 39,38
50 = 12,82LnX – 39,38
97
LnX = 6,97192
IC50 = 1066,27 µg/ml
Lampiran 26. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan SMF14
Konsentras Pengulanga
i n Rata- Abs % IC50
Sampe
(µg/ml) 1 2 3 rata l Inhibisi (µg/ml)
0.25 51.1047
1000 1 0.254 0.255 0.253 0.17 1 923.8701
0.28 42.3631
500 1 0.285 0.285 0.284 0.2 1
0.30 36.6954
250 5 0.302 0.303 0.303 0.22 9
0.33 27.9538
125 6 0.332 0.333 0.334 0.25 9
62.5 0.35 0.354 0.358 0.355 0.272 21.7098
98
4 9
0.38 12.5840
31.25 6 0.387 0.388 0.387 0.303 5
Keterangan :

60
50
f(x) = 10.85x - 24.1
R² = 1
40
% Inhibisi
30
20
10
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
Ln Kons
Gambar 31. Kurva Persamaan Regresi IC50 Fraksi SMF14
 Persen (%) inhibisi SMF14

absorban kontrol
0,3470−0,17
0,3470
99
= 51,10471 %
 Perhitungan IC50 SMF14
Y = 10,85LnX – 24,09
50 = 10,85LnX – 24,09
LnX = 6,828571
IC50 = 923,8701 µg/ml
Lampiran 27. Hasil Identifikasi kristal senyawa SMF12 dan SMF14
Tabel 3. Identifikasi kristal senyawa SMF12 dan SMF14
100
Hasil
No Pengamatan
SMF12 SMF14
1 Organoleptis
- Bentuk Kristal bunga Kristal jarum
- Warna Putih putih
- Bau Tidak berbau Tidak berbau
Pemeriksaan sifat
2 kimia
Larut metanol, Larut metanol,
- Kelarutan sangat mudah sangat mudah
larut etil larut etil
Pemeriksaan sifat
3 fisika
- Titik leleh 160-1620C 155-1570C
Lampiran 28. Hasil Spektrum Spektrofotometer Ultraviolet Senyawa Murni

SMF12
101
Gambar 32. Spektrum UV Senyawa SMF12 Pada Daerah Panjang Gelombang
200-400 nm
Tabel 4. Data Hasil Spektrum UV Senyawa SMF12
No Panjang Gelombang (nm) Absorban

1 391,50 0.001
2 265,00 0,462
3 206,50 1,813
135
%T
127,5
120
112,5
105
97,5
90
Lampiran
82,5 29. Hasil Spektrum Spektrofotometer inframerah Senyawa Murni
75 SMF12
67,5
60
52,5
45
2 9 1 0 ,7 1
2 8 3 7 ,4 1
37,5
1 2 9 5 ,2 6
1 3 5 0 ,2 3
1 1 5 8 ,3 0
2 9 6 7 ,6 1
30
2 9 3 7 ,7 1
8 3 8 ,1 1
1 3 2 3 ,2 2
1 0 1 5 ,5 7
1 4 2 5 ,4 6
9 2 7 ,8 0
22,5
1 0 5 2 ,2 1
1 6 1 7 ,3 8
1 0 3 5 ,8 2
1 5 9 0 ,3 8
1 0 8 7 ,9 0
1 5 1 2 ,2 6
1 3 8 1 ,0 9
1 2 5 3 ,7 8
15
1 7 4 0 ,8 3
102
1 7 0 4 ,1 8
1 2 3 2 ,5 7
1 1 2 5 ,5 1
7,5
0
-7,5
-15
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400
SIRIH MERAH F12 ANDI HALIM 1/cm
Gambar 33. Hasil Spektrum Spektrofotometer inframerah Senyawa Murni
SMF12
Tabel 5. Data Hasil Spektrum Spektrofotometer inframerah Senyawa Murni

SMF12
NO Bilangan Gelombang Renggang
1 2967 C-H Alifatik
2 1617 C=O
3 1426 C-H2
4 1381 C-H3
Lampiran 30. Hasil Spektrum Spektrofotometer Ultraviolet Senyawa Murni

SMF14
103
Gambar 34. Spektrum UV Senyawa SMF14 Pada Daerah Panjang Gelombang
200-400 nm
Tabel 6. Data Hasil Spektrum UV Senyawa SNF14
No Panjang Gelombang (nm) Absorban

1 361,00 0.008
2 265,00 0,263
3 207,00 1,235
Lampiran 31. Hasil Spektrum Spektrofotometer inframerah Senyawa Murni

SMF14
104
15
30
45
60
75
90
22,5
37,5
52,5
67,5
82,5
97,5
-15
105
120
7,5
112,5
-7,5
%T
4
3
2
1
NO
SMF14
3 4 3 8 ,2 6
SMF14
3 3 5 7 ,2 5
1236
1684
2937
3500
2 9 9 6 ,5 4
2 9 5 2 ,1 8
2 9 3 7 ,7 1
SIRIH MERAH F14 ANDI HALIM

2 9 0 2 ,9 9
4400 4000 3600 3200 2800

2 8 3 8 ,3 7
Bilangan Gelombang
2400
2000
105
C-O
N-H
C=O
1800
1 6 8 4 ,8 9
Renggang
1 6 8 1 ,0 4
C-H Alifatik
1 6 1 7 ,3 8
1 5 8 8 ,4 5
1600
1 5 0 7 ,4 3
1 4 5 8 ,2 5
1 4 2 4 ,4 9
1 3 5 6 ,0 2
1400
1 3 3 8 ,6 6
1 3 2 3 ,2 2
1 3 0 0 ,0 8
1 2 7 5 ,0 0
1200
1 2 3 6 ,4 2
1 1 5 8 ,3 0
1 1 2 8 ,4 1
1 1 1 2 ,0 1
1000
1 0 8 3 ,0 8
1 0 3 3 ,8 9
1 0 0 9 ,7 8
9 9 7 ,2 4
800
9 7 0 ,2 4
9 3 0 ,6 9
9 1 8 ,1 6
Gambar 35. Hasil Spektrum Spektrofotometer inframerah Senyawa Murni
8 4 9 ,6 8
Tabel 7. Data Hasil Spektrum Spektrofotometer inframerah Senyawa Murni
600
8 4 2 ,9 3
6 9 5 ,3 7
400
1/cm
Lampiran 32. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Daun Tumbuhan Sirih Merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav.) dengan Metode DPPH
Menggunakan Mikroplate Reader
Gambar 36. Fraksi 12, Fraksi 13, Fraksi 14 dan Fraksi 15 dengan Metode DPPH
Menggunakan Mikroplate Reader
106

Sari Skripsi 16-03-2017

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Sari Skripsi 16-03-2017

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

ISOLASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER FRAKSI ETIL

ASETAT AKTIF ANTIOKSIDAN DARI TUMBUHAN

PROGRAM STUDI SI FARMASI

Tumbuhan sirih merupakan salah satu tumbuhan yang telah lama

digunakan dan diketahui oleh masyarakat untuk menyembuhkan berbagai macam

subtropik (Salleh et al, 2012).

Tumbuhan sirih biasanya mencapai tinggi 15 m. Batang sirih berwarna

memiliki daun yang berbentuk seperti hati (Damayanti, 2006).

berbagai macam khasiat untuk menyembuhkan berbagai macam penyakit.

bersifat antioksidan, antidiabetes, anti kanker, antiseptik dan anti inflamasi.

Secara empiris daun sirih merah dapat menyembuhkan berbagai jenis

penyakit seperti diabetes melitus, hepatitis, batu ginjal, menurunkan kolesterol,

dan Fahma, 2005).

Berdasarkan hasil penelitian, fraksi n-heksan tumbuhan sirih merah ini

memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat karena menunjukkan nilai IC 50

ppm), metanol ( IC50 ; 3,44 ppm) memperlihatkan aktivitas antioksidan yang

tinggi (Irawan, 2009).

Aktivitas antioksidan merupakan kemampuan dari senyawa atau ekstrak

yang sangat reaktif, mengandung elektron yang tidak berpasangan yang

mengakibatkan stres oksidatif. Stres oksidatif adalah ketidakseimbangan antara

jumlah oksidan dan antioksidan yang berpotensi menyebabkan kerusakan lipid,

tersebut dapat memicu terjadinya kanker, kelainan neurogeneratif, penyakit

jantung, diabetes, dan kelainan autoimun.

Tubuh manusia memiliki pertahanan terhadap radikal bebas dari senyawa

antioksidan enzimatis yang dihasilkan dari dalam tubuh. Superoksida dismutase

terhadap radikal bebas menjadi lemah dan mengakibatkan penambahan jumlah

Penelitian mengenai isolasi dan identifikasi senyawa flavonoid terhadap

dilakukan. Tahapan isolasi meliputi ekstrak dengan metode maserasi, fraksinasi

dengan menggunakan metode ekstraksi cair – cair (ECC), subfraksinasi dengan

metode kromatografi cair vacum (KCV), dan pemurnian dengan menggunakan

KLT preparatif. Identifikasi isolat dilakukan menggunakan spektrofotometri ultra

menunjukkan isolat daun sirih merah mengandung senyawa flavonoid yang di

duga golongan flavonol (Puzi, 2015).

etanol-air dengan perbandingan 75:25% memiliki aktivitas antioksidan yang

lain (Lestari, 2014).

Teknik lain dalam menemukan senyawa aktif secara biologis dapat

dilakukan dengan teknik Bioassay guided isolation. Teknik bioassay-guided

dipisahkan menjadi banyak fraksi, kemudian masing-masing fraksi dilakukan

murni dapat diisolasi lebih cepat (Cheng et al, 2006).

dimanfaatkan sebagai salah satu bahan berkhasiat obat khususnya aktivitas

melakukan isolasi senyawa metabolit sekunder dengan menggunakan metoda

merah sehingga dapat dimanfaatkan sebagai salah satu bahan pengobatan.

2.1 Monografi Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)

Tumbuhan sirih mempunyai daerah persebaran yang luas, khususnya di

kawasan tropis dan subtropis. Di Indonesia tumbuhan sirih merah diketahui

tumbuh di berbagai daerah, seperti di lingkungan Keraton Yogyakarta dan di

daerah lainnya (Sudewo, 2008).

Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti sirih hijau, batangnya

seperti sirih (Duryatmo 2005).

Tumbuhan Piper crocatum Ruiz &Pav merupakan spesies tumbuhan yang

termasuk ke dalam famili Piperaceae. Adapun taksonomi tumbuhan ini menurut

Backer (1963) diklasifikasikan sebagai berikut :

Spesies :Piper crocatum Ruiz & Pav

2.1.2 Nama Daerah

(Maluku), gumi momadi (Ternate), sulamu tali (Ternate) (Heyne, 1987).

(Jawa); seureuh (Sunda); ranub (Aceh); cambai (Lampung); base (Bali)

Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti sirih hijau, batangnya

seperti sirih (Duryatmo 2005).

menjadi pudar, buram, kurang menarik (Sudewo 2008).

2.1.4 Daerah Penyebaran

Tumbuhan sirih mempunyai daerah persebaran yang luas, khususnya di

Afrika, di sekitar pulau Zanzibar, Madagaskar, India ke Timur meliputi daratan

Tenggara lainnya (Tjitrosoepomoe, 2005).