perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.

id

BAB III
METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian
Penelitian yang dilakukan menggunakan metode eksperimen. Penentuan
bilangan koordinasi Cu(II) dilakukan dengan metode perbandingan mol Cu(II)
dan benz. Sintesis senyawa kompleks dilakukan dengan mereaksikan CuCl22H2O
dengan benz pada perbandingan Cu(II) dengan benz tertentu dalam pelarut yang
dapat melarutkan keduanya. Indikasi terbentuknya kompleks ditandai dengan
adanya pergeseran spektra elektronik ke λmaks yang lebih kecil dibandingkan
dengan λmaks CuCl22H2O.
Struktur kompleks ditentukan dengan pengukuran % Cu dalam kompleks
menggunakan SSA, ada tidaknya molekul air dalam kompleks ditentukan dengan
TG/DTA, perbandingan kation dan anion kompleks ditentukan dengan
pengukuran daya hantar listrik (DHL) menggunakan konduktivitimeter, dan
kedudukan ion klorida ditentukan dengan sifat konduktivitasnya. Gugus yang
terkoordinasi pada Cu(II) diperkirakan dari spektra FTIR. Sifat kemagnetan
kompleks Cu(II) diketahui berdasarkan harga momen magnet dengan Magnetic
Susceptibility Balance (MSB). Absorptivitas molar dan transisi elektronik
kompleks diperkirakan dengan spektroskopi UV-Vis.
Uji aktivitas antibakteri Cu(II), benz dan kompleks Cu(II)-benz
dilakukan dengan metode Kirby-Bauer (difusi kertas cakram) termodifikasi yaitu
pengukuran diameter zona bening sebagai daya hambat bakteri. Sampel uji adalah
CuCl22H2O, benz dan kompleks Cu(II)-benz yang dibuat variasi konsentrasi (%
m/v) : 5, 10, 25, 50, 75 dan 100. Kontrol positif yang digunakan adalah kloramfenikol
dan kontrol negatifnya adalah DMSO. Untuk mengetahui signifikansi pertambahan
daya hambat Cu(II)-benz dibandingkan dengan Cu(II) dan benz digunakan uji
statistik dengan Korelasi Pearson.

33

commit to user
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
34

B. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan selama 7 bulan pada bulan September 2014 hingga
Maret 2015 dengan keterangan sebagai berikut :
1. Sintesis senyawa kompleks, pengukuran kadar logam, daya hantar listrik,
analisis ion dan momen magnet dilakukan di Sub Laboratorium Kimia UPT
Laboratorium Pusat UNS Surakarta.
2. Analisis spektra elektronik, spektra IR dan penentuan jumlah molekul H2O
dilakukan di Laboratorium MIPA terpadu UNS Surakarta.
3. Uji aktivitas antibakteri dilakukan di Sub Laboratorium Biologi UPT
Laboratorium Pusat UNS Surakarta.

C. Alat dan Bahan

1. Alat
a. Spektrometer UV-Vis Lambda 25 Perkin Elmer
b. Spektrofotometer Serapan Atom (SSA) Shimadzu AA-6650
c. TG/DTA Diamond Perkin Elmer
d. Spektrofotometer FT-IR Prestige-21 Shimadzu
e. Magnetic Susceptibility Balance Auto Sherwood Scientific 1016
f. Konduktivitimeter Jenway CE 4071
g. Neraca analitik Shimadzu AEI-200
h. Pemanas Listrik Shimadzu AEL-200 dan Cole palmer 4658
i. Peralatan gelas Pyrex dan Duran
j. Glasfin
k. Desikator vacuum
l. Magnetic stirer
m. Mikropipet 10-100 μL
n. Vortex mixer
o. Cawan petri
p. Tabung reaksi
q. Jarum ose
r. Autoclave (Presoclave 75 P-Selecta)

commit to user
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
35

s. Laminar Air Flow (Minihelik II, dwyer)

t. Inkubator (Hotcold M P-Selecta)

2. Bahan
a. CuCl22H2O (Merck)
b. Benzokain (Kimia Farma)
c. Metanol p.a. (Merck)
d. Etanol p.a (Merck)
e. HNO3 pekat (Merck)
f. Cu standar 1000 ppm (Merck)
g. KBr kering (Merck)
h. NaCl (Merck)
i. CuSO45H2O (Merck)
j. FeSO47H2O (Merck)
k. CoSO47H2O (Merck)
l. CoCl26H2O (Merck)
m. MgCl26H2O (Merck)
n. AlCl36H2O (Merck)
o. FeCl36H2O (Merck)
p. AgNO3 (Merck)
q. DMSO (Merck)
r. Kloramfenikol
s. Mac Concey Agar (MCA)
t. Manitol Salt Agar (MSA)
u. Akuades
v. Aseton
w. Kertas saring
x. Kapas
y. Kertas cakram 6 mm

commit to user
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
36

D. Prosedur Penelitian
1. Penentuan Bilangan Koordinasi Cu(II) dengan Metode Perbandingan Mol
CuCl22H2O 0,02 M dan benz 0,1 M masing-masing dilarutkan di metanol
dicampur dengan perbandingan mol Cu(II):benz = 1:0 hingga 1:7 seperti
ditunjukkan oleh Tabel 7.

Tabel 7. Variasi Perbandingan Mol Larutan CuCl2.2H2O dan Benz

Perbandingan mol CuCl22H2O Benz
CuCl22H2O : Benz (mmol) (mg) (mL) (mmol) (mg) (mL)
1:0 0,1 17,048 5 0 0 0
1:1 0,1 17,048 5 0,1 16,517 1
1:2 0,1 17,048 5 0,2 33,034 2
1:3 0,1 17,048 5 0,3 49,551 3
1:4 0,1 17,048 5 0,4 66,068 4
1:5 0,1 17,048 5 0,5 82,585 5
1:6 0,1 17,048 5 0,6 99,102 6
1:7 0,1 17,048 5 0,7 115,619 7

Semua larutan campuran diukur absorbansinya mengunakan

spektrofotometer UV-Vis dan dibuat grafik panjang gelombang maksimum vs
perbandingan mol untuk menentukan perbandingan mol Cu(II) dan benz yang
paling optimum.

2. Sintesis Kompleks Cu(II)-benz

CuCl22H2O (0,51 gram; 3 mmol) dilarutkan dalam etanol (15 mL).
kemudian diteteskan ke dalam 35 mL larutan benz dalam etanol (1,98 gram; 12
mmol) sambil diaduk. Larutan campuran diaduk selama 30 menit tanpa
pemanasan. Endapan yang terbentuk disaring kemudian direkristalisasi dengan 50
mL metanol. Larutan diuapkan pada suhu 40 oC hingga volumenya menjadi 25
mL. Larutan didinginkan hingga terbentuk endapan. Endapan kemudian disaring
dan dikeringkan dalam vacuum. Diagram alir prosedur sintesis dapat dilihat pada
Lampiran 1.

commit to user
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
37

3. Penentuan Kadar Cu dalam Kompleks

Penentuan kadar Cu dalam kompleks dilakukan dengan SSA. Larutan
standar dibuat dengan mengencerkan 1 mL larutan standar Cu 1000 ppm dalam
HNO3 0,05 N sampai volume 10 mL sehingga diperoleh larutan standar Cu 100
ppm. Larutan standar Cu 100 ppm kemudian diambil 5 mL dan diencerkan
menjadi 50 mL sehingga didapatkan larutan 10 ppm. Larutan standar dengan
konsentrasi 0, 1, 2, 3, dan 4 ppm dibuat dari larutan induk 10 ppm.
Larutan sampel dibuat dengan mendestruksi kompleks dengan larutan
HNO3 pekat sampai larut kemudian diencerkan dengan HNO3 0,05 N sampai
volume 100 mL. Sampel kemudian diambil sebanyak 2 mL dan diencerkan
sampai 10 mL. Sampel dibuat dalam tiga variasi massa kemudian dianalisis
dengan SSA sehingga diperoleh data absorbansi dan konsentrasi Cu dalam
kompleks.

4. TG/ DTA
Analisis termal dilakukan dengan TG/DTA yang mencatat perubahan
berat sampel sebagai fungsi temperatur dalam senyawa kompleks dengan
mendeteksi perubahan pada kandungan panasnya untuk identifikasi adanya
molekul H2O. Analisis ini dilakukan pada suhu 30-550 °C dengan kecepatan
pemanasan 30 °C/menit.

5. Analisis Ion Klorida

Analisis ion dilakukan terhadap ion klorida dengan metode pengendapan.
Kompleks dilarutkan dalam akuades kemudian ditambahkan beberapa tetes
AgNO3 0,1 M . Selanjutnya diamati ada atau tidaknya endapan putih AgCl dalam
larutan.

6. Pengukuran Daya Hantar Listrik

Sampel kompleks Cu(II) dan standar CuSO45H2O, FeSO47H2O,
CoSO47H2O, MgCl26H2O, CuCl22H2O, CoCl26H2O, FeCl36H2O dan
AlCl36H2O masing-masing dilarutkan dalam metanol dan dibuat pada konsentrasi

commit to user
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
38

yang sama (1.10-3 M). Daya hantar listrik masing-masing larutan diukur dengan
konduktivitimeter yang mana setiap pengukuran dikoreksi terhadap nilai daya
hantar spesifik pelarut (kpelarut). Sebelum konduktivitimeter ini digunakan, alat ini
dikalibrasi dengan KCl 0,01 M hingga menunjukkan angka 1413 µs.

7. Pengukuran Spektra Infra Merah

Ligan bebas benz, CuCl22H2O, dan kompleks Cu(II)-benz (1 mg) dibuat
pelet menggunakan KBr kering. Masing-masing dibaca spektrumnya
menggunakan spektrofotometer FTIR pada daerah 400-4000 cm-1.

8. Pengukuran Momen Magnet

Kompleks Cu(II)-benz padat yang akan ditentukan harga momen
magnetnya dimasukkan ke dalam tabung kosong pada neraca kerentanan
magnetik, lalu diukur tinggi sampel dalam tabung minimal 1,5 cm dan beratnya
antara 0,001 – 0,999 gram. Hasil pengukuran akan diperoleh harga kerentanan
magnetik per gram atom (Xg) yang kemudian diubah menjadi kerentanan
magnetik molar (XM) dan dikoreksi terhadap faktor diamagnetik (XL), sehingga
didapatkan nilai kerentanan magnetik terkoreksi (XA). Dari harga XA dapat
dihitung moment magnet efektifnya.

9. Pengukuran Spektra Elektronik

Kompleks Cu(II)-benz dan CuCl22H2O dilarutkan dalam metanol,
kemudian diukur spektrum elektroniknya dengan spektrofotometer UV-Vis.
Pengukuran spektrum elektronik dilakukan pada daerah 300-1000 nm.

10. Uji Aktivitas Antibakteri

Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan pengukuran daya hambat
terhadap bakteri. Penelitian yang dilakukan menggunakan metode Kirby-Bauer
termodifikasi sesuai yang dilakukan Katrin et al. (2015). Diagram alir setiap
prosedur dapat dilihat pada Lampiran 1.

commit to user
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
39

a. Sterilisasi Alat
Sterilisasi alat dilakukan dalam autoklaf pada suhu 121 oC ±15 menit.
Alat-alat non-gelas yang tidak tahan panas dicuci dengan etanol 70%.
b. Penyiapan Media
Pembuatan media dilakukan dengan cara 2,06 g nutrien agar Mac Concey
dan 4,32 g MSA dilarutkan dalam 40 mL akuades. Suspensi yang dihasilkan
dipanaskan sampai mendidih, kemudian dimasukkan dalam beberapa tabung
reaksi masing-masing sebanyak 5 mL dan ditutup dengan kapas. Proses ini
dilakukan di dekat nyala api. Tabung-tabung tersebut kemudian disterilkan
dalam autoklaf pada 121 oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit kemudian
diletakkan dalam posisi miring selama 24 jam pada suhu ruang.
c. Pembuatan Biakan Bakteri
Biakan murni bakteri diremajakan pada media padat agar miring dengan
cara menggoreskan jarum ose yang mengandung bakteri bakteri Echerichia.
coli dan Staphylococcus aureus dengan pola zig zag secara aseptis yaitu
dengan mendekatkan mulut tabung pada nyala api saat menggoreskan jarum
ose. Kemudian tabung reaksi ditutup kembali dengan kapas dan diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 37 oC dalam inkubator.
d. Pembuatan Suspensi Bakteri
Satu ose bakteri dicampur 5 mL NaCl 9 % steril. Campuran diaduk
hingga larutan agak keruh.
e. Uji Daya Hambat Antibakteri
Untuk uji antibakteri CuCl22H2O, benz dan kompleks Cu(II)-benz,
sebanyak 5,15 gram mac zoncey (untuk Echerechia coli) dan 10,80 gram MSA
(untuk Staphylococcus aureus) dilarutkan ke dalam 100 mL akuades, distirer
sampai homogen, disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 30 menit.
Kertas cakram 6 mm ditetesi dengan 10 mikroliter ekstrak Cu(II), benz maupun
kompleks Cu(II)-benz dengan variasi konsentrasi (% m/v) sebesar 5, 10, 25,
50, 75, dan 100% dalam pelarut DMSO (persiapan sampel uji secara lengkap
ditunjukkan oleh Lampiran 1) yang dibuat dengan melarutkan 0,5; 0,375; 0,25;
0,125; 0,05; 0,025 gram dalam 0,5 mL DMSO. Satu ose bakteri diambil untuk

commit to user
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
40

membuat suspensi bakteri dalam NaCl 9% steril. Seratus mikroliter suspensi

dan 15 mL media bakteri steril pada suhu ±37oC di-vortex agar homogen.
Kemudian larutan dimasukkan ke dalam cawan petri steril hingga larutan
memadat ±15 menit. Kertas cakram kering yang telah ditetesi 10µL sampel uji
diletakkan secara beraturan di atas media agar. Cawan dibungkus plastik
wrapping agar tetap steril, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu
±37oC. Hambatan pertumbuhan bakteri dapat diketahui dengan mengukur
diameter zona bening di sekitar kertas cakram yang merupakan diameter zona
hambat bakteri. Kontrol negatif dilakukan terhadap pelarut DMSO dan kontrol
positif juga dilakukan menggunakan antibiotik kloramfenikol. Pengukuran
zona bening dilakukan dengan jangka sorong dengan ketelitian ±0,05 mm.

D. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data

Analisis data meliputi tahap awal sintesis kompleks Cu(II)-benz, setelah
itu dilakukan karakterisasi kompleks yang terbentuk. Terbentuknya kompleks
ditandai dengan pergeseran panjang gelombang maksimum spektra elektronik
senyawa kompleks dibandingkan spektra Cu(II). Formula kompleks Cu(II)-benz
yang terbentuk diperkirakan dari hasil pengukuran kadar Cu(II) dalam kompleks
dan dibandingkan dengan perhitungan teoritisnya. Keberadaan molekul air
kompleks ditentukan dengan TG/DTA. Perbandingan muatan kation dan anion
ditentukan dengan membandingkan daya hantar listrik pada kompleks dengan
daya hantar listrik larutan standar. Kedudukan ion klorida ditentukan dengan sifat
konduktivitas kompleks serta uji kualitatif metode pengendapan. Penentuan gugus
fungsi yang terkoordinasi pada Cu(II) diperkirakan dari spektra IR. Sifat
kemagnetan kompleks ditentukan dengan nilai momen magnet dari pengukuran
kerentanan magnetik per gram (Xg). Pengujian kompleks Cu(II)-benz yang
diaplikasikan sebagai antibakteri dapat dilihat dari hasil pengukuran daya hambat
bakteri. Hambatan pertumbuhan bakteri dapat diketahui dengan mengukur
diameter zona bening di sekitar kertas cakram zona bening akan terbentuk ketika
konsentrasi ekstrak yang berdifusi itu cukup untuk menghambat pertumbuhan
bakteri.

commit to user