Metodos de Analisis Microbiologicos de Alimentos Corrie A. Ribes M.

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MÉTODOS DE ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICOS
DE ALIMENTOS
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CORRIE ALLAERT VANDEVENNE
MARTA ESCOLÁ RIBES
MÉTODOS DE ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICOS
DE ALIMENTOS
© Corrie Allaert Vandevenne y Marta Escolá Ribes, 2002
Reservados todos los derechos.
«No está permitida la reproducción total o parcial de este libro,

ni su tratamiento informático, ni la transmisión de ninguna
forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico,
por fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso
previo y por escrito de los titulares del Copyright.»
Ediciones Díaz de Santos, S. A.

Juan Bravo, 3-A. 28006 MADRID
España
E-mail: ediciones@diazdesantos.es
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ISBN: 84-7978-524-1
Depósito legal: M. 23.431-2002
Fotocomposición: Fernández Ciudad, S. L.

Impresión: Fernández Ciudad, S. L.
Encuadernación: Rústica-Hilo, S. L.
Impreso en España
Autores
• CORRIE ALLAERT VANDEVENNE, Técnico en Microbiología (Instituto Pasteur

de Lille), responsable del Laboratorio de Microbiología de Alimentos y
Aguas del Departamento de Tecnología de Alimentos de la Universidad de
Lleida, Coordinadora del Programa EQUASE (Ejercicios de Verificación Ex-
terna de Calidad) en España en colaboración con el PHLS (Public Health La-
boratory Services) del UK, Representante de la Universidad de Lleida en los
ejercicios interlaboratorios de validación de métodos ISO para el CEN (Co-
mité Europeo de Normalización).
e-mail: corrie@tecal.udl.es
• MARTA ESCOLÀ RIBES, Ingeniero Agrónomo. Este libro es una versión mo-
dificada y adaptada de su Proyecto de Fin de Carrera.
Agradecimientos
A Vicente Sanchis Almenar, catedrático de Microbiología de Alimentos, por su confianza y

por darnos ánimos para publicar este proyecto en forma de libro.
A Robert Garrofé Forca, por su fiel y eficaz colaboración técnica para la puesta a punto de
los métodos y la integración de los mismos en los sistemas de calidad del laboratorio.
A Nuria Sala Martí, profesora de Microbiología de Alimentos y Agraria, miembro de la co-

misión ISO/CEN en España, así como a Mercè Torres Grifo, profesora de Microbiología Gene-
ral e Higiene, por su colaboración en los ensayos interlaboratorios de validación y sus criticas
constructivas.
Reflexiones
«Quedé muerto así como mineral y me convertí en planta.

Quedé muerto luego como planta y tomé una forma sensible.
Quedé muerto luego como animal, me puse atuendo humano.
¿Cuándo me hice menos por la muerte?»
RUMI
«La vida... una profundidad viva de equilibrios, siempre en movimiento y fusión, de tensio-
nes y desahogos, en la constante transformación de creación y destrucción.»
EDWARD C. WHITMONT
«As microbiologists, dealing with living organisms, we should probably have learned by now
to always expect the unexpected.»
SHEILA EATON, Responsable de la Organización de EQUAL del PHLS.
Es la conclusión de más de 10 años de ejercicios interlaboratorios para Verificación Externa

de Calidad.
«De luz y de sombra soy, quiero darme a las dos.»

GABRIEL Y GALÁN
VOOR BOY EN SOR
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. XIX
CAPÍTULO PRIMERO
PROCEDIMIENTO GENERAL DE REDACCIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

DE ALIMENTOS (PNT - AL- 001) ......................................................................... 1
CAPÍTULO SEGUNDO
PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002) ......... 9
Tablas de resultados ........................................................................................................... 16

Anexo 1: Tablas de límites de confianza ........................................................................... 42
Anexo 2: Ejemplos ............................................................................................................. 46
Recuento en medio sólido sin identificación: Ejemplos 1 al 12 ........................................ 47
Recuento en medio sólido después de identificación: Ejemplos 13 al 26 ......................... 51
Recuento en medio líquido: Ejemplos 27 al 31 ................................................................. 58
CAPÍTULO TERCERO
PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS ................ 61
PNT - AL - 003: Método horizontal para el recuento de microorganismos a 30°C (méto-

do de referencia) .......................................................................................................... 62
PNT - AL - 004: Método horizontal para el recuento de microorganismos a 30°C (méto-
do de rutina) ................................................................................................................. 64
PNT - AL - 005: Método horizontal para el recuento de levaduras y mohos (método de re-
ferencia) ....................................................................................................................... 66
PNT - AL - 006: Método horizontal para el recuento de levaduras y mohos (método de ru-
tina) .............................................................................................................................. 68
PNT - AL - 007.1: Método horizontal para el recuento sin revivificación de Enterobacte-
riaceae. Técnica del NMP (método de referencia) ...................................................... 70
PNT - AL - 007.2: Método horizontal para el recuento sin revivificación de Enterobacte-
riaceae. Técnica por recuento de colonias (método de referencia) .............................. 72
PNT - AL - 008: Método horizontal para la investigación de Enterobacteriaceae con pre-
enriquecimiento (método de referencia) ...................................................................... 75
XIII
XIV ÍNDICE
PNT - AL - 009: Método horizontal para el recuento sin revivificación de Enterobacte-

riaceae. Técnica por recuento de colonias (método de rutina) .................................... 77
PNT - AL - 010: Método horizontal para el recuento de coliformes totales. Técnica del
NMP (método de referencia) ....................................................................................... 80
PNT - AL - 011: Método horizontal para el recuento de coliformes totales. Técnica por re-
cuento de colonias (método de referencia) .................................................................. 82
PNT - AL - 012: Método horizontal para el recuento de coliformes totales (método de ru-
tina) .............................................................................................................................. 84
PNT - AL - 013: Método horizontal para el recuento de Escherichia coli presuntivos. Téc-
nica del NMP (método de referencia) .......................................................................... 86
PNT - AL - 014: Método horizontal para el recuento de Escherichia coli β-glucuronidasa
positivos (método de rutina) ........................................................................................ 88
PNT - AL - 015.1: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa posi-
tivos (CPS) con confirmación. Técnica por recuento de colonias (método de refe-
rencia) .......................................................................................................................... 90
PNT - AL - 015.2: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa posi-
tivos (CPS) sin confirmación. Técnica por recuento de colonias (método de refe-
rencia) .......................................................................................................................... 93
PNT - AL - 016.1: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positi-
vos (CPS). Técnica con confirmación de colonias (método de rutina) ....................... 95
PNT - AL - 016.2: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positi-
vos (CPS). Técnica sin confirmación de colonias (método de rutina) ......................... 98
PNT - AL - 017: Método horizontal para el recuento de Bacillus cereus (método de refe-
rencia) .......................................................................................................................... 100
PNT - AL - 018: Método horizontal para el recuento de Bacillus cereus (método de rutina). 103
PNT - AL - 019: Método horizontal para el recuento de Clostridium perfringens (método
de referencia) ............................................................................................................... 106
PNT - AL - 020: Método horizontal para el recuento de Clostridium perfringens (método
de rutina) ...................................................................................................................... 109
PNT - AL - 021: Método horizontal para la investigación de Salmonella (método de re-
ferencia) ....................................................................................................................... 112
PNT - AL - 022: Método horizontal para la investigación de Salmonella (método de ru-
tina) .............................................................................................................................. 118
PNT - AL - 023.1: Método horizontal para la investigación de Listeria monocytogenes
(método de referencia) ................................................................................................. 123
PNT - AL - 023.2: Método horizontal para el recuento de Listeria monocytogenes (mé-
todo de referencia) ....................................................................................................... 127
PNT - AL - 024: Método horizontal para la investigación de Listeria monocytogenes (mé-
todo de rutina) .............................................................................................................. 131
PNT - AL - 025: Método horizontal para la investigación de Campylobacter termotole-
rantes (método de rutina) ............................................................................................. 135
CAPÍTULO CUARTO
PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

(PNT - ME - 001) ........................................................................................................ 143
CAPÍTULO QUINTO
PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE

CULTIVO (PNT - ME - 002) .................................................................................... 149
ÍNDICE XV
CAPÍTULO SEXTO
PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ............... 151
Relación de medios de cultivo y PNT - AL en el que aparecen ........................................ 153

PNT - ME - 003: Procedimiento para la preparación de la peptona salina (PS) ................ 155
PNT - ME - 004: Procedimiento para la preparación del agar para recuento (PCA) ......... 156
PNT - ME - 005: Procedimiento para la preparación del agar blanco (AB) ...................... 157
PNT - ME - 006: Procedimiento para la preparación del agar glucosa y cloranfenicol
(CGA) .......................................................................................................................... 158
PNT - ME - 007: Procedimiento para la preparación del caldo tamponado con bilis, verde
brillante y glucosa (caldo EE) ...................................................................................... 159
PNT - ME - 008: Procedimiento para la preparación del agar bilis cristal violeta y gluco-
sa (VRBG) ................................................................................................................... 160
PNT - ME - 009: Procedimiento para la preparación del agar glucosado (AG) ................ 161
PNT - ME - 010: Procedimiento para la preparación del agar nutritivo (AN) .................. 162
PNT - ME - 011: Procedimiento para la preparación del caldo nutritivo (CN) ................. 163
PNT - ME - 012: Procedimiento para la preparación del agua de peptona tamponada
(APT) ........................................................................................................................... 164
PNT - ME - 013: Procedimiento para la preparación del caldo de triptona lauril sulfato
(TSL) ............................................................................................................................ 165
PNT - ME - 014: Procedimiento para la preparación del caldo lactosado biliado verde bri-
llante (BGBL) .............................................................................................................. 166
PNT - ME - 015: Procedimiento para la preparación del agar lactosado con bilis al cristal
violeta y rojo neutro (VRBL) ....................................................................................... 167
PNT - ME - 016: Procedimiento para la preparación del caldo Escherichia coli (caldo EC).. 168
PNT - ME - 017: Procedimiento para la preparación del agua de triptona (AT) ............... 169
PNT - ME - 018: Procedimiento para la preparación del agar con tergitol-BCIG (PTX) . 170
PNT - ME - 019: Procedimiento para la preparación del medio de Baird-Parker (BP) ..... 171
PNT - ME - 020: Procedimiento para la preparación del caldo de cerebro-corazón (BHI) .... 172
PNT - ME - 021: Procedimiento para la preparación del agar con plasma de conejo y fi-
brinógeno (RPF) .......................................................................................................... 173
PNT - ME - 022: Procedimiento para la preparación del agar manitol yema de huevo con
polimixina (MYPA) ..................................................................................................... 174
PNT - ME - 023: Procedimiento para la preparación del medio Voges-Proskauer (MR-
VP) ............................................................................................................................... 175
PNT - ME - 024: Procedimiento para la preparación del medio nitrato (MN) .................. 176
PNT - ME - 025: Procedimiento para la preparación del agar sangre (AS) ...................... 177
PNT - ME - 026: Procedimiento para la preparación del agar movilidad (AM) ............... 178
PNT - ME - 027: Procedimiento para la preparación del agar triptona-sulfito con ciclose-
rina (TSC) .................................................................................................................... 179
PNT - ME - 028: Procedimiento para la preparación del tioglicolato (TIO) ..................... 180
PNT - ME - 029: Procedimiento para la preparación del medio lactosa sulfito (LS) ........ 181
PNT - ME - 030: Procedimiento para la preparación del caldo con verde de malaquita y
cloruro de magnesio (Rappaport-Vasiliadis modificado) (RV) ................................... 182
PNT - ME - 031: Procedimiento para la preparación del caldo selenito-cistina (SC) ....... 183
PNT - ME - 032: Procedimiento para la preparación del agar rojo fenol y verde brillante
(BGA) .......................................................................................................................... 184
PNT - ME - 033: Procedimiento para la preparación del medio Hektoen (HK) ................ 185
PNT - ME - 034: Procedimiento para la preparación del agar Kligler .............................. 187
PNT - ME - 035: Procedimiento para la preparación del agar nutritivo semisólido (ANS) ... 188
PNT - ME - 036: Procedimiento para la preparación del caldo Fraser semi (FS) ............. 189
PNT - ME - 037: Procedimiento para la preparación del caldo Fraser completo (FC) ..... 190
XVI ÍNDICE
PNT - ME - 038: Procedimiento para la preparación del agar Oxford .............................. 191
PNT - ME - 039: Procedimiento para la preparación del agar Palcam .............................. 192
PNT - ME - 040: Procedimiento para la preparación del agar triptona de soja-extracto de
levadura (TSYEA) ....................................................................................................... 194
PNT - ME - 041: Procedimiento para la preparación del caldo para la utilización de los
glúcidos (ramnosa y xilosa) ......................................................................................... 195
PNT - ME - 042: Procedimiento para la preparación del caldo de Park y Sanders ........... 196
PNT - ME - 043: Procedimiento para la preparación del agar de Karmali (AK) .............. 197
PNT - ME - 044: Procedimiento para la preparación del agar Butzler modificado ........... 199
PNT - ME - 045: Procedimiento para la preparación del caldo de Brucella (CB) ............. 200
PNT - ME - 046: Procedimiento para la preparación del agar de sangre Columbia .......... 201
PNT - ME - 047: Procedimiento para la preparación del agar de sangre Mueller-Hinton 202
PNT - ME - 048: Procedimiento para la preparación del agar citrato de hierro tres azúca-
res (TSI) ....................................................................................................................... 203
PNT - ME - 049: Procedimiento para la preparación del caldo triptona de soja (TSB) .... 205
CAPÍTULO SÉPTIMO
PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS (PNT -

RE - 001) ..................................................................................................................... 209
CAPÍTULO OCTAVO
PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

(PNT - RE - 002) ........................................................................................................ 215
CAPÍTULO NOVENO
PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS .................................. 217
Relación de reactivos y medio al que se añaden ................................................................ 219

PNT - RE - 003: Procedimiento para la preparación del suplemento antimicrobiano de
gentamicina .................................................................................................................. 220
PNT - RE - 004: Procedimiento para la preparación de la solución estéril de yema de hue-
vo ................................................................................................................................. 221
PNT - RE - 005: Procedimiento para la preparación del telurito potásico al 1% .............. 222
PNT - RE - 006: Procedimiento para la preparación de la sulfametacina al 0,2% ............ 223
PNT - RE - 007: Procedimiento para la preparación del sulfato de polimixina B al 4% ... 224
PNT - RE - 008: Procedimiento para la preparación del rojo de metilo ............................ 225
PNT - RE - 009: Procedimiento para la preparación de la solución de α-naftol . ............. 226
PNT - RE - 010: Procedimiento para la preparación de la solución de KOH al 40% ....... 227
PNT - RE - 011: Procedimiento para la preparación del reactivo de nitratos .................... 228
PNT - RE - 012: Procedimiento para la preparación del metabisulfito sódico al 1,2% ..... 229
PNT - RE - 013: Procedimiento para la preparación del citrato férrico amoniacal al 1% ..... 230
PNT - RE - 014: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el cal-
do Fraser semi .............................................................................................................. 231
PNT - RE - 015: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el cal-
do Fraser completo ...................................................................................................... 232
PNT - RE - 016: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agar
Oxford .......................................................................................................................... 233
ÍNDICE XVII
Palcam .......................................................................................................................... 234
PNT - RE - 018: Procedimiento para la preparación de la solución de antibióticos «A»
para el caldo de Park y Sanders ................................................................................... 235
PNT - RE - 019: Procedimiento para la preparación de la solución de antibióticos «B»
para el caldo de Park y Sanders ................................................................................... 236
de Karmali ................................................................................................................... 237
Butzler .......................................................................................................................... 238
PNT - RE - 022: Procedimiento para la preparación del reactivo de Kovacs .................... 239
PNT - RE - 023: Procedimiento para la preparación de la solución salina (SS) ................ 240
PNT - RE - 024: Procedimiento para la preparación del reactivo para la investigación de la
β-galactosidasa (ONPG) .............................................................................................. 241
PNT - RE - 025: Procedimiento para la preparación de la solución de fenilalanina al
0,5% (FA) .................................................................................................................... 242
PNT - RE - 026: Procedimiento para la preparación de la solución de cloruro férrico al
10% .............................................................................................................................. 243
BIBLIOGRAFÍA GENERAL ......................................................................................... 245
NORMATIVA .................................................................................................................. 247
INTRODUCCIÓN
El presente libro va dirigido a los profesionales y estudiantes de Microbiología del sec-

tor agro-alimentario en el control de las materias primas y los productos terminados, a
los laboratorios de análisis de alimentos, a los técnicos de laboratorio, a las Universi-
dades que realizan prácticas de microbiología de alimentos y de control de calidad.
Para aplicar los métodos aquí descritos se requiere que el laboratorio disponga
del material y equipos corrientes en un laboratorio de microbiología de alimentos.
Este material estará debidamente calibrado, verificado y mantenido en optimas condi-
ciones de funcionamiento según procedimientos propios del sistema de calidad de
cada laboratorio y adaptado a la norma ISO 7218 (Reglas Generales para los ensayos
microbiológicos). Además, cada método puede precisar algún material o equipo espe-
cifico.
La implantación de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) y Aseguramiento de
la Calidad obliga a normalizar todas las operaciones que se realizan en el laboratorio.
Por ello se han redactado una serie de procedimientos e instrucciones de trabajo con el
fin de dar uniformidad y consistencia a los análisis de alimentos que se realizan en los
laboratorios de microbiología y reducir los riesgos de error por parte de las personas
que realizan el ensayo.
Dado que la finalidad de trabajar con BPL es la obtención de resultados analíticos
de calidad y conseguir la aceptación mutua de estos resultados entre los diferentes paí-
ses, tenemos que seguirlas escrupulosamente.
La elaboración de estos documentos viene dada por la necesidad de tener un siste-
ma unificado de funcionamiento y gestión de los laboratorios, ya que hace falta ase-
gurar la calidad e integridad de los resultados y datos obtenidos en los análisis, y esta-
blecer esquemas de funcionamiento equivalentes entre laboratorios.
Así, se ha realizado una homogeneización de los métodos de análisis de alimentos,
unificando sus características en base a las normas internacionales correspondientes
(ISO: International Standard Organisation; EN: European Norme; NF: Norme Françai-
se; AFNOR: Association Française de Normalisation). Junto con ellos se han redacta-
do los procedimientos de preparación de los medios de cultivo y reactivos necesarios
para realizar los ensayos, de manera que hay una explicación de cada uno de los as-
pectos de los procedimientos de análisis.
Los resultados de los análisis son el producto final del trabajo del laboratorio, de
manera que se ha de obtener un resultado fiable, lo cual es el principal objetivo de to-
dos los sistemas de calidad. A causa de la complejidad de la norma de expresión de re-
XIX
XX INTRODUCCIÓN
sultados, en el apartado correspondiente de los PNT - AL (métodos) únicamente se ex-

pone el caso general y se ha redactado un procedimiento (PNT - AL - 002) que explica
detalladamente la manera de expresar los resultados en cada posible caso. En este
PNT se expone en unas tablas la forma de obtener y expresar el resultado del análisis
para cada PNT - AL. Además, en este procedimiento hay ejemplos de casos prácticos
que ayudan a la aplicación de las fórmulas.
Los métodos ISO (2 placas por dilución, confirmación de 5 colonias) suelen utili-
zarse como métodos de referencia y los métodos NF (1 placa por dilución, confirma-
ción de 3 colonias) se suelen emplear como métodos de rutina, siendo los dos métodos
normalizados.
Con el objetivo de uniformizar todos los procedimientos del laboratorio, se han re-
dactado unos Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) que dan las instruccio-
nes para la redacción de todos estos documentos, tanto de métodos de análisis de ali-
mentos (PNT - AL - 001) como los de preparación y control de calidad de los medios
de cultivo (PNT - ME - 001 y PNT - ME - 002) y reactivos (PNT - RE - 001 y PNT -
RE - 002) necesarios para ellos.
Los Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) son un conjunto de instruc-
ciones escritas de obligado y riguroso cumplimiento que describen cómo deben reali-
zarse determinados métodos de ensayo, cómo deben manejarse los equipos de análisis
o cómo se debe proceder ante cualquier otra actividad del laboratorio.
La preparación de algunos medios de cultivo (PNT - ME) o reactivos (PNT - RE) es
específica de una marca comercial. Antes de aplicarlos habrá que comprobar la com-
posición del medio o reactivo usado en el laboratorio y adaptarlo a las instrucciones del
proveedor o de la norma original.
La normalización es un proceso continuo de mejoría en los análisis, y aunque los
cambios sean lentos, debido al proceso de elaboración de normas internacionales, pa-
sado algunos años es aconsejable comprobar que la norma en la que se basa el PNT no
haya sufrido modificaciones.
En el momento de la redacción del libro, algún método ya había salido con peque-
ños cambios, como por ejemplo el de recuento de enterobacterias, método en el cual se
suprime la confirmación de colonias. Pero la experiencia demuestra que esta confir-
mación es muy útil a la hora de evitar falsos positivos en según qué productos. Así que
hemos dejado la confirmación, ya que siempre es más fácil quitar pasos que no añadir.
Las normas ISO, EN, NF, AENOR (Asociación Española de Normalización) se van
elaborando y revisando de manera continua. Como este proceso suele ser bastante
largo, es aconsejable consultar las siguientes páginas web:
• ISO: http://www.iso.ch
• EN: http://www.cenorm.be
• AFNOR: http://www.afnor.fr
• AENOR: http://www.aenor.es
Últimamente se está realizando la validación de los métodos ISO para el CEN

(Comité Europeo de Normalización), y como consecuencia se incluirán en las normas
los datos de precisión (expresados en repetibilidad y reproducibilidad) definidos durante
los ensayos interlaboratorios. Por este motivo, las normas de reciente publicación in-
cluyen en la expresión de resultados el apartado «Precisión». Las demás normas se re-
miten a una norma general, la ISO 7218.
INTRODUCCIÓN XXI
El año 2000 vio la aparición de la norma ISO 17025 Prescripciones generales para
la competencia de los laboratorios de calibración y ensayos. Esta norma es el resulta-
do de un intento de armonización entre los diferentes documentos existentes, como la
Guía ISO 25, la norma EN 45001 y las ISO 9000.
Los cambios a destacar son los que hacen hincapié en la relación laboratorio/clien-
te, teniendo en cuenta la información que busca el cliente y para qué quiere esta infor-
mación. En el caso de los ensayos, el método empleado para dar esta información es
fundamental, así como características como la precisión en términos de repetibilidad y
reproducibilidad, incertidumbres y validación.
En una nota se explica que para validar métodos conviene emplear una combina-
ción de las siguientes técnicas:
• Utilización de material de referencia.

• Comparación de los resultados con los obtenidos con otros métodos.
• Comparaciones interlaboratorios (ejercicios de verificación externa de calidad).
• Evaluación sistemática de los factores que puedan afectar a los resultados.
• Evaluación de las incertidumbres en base a principios teóricos y conocimiento
práctico del método.
Mediante las incertidumbres (material de referencia empleado, métodos y equipos,

condiciones ambientales, propiedades y condiciones del objeto sometido a análisis, el
técnico, etc.) y los límites de confianza del método, se presenta ahora un resultado, no
como un valor único, pero como un conjunto de valores numéricos, todos ellos proba-
bles. Hay que destacar que la palabra incertidumbre sale 34 veces en esta nueva norma.
Con los métodos que presentamos en este libro se persigue obtener un sistema de
trabajo cuyo objetivo es agilizar y facilitar las operaciones del laboratorio, al tener a
mano y desglosadas por pasos todas las operaciones a seguir para realizar el análisis,
asegurando al mismo tiempo que éstas se realizan correctamente.
Los esquemas; en color, son un fiel reflejo de los medios de cultivo y de todas las
reacciones bioquímicas que en ellos se producen; de esta manera; ayudarán a las per-
sonas que se inician en estos métodos; al reflejar las características del medio y de las
colonias que crecen en él. Así; se puede saber rápidamente si el medio que se ha de uti-
lizar se necesita en frascos, en tubos (con o sin campana) o en placas, conocer su color
original y observar los cambios que sufre en el proceso. Respecto a las colonias, al es-
tar dibujadas con su color, textura y halo, se puede comprobar si su crecimiento es el
correcto.
Así, estos PNT son unas guías de trabajo muy útiles a la hora de iniciar y seguir los
análisis.
CAPÍTULO PRIMERO
Procedimiento general de redacción de métodos

de análisis de alimentos (PNT - AL - 001)
PROCEDIMIENTO GENERAL DE REDACCIÓN
PNT - AL - 001
DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS
1. OBJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la redacción de los pro-
cedimientos de análisis de alimentos.
2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
Se aplica a todos los análisis realizados según los PNT - AL.
3. REFERENCIAS
• ISO 7218 (1996): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para los exámenes mi-
crobiológicos.
• Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL.
• Manual de Calidad del Laboratorio de Microbiología.
• Procedimiento General de Redacción de Documentos.
• Guías ENAC y ISO 17025.
4. METODOLOGÍA
1. Recopilar la documentación existente (normas internacionales: ISO, EN, AFNOR,

CNAN, etc., PNT del propio laboratorio, artículos en revistas especializadas...) y la do-
cumentación en proyecto sobre el procedimiento que queremos redactar.
2. Estudiar el modo operativo del laboratorio para el cual se realiza el documento.
3. Adaptar el Procedimiento General de Redacción de Documentos a este documento.
5. PROCEDIMIENTO
Los PNT realizados según el presente documento son instrucciones de trabajo para facilitar y agi-
lizar el análisis en el laboratorio, de manera que presentan una forma esquematizada de realizar
los ensayos. Por consiguiente, en caso de necesitar más detalles, se deberá acudir a la docu-
mentación original (norma en la que se basan).
Estos procedimientos de métodos de análisis de alimentos están formados por dos partes bien
diferenciadas:
• Instrucciones de trabajo
• Esquema del proceso.
Estos procedimientos constan de los siguientes apartados:
0. Carátula.
1. Definición.
2. Medios de cultivo.
4 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS
3. Reactivos.
4. Siembra.
5. Recuento (en caso que se realice).
6. Confirmación (en caso que se realice).
7. Expresión de resultados.
8. Esquema.
5.1. Carátula
La carátula debe encabezar cada una de las páginas del PNT y ha de incluir los siguientes apar-
tados:
• Título del PNT.

• Tipo y número del PNT.
• Norma en la que se basa.
• Número de página.
5.1.1. Título del PNT
En este apartado deberá constar:
• Tipo de análisis que se realiza: recuento o investigación, especificando si se utiliza alguna

técnica en particular (sin/con revivificación/pre-enriquecimiento, por recuento de colonias,
por número más probable...).
• El microorganismo o grupo de microorganismos que se estudia.
NOTA 1: Los nombres científicos de microorganismos, en latín, deben escribirse en cursi-

va, con letras minúsculas y la inicial en mayúscula (por ejemplo Salmonella), mientras que
los nombres de las familias, también en latín, se escribirán del mismo modo pero sin cursiva
(por ejemplo Enterobacteriaceae).
Para homogeneizar los distintos títulos que aparecen en la documentación (método de refe-
rencia, método de rutina, directiva general...) se ha optado por nombrar como MÉTODO HO-
RIZONTAL, que es la denominación que se aplica como título en las nuevas normas interna-
cionales. Con esta denominación indicamos que los métodos se aplican a todo tipo de productos,
salvo raras excepciones; estos casos particulares estarán indicados en los PNT sobre preparación
de la porción analítica y diluciones decimales y son específicos de cada laboratorio.
De esta manera, los métodos de referencia y de rutina se distinguen según la norma en la cual
están basados (los métodos de referencia se basan en normas ISO/EN y los de rutina en normas
AFNOR).
Asimismo, también se ha unificado el nombre del tipo de análisis, sustituyendo ENUME-
RACIÓN por RECUENTO.
5.1.2. Tipo y número del PNT
En el caso que nos ocupa, el número del documento vendrá precedido por las siglas PNT - AL,
en referencia a su condición de procedimiento normalizado de análisis de alimentos, seguidas de
un número de tres cifras (por ejemplo, PNT - AL - 011).
En determinados análisis, por ejemplo, cuando se realiza un recuento del mismo microor-
ganismo por dos técnicas distintas, el PNT se divide en dos partes. Este hecho se indicará en la
PROCEDIMIENTO GENERAL DE REDACCIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS 5
numeración, de manera que junto al número de tres cifras seguirá un punto «.» y el número «1»
o «2», según corresponda (por ejemplo, PNT - AL - 017.1).
NOTA 2: Este desdoblamiento se suele manifestar también en la norma original.
5.1.3. Norma en la que se basa
Dado que estos PNT son una adaptación de las normas correspondientes, según el método de tra-
bajo del laboratorio y, por tanto, se han hecho ciertos cambios en ellas, no se puede decir que se
han resumido sino que, basándose en ellas, para asegurar que los ensayos se realizan correcta-
mente, se ha esquematizado el proceso en función de su uso en el lugar de trabajo. Estos cam-
bios, en ningún caso son sustanciales.
Así pues, en la carátula debe figurar «BASADO EN» la norma ISO/EN (para métodos de re-
ferencia) o AFNOR (para métodos de rutina) correspondiente al ensayo, indicando su número y
la fecha de edición (mes y año).
5.2. Definición
En este apartado incluiremos todas aquellas definiciones de términos, acciones, etc., que apare-
cen en el procedimiento cuya descripción puede ser importante a la hora de realizar el análisis y
adaptarlo a la petición del cliente. Así, encontraremos en todos los casos la definición del mi-
croorganismo ensayado y, opcionalmente, otras explicaciones de aspectos del análisis que pue-
dan ser de utilidad.
El término o términos definidos se subrayarán, empezando la definición con letra mayúscula.
En la definición se ha hecho una unificación de las definiciones, de manera que, en todos los
casos, se termina con la frase «cuando el ensayo se realiza según el siguiente método», inde-
pendientemente de que el documento esté basado en una norma ISO/EN o en una AFNOR.
A continuación se exponen dos definiciones cuya explicación, para simplificar, se ha ex-
cluido de los PNT (pues se repiten de manera idéntica en todas las normas), pero que son de gran
importancia a la hora de realizar los ensayos.
• Recuento de microorganismos 1: Número de microorganismos 1 encontrado por gramo o

mililitro de muestra cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
• Investigación de microorganismos 1: Determinación de la presencia o ausencia de estos mi-
croorganismos 1 en una cantidad determinada de muestra cuando el ensayo se realiza según
el siguiente método.
5.3. Medios de cultivo
En esta sección se da la relación de todos los medios de cultivo que se utilizan en el ensayo, dis-
puestos según su orden de utilización, y acompañados, si se da el caso, de las siglas o abrevia-
turas con las que se los conoce habitualmente, entre paréntesis.
Dado que muchos de estos medios se denominan de distinta manera, según la casa comercial
que los suministra, los nombres que se les ha dado son aquéllos con los que se les conoce en el
laboratorio en el cual se han redactado estos PNT.
Para cada uno de estos medios de cultivo se ha realizado un PNT, en el cual se indica, entre
otras cosas, su composición, preparación, conservación y controles (ver PNT - ME correspon-
diente).
1
Remplazar por el nombre del microorganismo ensayado.
5.4. Reactivos
Este apartado estará formado por una lista de los reactivos necesarios para realizar el análisis.
Como en algunos métodos no son necesarios, esta sección puede no aparecer en el PNT.
Entendemos por reactivos:
• Suplementos de medios de cultivo.

• Sustratos bioquímicos para investigación de reacciones enzimáticas.
• Sustancias para poner en evidencia reacciones bioquímicas.
• Etcétera.
La denominación de estas sustancias es la que se les da en el laboratorio, aunque en algunos

casos se acompaña del nombre químico del componente principal.
NOTA 3: Los suplementos que se añaden a los medios de cultivo sólo se incluyen a la lista
de reactivos cuando se incorporan al medio base en el momento de realizar el análisis.
Para cada uno de estos reactivos se ha realizado un PNT, en el cual se indica, entre otras co-
sas, su composición, preparación, conservación y controles (ver PNT - RE correspondiente).
Las cantidades a añadir, así como su presentación, corresponden a la marca utilizada en el la-
boratorio en el cual se han realizado los PNT, de manera que pueden variar en función del pro-
veedor; en este caso se deberá cumplir con sus instrucciones.
5.5. Siembra
En este apartado se explican, paso por paso, cada una de las acciones a realizar en el ensayo, des-
de la siembra hasta la incubación, indicando:
• Medios de cultivo necesarios, señalando si se encuentran en tubos o en placas; en este caso

se indicará si la siembra es en superficie o por inclusión y si se realiza doble capa. También
constará en este apartado si los medios han de tener características particulares (tempera-
tura, estar regenerado...).
• Temperatura y tiempo de incubación. En general, la incubación se realizará en estufas re-
guladas a la temperatura indicada; en caso contrario, por ejemplo, cuando se realiza en
baño termostático, deberá constar en el apartado.
En aquellos análisis en los que el periodo de incubación no tiene una duración defini-
da, pues depende de la velocidad de crecimiento de las colonias, se ha indicado el tiempo
mínimo de incubación y, en caso que no se observe crecimiento, se da, entre paréntesis, el
periodo máximo durante el cual se examinará si hay o no desarrollo de colonias, con la fra-
se «+ x h si es necesario».
En el caso de reacciones bioquímicas, se indica de esta manera el tiempo máximo de
incubación para asegurar la negatividad.
Por ejemplo, si se indica que la incubación debe ser a 30°C ± 1°C durante 24 h (+ 48
si es necesario), significa que si después de 24 h de incubación no se observa un creci-
miento característico del microorganismo ensayado, se deberán mantener las placas en la
estufa hasta el tiempo máximo indicado.
En los procedimientos donde hay etapas muy diferenciadas, se ha dividido el apartado en las
distintas fases: Pre-enriquecimiento, Enriquecimiento, Aislamiento, Selección (puede que no se
den todas).
En los casos en que se realice aislamiento y selección de colonias para realizar la posterior
confirmación, se deberán describir las características (color, tamaño, si forman o no halo de lisis
PROCEDIMIENTO GENERAL DE REDACCIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS 7
o de precipitado y, de ser así, de qué color) de las colonias típicas del microorganismo ensayado
en el medio correspondiente (denominadas en todos los casos como «COLONIAS CARAC-
TERÍSTICAS»).
NOTA 4: En general, la dilución madre se prepara con 10 mililitros (si el producto es lí-
quido) ó 10 gramos (para el resto de productos) de muestra en 90 mL de peptona salina (PS)
a T ambiente.
5.6. Recuento
En esta sección se darán las características de los tubos positivos (ensayo en medio líquido) o de
las colonias que se han de contar de cada placa (ensayo en medio sólido) y, si se da el caso, los re-
quisitos de los tubos/placas que se han de retener para realizar sobre sus colonias las pruebas de
confirmación bioquímica. En este caso, el apartado de RECUENTO puede aparecer después del de
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA incluido en el apartado EXPRESIÓN DE RESULTADOS.
5.7. Confirmación
En caso de que el método requiera la realización de pruebas bioquímicas y serológicas para con-
firmar las colonias, se explicará cada una de ellas en este apartado, indicando sobre qué colonias
o tubos se realiza, los medios y reactivos necesarios, la temperatura y el tiempo, señalando tam-
bién el resultado que debe considerarse como positivo.
NOTA 5: En este apartado no se explica el modo operatorio de las pruebas de la oxidasa y

la catalasa, ni la realización de las tinciones Gram, ya que estas operaciones, al ser de uso ha-
bitual en el laboratorio, han de ser conocidas por todo el personal.
Debido a su extensión e importancia sobre el resultado del análisis, en algunos casos se ha

añadido como apartados independientes la LECTURA y INTERPRETACIÓN de las pruebas
bioquímicas y serológicas.
5.8. Expresión de resultados
Este apartado es un extracto del PNT - AL - 002 (Procedimiento de Expresión de Resultados) para
cada método de análisis, de manera que se indica únicamente la manera de calcular el resultado
para el caso general y se remite al PNT - AL - 002 para el resto de casos, así como para la con-
sulta del significado de los símbolos que aparecen en las fórmulas, y siempre en caso de duda.
Así, en el caso de recuento en medio sólido, se indicará qué placas se han de retener para cal-
cular el resultado (en función del número de colonias, señalando si se trata de colonias en total,
colonias características o colonias identificadas) y mediante qué expresión se obtendrá el número
de colonias.
En el caso de investigación, se indicarán las características necesarias para considerar que en
la muestra hay presencia o no del microorganismo estudiado.
Para el caso de recuento en medio líquido, se indicará a partir de qué tubos se ha de calcular
el NMP.
5.9. Esquema
El esquema es un resumen visual de todo el proceso, indicando con dibujos el orden a seguir para
realizar cada uno de los pasos del ensayo; este apartado estará en la hoja final del documento.
En una columna situada a la izquierda de la hoja indicaremos el día de análisis en el que nos
encontramos, de manera que en el resto de la hoja se muestren las operaciones que se deben
realizar durante el mismo. Las acciones a realizar en días distintos están separadas por una barra
con una flecha.
Señalar que en los procedimientos en los que en el texto se han diferenciado las distintas eta-
pas del análisis, también se ha indicado cada paso en el esquema.
El esquema empieza con la preparación de la dilución madre y el banco de diluciones
(cuando es necesario). Es importante destacar que el número de diluciones que se ha dibujado es
orientativo, de manera que se prepararán tantas diluciones como sea necesario, independiente-
mente de la cantidad de tubos que se hayan dibujado.
La muestra líquida, si el ensayo se realiza con un producto líquido, o la dilución madre, si se
realiza con otros productos, están representadas por una bolsa de «Stomacher», y el resto de di-
luciones por un tubo con 9 mL de peptona salina (PS) (salvo en casos particulares, en los
cuales se indicará el medio utilizado para hacer las diluciones). Debajo de cada elemento del
banco de diluciones se indicará el orden de dilución correspondiente, sin paréntesis para ensayos
con productos líquidos y entre paréntesis cuando se realiza dilución madre. Este orden de dilu-
ción se escribirá en todos los pasos de la siembra.
A continuación, mediante unas flechas que salen de cada dilución, se indica la cantidad de
muestra que se ha de sembrar en la placa o tubo. Cuando se siembran placas, cuando se realiza
siembra superficial, el nombre del medio a sembrar estará encima de ellas mientras que se co-
locará debajo si la siembra es por inclusión, indicando en este caso la cantidad y temperatura del
medio a añadir.
Cuando se siembra en placas, en caso de que se deba extender el inóculo con asa de Dri-
galski, en el esquema aparecerá dibujada el asa, mientras que si la siembra es por aislamiento, en
las placas se pintarán estrías (este aislamiento por estrías puede realizarse de distintas maneras).
Si la siembra es por picadura en un tubo con medio sólido, se dibujará una línea vertical que ocu-
pe el medio, desde la parte superior.
Asimismo, cuando se siembra en medio líquido con un asa de Kolle, se dibujará este utensilio
junto a los tubos.
Debajo de las placas o tubos se indicará el tiempo y la temperatura de incubación, señalando
también si hay características particulares que deban ser tenidas en cuenta.
En los pasos de recuento y confirmación se seguirá el mismo procedimiento, dibujando en las
placas el crecimiento de las colonias.
El esquema finaliza con la frase «lectura y expresión de resultados», si no se ha realizado
confirmación; o bien, si se han efectuado pruebas bioquímicas y/o serológicas, se darán los re-
sultados del caso favorable. En los recuentos en medio líquido se remitirá al cálculo del NMP.
CAPÍTULO SEGUNDO
Procedimiento de expresión de resultados

(PNT - AL - 002)
PNT - AL - 001 PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS
1. OBJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la expresión de resul-

tados de los análisis de alimentos.
Se aplica a todos los análisis realizados según los PNT - AL.
3. REFERENCIAS
crobiológicos.
• AFNOR XP V 08-102 (1997): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para el re-
cuento de colonias y expresión de resultados. Caso de recuento en medio sólido.
• Documentos del Laboratorio de Microbiología: Manual de Calidad y Procedimiento Ge-
neral de Redacción de Documentos.
4. GENERALIDADES
El presente documento está formado por una serie de tablas que muestran la manera de reali-
zar la expresión de resultados para cada método horizontal de recuento o investigación según
la norma ISO, EN o AFNOR correspondiente. Estas tablas están ordenadas según su orden de
PNT - AL, y están divididas según los tres casos posibles:
• Caso general.
• Estimación de pequeños números.
• Ninguna colonia.
Para completar este procedimiento, en el ANEJO 1 se adjuntan las tablas necesarias para el
cálculo de los resultados y en el ANEJO 2 se incluyen ejemplos de cálculo para cada uno de los
casos posibles, junto con un diagrama para facilitar su localización.
5. FÓRMULAS
En general, para obtener el resultado de los recuentos de microorganismos en medio sólido, se

utiliza la media ponderada. En los métodos de referencia, ésta se obtiene con la expresión:
ΣC
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
Para los métodos de rutina, la expresión utilizada es:
ΣC
N=
1,1 ⋅ d
11
Los resultados obtenidos mediante las fórmulas se han de redondear a dos cifras significati-
vas, utilizando las reglas habituales, tal como se describe en el Apartado 6 y retener como re-
sultado el número de microorganismos por mililitro (en productos líquidos) o por gramo (en el
resto de productos), expresado como un número comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la
potencia de 10 adecuada.
Dado que en algunos casos los mismos conceptos se expresaban con letras distintas según la
norma de la que estaban extraídos, se ha hecho una recopilación y homogeneización de términos,
para que cada símbolo tenga el mismo significado en todas las fórmulas.
5.1. Caso general
Para que un resultado se considere válido, se estima que en general es necesario contar las co-
lonias de al menos una placa que contenga un mínimo de 15 colonias.
En las fórmulas que se utilizan en el caso general, aparecen unos símbolos cuyos significados
se explican a continuación:
• N: número de microorganismos por mililitro o por gramo.

• ΣC: suma de las colonias contadas en todas las placas retenidas de dos diluciones sucesivas
y con al menos una placa con un mínimo de 15 colonias.
• Σa: suma de las colonias del microorganismo 1 calculadas después de la identificación, en
todas las placas retenidas de dos diluciones sucesivas y con al menos una placa con un mí-
nimo de 15 colonias.
• V: volumen de inóculo aplicado a cada placa, en mililitros.
• n1: número de placas retenidas en la primera dilución.
• n2: número de placas retenidas en la segunda dilución.
• d: nivel de dilución correspondiente a la primera dilución retenida (d = 1 cuando la mues-
tra para análisis se ha sembrado directamente (productos líquidos)).
Para el caso de recuento después de identificación:
• b: número de colonias que responden a los criterios de identificación.

• C: número total de colonias por placa (antes de identificación).
• A: número de colonias características que se resiembran (en general A = 5 en método de re-
ferencia y A = 3 en método de rutina).
Para estafilococos coagulasa positivos (CPS):
• Ac: número de colonias características resembradas.

• Anc: número de colonias no características resembradas.
• bc: número de colonias características que son coagulasa positivas.
• bcn: número de colonias no características que son coagulasa positivas.
• cc: número total de colonias características de estafilococos coagulasa positivos contados en
la placa.
• cnc: número total de colonias no características de estafilococos coagulasa positivos con-
tados en la placa.
1
PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002) 13
5.2. Estimación de pequeños números
En las fórmulas que se utilizan en el caso de estimación de pequeños números, aparecen unos
símbolos, cuyos significados se explican a continuación:
• Ne: número estimado de microorganismos por mililitro o por gramo.

• C: número de colonias contadas.
• Σe: suma de las colonias contadas después de la identificación en las dos placas (método de
referencia).
• a: número de colonias contadas después de la identificación.
• V: volumen de inóculo aplicado a cada placa, en mililitros.
• d: nivel de dilución correspondiente a la dilución madre o a la primera dilución sembrada
o retenida (d = 1 cuando la muestra para análisis se ha sembrado directamente (productos
líquidos)).
5.3. Casos particulares
En las fórmulas que se utilizan en el caso de estimación de pequeños números, aparecen un sím-
bolo, cuyo significado se explica a continuación.
• d: nivel de dilución correspondiente a la dilución retenida.
6. REDONDEO
• Si la última cifra es inferior a 5, la cifra precedente no se modifica.

• Si la última cifra es superior o igual a 5, la cifra precedente será aumentada una unidad.
Proceder de esta forma secuencialmente con todas las cifras del número obtenido hasta que
se obtengan dos cifras significativas.
7. PRECISIÓN Y LÍMITES DE CONFIANZA
La precisión de los métodos de ensayo corresponde, según la ISO 17025, a la determinación de

la repetibilidad y de la reproducibilidad de un método de ensayo normalizado por ensayos in-
terlaboratorios.
En la expresión de resultados hay un apartado de PRECISIÓN, que sólo se refleja en aquellos
procedimientos basados en normas que incluyen esta valoración; sin embargo, se supone que en
futuras modificaciones de las normas internacionales este apartado aparecerá en todas ellas, ya que
la fiabilidad del método es muy importante a la hora de aceptar o rechazar el lote, producto, etc.
De la misma manera, en futuras modificaciones de estas normas se cambiarán los límites su-
periores e inferiores para los recuentos de colonias, adaptándose a los límites de confianza; así,
el límite superior pasará de 300 a 324, y el límite inferior de 15 a 10.
Para estimar la validez del resultado obtenido y evitar interpretaciones demasiado estrictas,
es necesario determinar el intervalo de confianza que caracterice el reparto estadístico de los mi-
croorganismos en la muestra.
Así, el límite de confianza δ que caracteriza la dispersión microbiana en la muestra, con una
probabilidad del 95%, se calcula mediante la expresión siguiente:
⎡ ΣC 1, 92 1, 96 ΣC ⎤ 1
δ=⎢ + ± ⎥⋅
⎣ B B B ⎦ d
con:
B = V · (n1 + 0,1 · n2)
siendo:
• ΣC: suma de las colonias contadas en todas las placas retenidas.

• n1: número de placas retenidas en la primera dilución.
• n2: número de placas retenidas en la segunda dilución.
• V: volumen de inóculo sembrado en cada placa, en mililitros.
• d: nivel de dilución correspondiente a la primera dilución retenida.
NOTA: En el caso de recuento después de identificación, sustituir ΣC por Σa.
CASO PRÁCTICO: El resultado del análisis de un alimento es el siguiente:
Dilución
–1 –2
10 10 10–3 10–4
> 300 198 11 2
Número de colonias > 300 202 11 3
Placas retenidas
Con N = 1,9 · 104 por gramo, para 422 colonias contadas en las placas retenidas. El interva-
lo de confianza δ es:
⎡ 422 1, 92 1, 96 422 ⎤ 1
δ=⎢ + ± ⎥⋅
⎣ 2, 2 2, 2 2, 2 ⎦ 10 –2
δ = (191,82 + 0,87 ± 18,30) · 102
Así, los límites de confianza son:
δ1 = 1,7 · 104 y δ2 = 2,1 · 104
Para las técnicas de NMP y de estimación de pequeños números, estos límites de confianza,
en la práctica, se suelen obtener mediante las tablas que se adjuntan en el ANEXO 1.
Señalar que las variaciones que se dan aún pueden ser más importantes en la práctica, en par-
ticular entre los resultados obtenidos por distintos microbiólogos.
8. COMENTARIOS
En este apartado queremos recalcar algunos aspectos de la norma AFNOR XP V 08-102 que son
nuevos respecto a las normas publicadas anteriormente y que pueden ser útiles a la hora de re-
solver dudas.
8.1. Casos particulares
Los casos particulares, aunque son bastante improbables, se pueden presentar (por ejemplo, nú-
meros muy diferentes de colonias entre las dos placas de una misma dilución, o bien una pro-
porción muy alejada de la del factor de dilución entre las placas de dos diluciones sucesivas). En
estos casos, un microbiólogo competente deberá examinar, interpretar y, si es necesario, recha-
zar los resultados obtenidos.
8.1.1. Recuento de colonias en total. Método de rutina
En el caso que únicamente la placa de la última dilución sembrada tenga menos de 300 colonias
(o cualquier otro número indicado en la norma específica), calcular el número N′ de microorga-
nismos 2 presentes en la muestra de ensayo con ayuda de la ecuación:
C
N′ =
V ⋅d
siendo:
• C: suma de las colonias contadas en la placa con un mínimo de 15 colonias.

• V: volumen de inóculo sembrado en cada placa, en mililitros.
• d: nivel de dilución correspondiente a la dilución retenida.
8.2. Aplicación de los límites de confianza
En el caso que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número indicado
en la norma específica) en las dos placas de una primera dilución d1, con un número de colonias
menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente:
• si el número total de colonias en cada una de las placas de la dilución d1 está comprendido
entre 324 y 300 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a
300), utilizar el modo de cálculo del caso general;
• si el número total de colonias en cada una de las placas de la dilución d1 es superior a 324
(límite superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300), retener
sólo el resultado de los recuentos de la dilución d2 y realizar una estimación de pequeños
números, excepto en el caso de recuento de colonias en total con un número máximo fija-
do en 300 colonias, si el último resultado es menos que 10 (límite inferior del intervalo de
confianza de una media ponderada igual a 15).
2
16
9. TABLAS DE RESULTADOS
PNT - AL - 003. Recuento sin microorganismos a 30°C (ISO 4833)

Caso general Estimación de pequeños Ninguna colonia
Placas retenidas Cálculo números
• Hasta 300 colonias, al nivel de ΣC • Si las dos placas retenidas, al ni- • Si en ninguna de las dos placas
dos diluciones sucesivas. N= vel de la muestra a analizar (pro- al nivel de la muestra a analizar
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
diuctos líquidos) o de la dilución (productos líquidos) o de la dilu-
• Una placa ha de tener un míni- madre (otros productos), contie- ción madre (otros productos)
mo de 15 colonias. nen menos de 15 colonias, ha- hay colonias, dar el resultado
cer la media m de las colonias como:
contadas en las dos placas y ex-
| Menos de 1 microorganismo
presar el resultado como:
por mililitro (productos líqui-
| Ne = m: número estimado de dos).
microorganismos por mililitro
| Menos de 1/d microorganis-
(productos líquidos).
mos por gramo (otros produc-
| Ne = m/d: número estimado de tos).
microorganismos por gramo
(otros productos).
Precisión
MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los Ver TABLA 1
límites de confianza de este método varían del ±2% al ±37%
PNT - AL - 004. Recuento sin microorganismos a 30°C (NF V 08-051)
• Menos de 300 colonias, al nivel ΣC • Si la placa retenida, al nivel de la • Si no hay ninguna colonia en la
de dos diluciones sucesivas. N= muestra a analizar (productos lí- placa al nivel de la muestra a
1,1 ⋅ d
quidos) o de la dilución madre analizar (productos líquidos) ni
• Una placa ha de tener un míni- (otros productos), contiene me- en la de dilución madre (otros
mo de 15 colonias. nos de 15 colonias, dar el resul- productos), dar el resultado
tado como: como:
| | Menos de 1 microorganismo
Ne = C: número estimado de
microorganismos por mililitro por mililitro (productos líqui-
(productos líquidos). dos).
| | Menos de 1/d microorganis-

Ne = C/d: número estimado de
microorganismos por gramo mos por gramo (otros produc-
(otros productos). tos).
Precisión
PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)
límites de confianza de este método varían del ±10,5% para 300 colonias
contadas y del –37% al +61% para 15 colonias contadas.
17
18
PNT - AL - 005. Recuento de levaduras y mohos (ISO 7954)

• Menos de 150 colonias, al nivel ΣC • Si la placa, al nivel de la muestra • Si en ninguna de las dos placas
de dos diluciones sucesivas. N= a analizar (productos líquidos) o al nivel de la muestra a analizar
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
de la dilución madre (otros pro- (productos líquidos) o de la dilu-
ductos), contiene menos de 15 ción madre (otros productos)
colonias, expresar el resultado hay colonias, dar el resultado
como número estimado de la si- como:
guiente manera:
| Menos de 1 levadura y moho
| Ne = C: levaduras y mohos por por mililitro (productos líqui-
mililitro (productos líquidos). dos).
| | Menos de 10 levaduras y mo-

Ne = C/d: levaduras y mohos
por gramo (otros productos). hos por gramo (otros produc-
tos).
Precisión
límites de confianza de este método varían del ±16% al ±52%.
PNT - AL - 006. Recuento de levaduras y mohos (XF V 08-059)
• Menos de 150 colonias, al nivel • Para recuento en superficie: • Si la placa, al nivel de la muestra • Si no hay ninguna colonia en la
de dos diluciones sucesivas. a analizar (productos líquidos) o placa al nivel de la muestra a
ΣC de la dilución madre (otros pro- analizar (productos líquidos) ni
N=
• Una placa ha de tener un míni- 0,11 ⋅ d ductos), contiene menos de 15 en la de la dilución madre (otros
mo de 15 colonias. colonias, expresar el resultado productos), dar el resultado
• Para recuento en profundidad: como número estimado de la si- como:
guiente manera:
ΣC | Menos de 10 colonias por mi-
N= |
1,1 ⋅ d Ne = 10 × C: levaduras y mo- lilitro (productos líquidos).
hos por mililitro (productos lí-
| Menos de 10/d colonias por
quidos).
gramo (otros productos).
| N e = 10 × C/d: levaduras y
mohos por gramo (otros pro-
ductos).
Precisión
Ver ISO 7218 Ver TABLA 1

19
20
PNT - AL - 007.1. Recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica del NMP (ISO 7402)
Caso general Cálculo del número más probable (NMP)
• Contar el número de tubos posi- • A partir del número de tubos positivos de cada una de las diluciones, determinar el coeficiente del NMP con
tivos para cada dilución. ayuda de una tabla (ver TABLA 3).
Confirmación • Para productos líquidos, el número de Enterobacteriaceae por mililitro es igual al coeficiente NMP dividido
por 10.
• Si al menos una de las colonias
características seleccionadas • Para el resto de productos, el número de Enterobacteriaceae por gramo es igual al coeficiente NMP.
para la confirmación bioquími-
ca es:
| Oxidasa k
| Glucosa j
El tubo a partir del cual se ha

realizado el subcultivo se consi-
dera positivo.
Precisión
En la técnica del NMP se pueden observar variaciones importantes. Los resultados obtenidos según este método deberán utilizarse con prudencia.
Los límites de confianza se dan en las TABLAS 2 y 3.
PNT - AL - 007.2. Recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica por recuento de colonias (ISO 7402)
• Menos de 150 colonias, al nivel • A partir de los resultados de la • Si las dos placas retenidas, al ni- • Si en ninguna de las dos placas
de dos diluciones sucesivas. confirmación bioquímica reali- vel de la muestra a analizar (pro- al nivel de la muestra a analizar
zada sobre cinco colonias por ductos líquidos) o de dilución (productos líquidos) o de dilu-
Confirmación placa, calcular el número a de madre (otros productos), contie- ción madre (otros productos)
Enterobacteriaceae identificadas nen menos de 15 colonias carac- hay colonias características, dar
• Si al menos un 80% de las colo- a partir de la expresión: terísticas, hacer la media m de el resultado como:
nias características seleccionadas las colonias contadas en las dos
son confirmadas como Entero- b | Menos de 1 Enterobacteria-
placas y expresar el resultado
a = ⋅C
bacteriaceae (oxidasa k y glu- A como: ceae por mililitro (productos
cosa j el número de microor- líquidos).
ganismos presentes será el • Calcular el número N de Ente- | Ne = m: número estimado de
encontrado en el recuento. | Menos de 1/d Enterobacteria-
robacteriaceae identificadas pre- Enterobacteriaceae por milili-
sentes en la muestra problema tro (productos líquidos). ceae por gramo (otros produc-
• En cualquier otro caso, el núme- con la expresión: tos).
ro de microorganismos se calcu- | Ne = m/d: número estimado de
lará a partir del porcentaje de co- Σa Enterobacteriaceae por gramo
lonias oxidasa k y glucosa j N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d (otros productos).
en relación al número total de
colonias seleccionadas.
Precisión
límites de confianza de este método varían del ±16% al ±52%.
21
22
PNT - AL - 008. Investigación de Enterobacteriaceae con pre-enriquecimiento (ISO 8523)
• Si una de las colonias características es oxidasa k y glucosa j, la muestra se considera positiva en Enterobacteriaceae.
• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Enterobacteriaceae, según la cantidad
examinada, en x gramos de producto.
PNT - AL - 009. Recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica por recuento de colonias (NF V 08-054)
• Un máximo de 150 colonias ca- • A partir de los resultados de la • Si la placa, al nivel de la muestra • Si en la placa, al nivel de la
racterísticas y no características, confirmación bioquímica reali- a analizar (productos líquidos) o muestra a analizar (productos lí-
al nivel de dos diluciones suce- zada sobre cinco colonias por de la dilucion madre (otros pro- quidos) o de la dilución madre
sivas. placa, calcular el número de En- ductos), contiene menos de 15 (otros productos) no hay ningu-
terobacteriaceae identificadas a colonias características, dar el na colonias de Enterobaceria-
• Una placa ha de tener un míni- partir de la expresión: resultado como: ceae, dar el resultado como:
mo de 15 colonias característi-
cas. b | | Menos de 1 Enterobacteria-
Ne = a: número estimado de
a = ⋅C
A Enterobacteriaceae por milili- ceae por mililitro (productos
tro (productos líquidos). líquidos).
• Calcular el número N de Ente-
| | Menos de 1/d Enterobacteria-
robacteriaceae identificadas pre- Ne = a/d: número estimado de
sentes en la muestra problema Enterobacteriaceae por gramo ceae por gramo (otros produc-
con la expresión: (otros productos). tos).
Σa
N=
1,1 ⋅ d
Precisión
límites de confianza de este método varían del +17,3% al –14,7% para
150 colonias contadas y del +63,4% al –37,8% para 15 colonias conta-
das.
23
24
PNT - AL - 010. Recuento de coliformes totales. Técnica del NMP (ISO 4831)
1. ELECCIÓN DE LAS DILUCIONES
Para cada muestra, retener tres diluciones siguiendo las siguientes reglas, según el caso:
1. Al menos una dilución presenta tres tubos positivos:

Elegir la dilución más elevada (con menor concentracion de muestra) que presente los tres tubos positivos, así como las dos diluciones siguientes
que tengan tubos positivos (es decir, aquéllas donde las concentraciones de muestra sean iguales a 1/10 y 1/100 respecto a la primera dilución es-
cogida).
Si no se ha preparado un número suficiente de diluciones en donde la más elevada presente tres tubos positivos, elegir las tres diluciones más ele-
vadas de la serie (es decir, aquéllas que tengan una concentracion más baja de la muestra).
2. Ninguna dilución presenta tres tubos positivos:

Cuando el caso 1 no se pueda aplicar, elegir las tres diluciones más elevadas de la serie (con menor concentracion de muestra) que contenga al me-
nos un tuvo positivo.
3. Casos particulares:
En todos los casos donde más de una de las tres diluciones seleccionadas no den tubos positivos, escoger la dilución menos elevada que no presente
tubos positivos (es decir, la que tiene una mayor concentración de muestra) y las dos diluciones más bajas precedentes (es decir, aquéllas que tie-
nen concentraciones de muestra 10 y 100 veces la de la primera dilución escogida), excepto cuando no se encuentran tubos positivos más que al
nivel de la primera dilución preparada a partir de la muestra.
En este último caso es necesario escoger las tres primeras diluciones para el cálculo del NMP, aún cuando si esta serie tiene dos diluciones que no
dan tubos positivos.
PNT - AL - 010. Recuento de coliformes totales. Técnica del NMP (ISO 4831) (Continuación)
2. DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE NMP
Hay que comprobar que el número de muestras analizadas por lote (ver TABLA 2 o TABLA 4), sea la adecuada para que el resultado sea válido
desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de muestras examinadas y de la decisión de aceptar o rechazar los re-
sultados de la categoría 2 (ver TABLA 5).
Para cada secuencia considerada aceptable, determinar el NMP mediante las TABLAS 2 y 4.
3. CÁLCULO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
El número de coliformes por mililitro o por gramo se obtiene multiplicando el coeficiente NMP por el inverso de la dilución más baja (la que tie-
ne mayor concentración de muestra). Cuando la dilución retenida más baja corresponde a los tubos preparados a partir del medio a doble con-
centración (sembrados con 10 mL) habrá que dividir por 10
PRECISIÓN
25
26
PNT - AL - 011. Recuento de coliformes totales. Técnica por recuento de colonias (ISO 4832)
• Menos de 150 colonias caracte- ΣC • Si cada una de las placas retenidas con- • Si en ninguna de las dos placas,
rísticas, al nivel de dos dilucio- N= tiene menos de 15 colonias característi- al nivel de la muestra a analizar
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
nes sucesivas. cas, calcular el número estimado de Ne (producto líquido) o de la dilu-
de coliformes mediante la expresión del ción madre (otros productos),
• Una placa ha de tener un míni- caso general. hay colonias características, ex-
mo de 15 colonias característi- presar como:
cas. • Si las dos placas retenidas, al nivel de la
| Menos de 1 coliforme por mi-
muestra a analizar (producto líquido) o
de la dilución madre (otros productos), lilitro (productos líquidos).
contienen menos de 15 colonias caracte-
| Menos de 1/d coliformes por
rísticas, dar el resultado como:
| Menos de 15 coliformes por mililitro
| Menos de 15/d coliformes por gramo

(otros productos).
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los • Si cada placa contiene menos de 15 co-
casos, los límites de confianza de este método varían del ±16% lonias características, multiplicar los lí-
al ±52%. mites inferiores y superiores por 1/d para
obtener los límites de confianza.
• Para estimación de pequeños números,

ver TABLA 1.
PNT - AL - 012. Recuento de coliformes totales (NF V 08-050)
• Menos de 150 colonias caracte- ΣC • Si la placa, al nivel de la muestra • Si en la placa, al nivel de la

rísticas, al nivel de dos dilucio- N= a analizar (productos líquidos) o muestra a analizar (productos lí-
1,1 ⋅ d
nes sucesivas. de la dilucion madre (otros pro- quidos) o de la dilución madre
ductos), contiene menos de 15 (otros productos), no hay ningu-
• Una placa ha de tener un míni- colonias características: na colonia característica, dar el
mo de 15 colonias característi- resultado como:
cas. | C = coliformes por mililitro
| Menos de 1 coliforme por mi-
lilitro (productos líquidos).
| N = C/d: coliformes por gra-
| Menos de 1/d coliforme por
mo (otros productos).
Precisión
límites de confianza de este método varían del –16% al +18% para 150
colonias contadas, y del –37% al +61% para 15 colonias contadas.
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28
PNT - AL - 013. Recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica el NMP (ISO 7251)
1. ELECCIÓN DE LAS DILUCIONES
Para cada muestra, retener tres diluciones siguiendo las siguientes reglas, según el caso:
1. Al menos una dilución presenta tres tubos positivos:
Elegir la dilución más elevada (con menor concentración de muestra) que presente los tres tubos positivos, así como las dos diluciones siguientes
que tengan tubos positivos (es decir, aquéllas donde las concentraciones de muestra sean iguales a 1/10 y 1/100 respecto a la primera dilución es-
cogida).
Si no se ha preparado un número suficiente de diluciones en donde la más elevada presente tres tubos positivos, elegir las tres diluciones más ele-
vadas de la serie (es decir, aquéllas que tengan una concentración más baja de la muestra).
2. Ninguna dilución presenta tres tubos positivos:

Cuando el caso 1 no se pueda aplicar, elegir las tres diluciones más elevadas de la serie (con menor concentración de muestra) que contengan al
menos un tubo positivo.
3. Casos particulares:
En todos los casos donde más de una de las tres diluciones seleccionadas no den tubos positivos, escoger la dilución menos elevada que no pre-
sente tubos positivos (es decir, la que tiene una mayor concentración de muestra) y las dos diluciones más bajas precedentes (es decir, aquéllas que
tienen concentraciones de muestra 10 y 100 veces la de la primera dilución escogida), excepto cuando no se encuentran tubos positivos más que
al nivel de la primera dilución preparada a partir de la muestra.
En este último caso, es necesario escoger las tres primeras diluciones para el cálculo del NMP, aún cuando si esta serie tiene dos diluciones que
no dan tubos positivos.
PNT - AL - 013. Recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica el NMP (ISO 7251) (Continuación)
2. DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE NMP
Hay que comprobar que el número de muestras analizadas por lote (ver TABLA 2 o TABLA 4), sea la adecuada para que el resultado sea válido
desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de muestras examinadas y de la decisión de aceptar o rechazar los re-
sultados de la categoría 2 (ver TABLA 5).
Para cada secuencia considerada aceptable, determinar el NMP mediante las TABLAS 2 y 4.
3. CÁLCULO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

El número de Escherichia coli por mililitro o por gramo se obtiene multiplicando el coeficiente NMP por el inverso de la dilución más baja (la que
tiene mayor concentración de muestra). Cuando la dilución retenida más baja corresponde a los tubos preparados a partir del medio a doble con-
centración (sembrados con 10 mL) habrá que dividir por 10.
Si el NMP es inferior al 0,3 microorganismos por mililitro o por gramo, y si se ha utilizado el método operativo apropiado para un número bajo
de Escherichia coli presuntivos, el resultado deberá expresarse como «ausencia de Escherichia coli presuntivos en 1 mL o 1 g. de producto».
PRECISIÓN

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30
PNT - AL - 014. Recuento de Escherichia coli β-glucuronidasa positivos (NF V 08-053)

• Menos de 150 colonias caracte- ΣC • Si la placa, al nivel de la muestra a analizar • Si no hay ninguna colonia en la
rísticas y/o no características, al N= (productos líquidos) o de la dilución ma- placa al nivel de la muestra a
1,1 ⋅ d
nivel de dos diluciones sucesi- dre (otros productos) contiene menos de 15 analizar (productos líquidos) o
vas. colonias características, dar el resultado de la dilución madre (otros pro-
como: ductos), dar el resultado como:
• Una placa ha de tener un míni-
mo de 15 colonias característi- | | Menos de 1 Escherichia coli
Ne = a: número estimado de Escherichia
cas. coli β-glucuronidasa positivos por mili- β-glucuronidasa positivos por
litro (productos líquidos). mililitro (productos líquidos).
| | Menos de Escherichia coli β-

Ne = a/d: número estimado de Escheri-
chia coli β-glucuronidasa positivos por glucuronidasa positivos por
gramo (otros productos). gramo (otros productos).
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de Ver TABLA 1

los casos, los límites de confianza de este método varían
del –14,7% al +17,3% para 150 colonias contadas y del
–37,8% al +63,4% para 15 colonias contadas.
PNT - AL - 015.1. Recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). (ISO 6888-1)
• Hasta 300 colonias, con 150 co- • A partir de los resultados de la • Si las dos placas retenidas, al ni- • Si en ninguna de las dos placas,
lonias características y no carac- confirmación, calcular el número vel de la muestra a analizar (pro- al nivel de la muestra a analizar
terísticas, al nivel de dos dilu- a de CPS identificados por placa ductos líquidos) o de la dilución (productos líquidos) o de la dilu-
ciones sucesivas. retenida mediante la expresión: madre (otros productos), contie- ción madre (otros productos)
nen menos de 15 colonias iden- hay colonias de CPS, dar el re-
• Una placa ha de tener un míni- b c c b nc nc tificadas, expresar el resultado sultado como:
a= ⋅ c = nc ⋅ c
mo de 15 colonias característi- Ac A como:
cas. Siembra de 0,1 mL:
|
Σa
• Calcular el número N de CPS Ne = : número estimado |
identificados presentes en la V ⋅2 Menos de 10 CPS por mililitro
muestra problema mediante la de CPS por mililitro (productos (productos líquidos).
expresión: líquidos) | Menos de 10/d CPS por gra-
mo (otros productos).
Σa
N= |
Σa
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d Ne = : número esti- Siembra de 1 mL:
V ⋅2⋅d
| Menos de 1 CPS por mililitro
mado de CPS por gramo (otros
productos). (productos líquidos).
| Menos de 1/d CPS por gramo
(otros productos).
Precisión
31
32
PNT - AL - 015.2. Recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). (ISO 6888-2)

• Hasta 300 colonias, con 100 co- ΣC • Si las dos placas, al nivel de la • Si en ninguna de las dos placas,
lonias características, al nivel de N= muestra a analizar (productos lí- al nivel de la muestra a analizar
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
dos diluciones sucesivas. quidos) o de la dilución madre (productos líquidos) o de la dilu-
(otros productos) contienen me- ción madre (otros productos),
• Una placa ha de tener un míni- nos de 15 colonias característi- hay colonias de CPS, dar el re-
mo de 15 colonias característi- cas, expresar el resultado como: sultado como:
cas.
|
C |
Ne = : número estimado de Menos de 1 CPS por mililitro
2 (productos líquidos).
CPS por mililitro (productos lí- |
quidos) Menos de 1/d CPS por gramo
(otros productos).
|
C
Ne = : número estimado
2⋅d
de CPS por gramo (otros pro-
ductos).
Precisión
PNT - AL - 016.1. Recuento estafilococos coagulasa positivos (CPS). Técnica con confirmación de colonias (NF V 08-057-1)
• Menos de 150 colonias ca- • A partir de los resultados de • Si la placa, al nivel de la muestra a ana- • Si no hay ninguna colonia de
racterísticas y no caracterís- la confirmación, calcular el lizar (productos líquidos) o de la dilu- CPS en la placa, al nivel de la
ticas, al nivel de dos dilu- número de CPS identifica- ción madre (otros productos), contiene muestra a analizar (productos lí-
ciones sucesivas. dos mediante la expresión: menos de 15 colonias identificadas, dar quidos) o de la dilución madre
el resultadco como: (otros productos), dar el resulta-
• Una placa ha de tener un b c c b nc nc do como:
a= ⋅ c = nc ⋅ c
mínimo de 15 colonias. Ac A Siembra de 0,1 mL:
|
Siembra de 0,1 mL:
• Calcular el número N de Ne = A × 10: número estimado de CPS
CPS identificados presentes por mililitro (productos líquidos).
en la muestra problema me- (productos líquidos).
|
a
diante la expresión: Ne = × 10 : número estimado de
d | Menos de 10/d coliformes por
Σa CPS por gramo (otros productos). gramo (otros productos).
N=
V ⋅ 1,1 ⋅ d
Siembra de 1 mL: Siembra de 1 mL:
|
| Ne = a: número estimado de CPS por Menos de 1 CPS por mililitro
mililitro (productos líquidos). (productos líquidos).
| Ne = a/d: número estimado de CPS por | Menos de 1/d CPS por gramo
mililitro (otros productos). (otros productos).
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los Ver TABLA 1
casos, los límites de confianza de este método varían del
+17,3% al +14,7% para 150 colonias contadas y del +63,4%
al –37,8% para 15 colonias contadas.
33
34
PNT - AL - 016.2. Recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). Técnica sin confirmación de colonias (NF V 08-057-2)
• Un máximo de 100 colonias ca- ΣC • Si la placa, al nivel de la muestra a analizar • Si no hay ninguna colonia de
racterísticas al nivel de dos dilu- N= (productos líquidos) o de la dilución ma- CPS en la placa, al nivel de la
1,1 ⋅ d
ciones sucesivas. dre (otros productos), contiene menos de muestra a analizar (productos lí-
15 colonias características, dar el resultado quidos) o de la dilución madre
• Una placa ha de tener un míni- como: (otros productos), dar el resulta-
mo de 15 colonias característi- do como:
cas. | N = C: número estimado de CPS por mi-
e
lilitro (productos líquidos).
| N = C/d: número estimado de CPS por
e
| Menos de 1/d CPS por gramo
(otros productos).
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% Ver TABLA 1
de los casos, los límites de confianza de este método varían
del +20% al –17% para 100 colonias contadas y del +63,4%
al –37,8% para 15 colonias contadas.
PNT - AL - 017. Recuento de Bacillus cereus (ISO 7932)
• Menos de 150 colonias, al nivel • A partir de los resultados de la • Si las dos placas, al nivel de la • Si en ninguna de las dos placas,
de dos diluciones sucesivas. confirmación bioquímica reali- muestra a analizar (productos lí- al nivel de la muestra a analizar
zada sobre cinco colonias por quidos) o de la dilución madre (productos líquidos) o de la dilu-
• Una placa ha de tener un míni- placa, calcular el número a de (otros productos), contienen me- ción madre (otros productos),
mo de 15 colonias característi- Bacillus cereus identificados a nos de 15 colonias característi- hay colonias de Bacillus cereus,
cas. partir de la expresión: cas, hacer la media m de las co- dar el resultado como:
lonias contadas en las dos placas
Confirmación b | Menos de 1 microorganismo
a= ⋅C y expresar el resultado como:
A por mililitro (productos líqui-
• Si al menos un 80% de las colo- | Ne = m: número estimado de dos).
nas seleccionadas son confirma- • Calcular el número N de Baci- microorganismos por mililitro |
das, tomar como número de Ba- llus cereus identificados presen- (productos líquidos). Menos de 1/d microorganis-
cillus cereus el número dado en tes en la muestra problema con mos por gramo (otros produc-
el recuento. la expresión: | Ne = m/d: número estimado de tos).
microorganismos por gramo
• En todos los otros casos, calcu- Σa (otros productos).
N=
lar el número de Bacillus cereus (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
a partir del porcentaje obtenido
en el recuento. Redondear el re-
sultado a un número entero de
colonias.
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, Ver TABLA 1
los límites de confianza de este método varían del ±12% al ±37%.
35
36
PNT - AL - 018. Recuento de Bacillus cereus (NF V 08-058)

• Un máximo de 150 colo- • A partir de los resultados de • Si la placa, al nivel de la muestra a ana- • Si no hay ninguna colonia de
nias, al nivel de dos dilu- la confirmación bioquímica lizar (productos líquidos) o de la dilu- Bacillus cereus en la placa, al
ciones sucesivas. realizada sobre tres colonias ción madre (otros productos), contiene nivel de la dilución madre (pro-
por placa, calcular el núme- menos de 15 colonias identificadas, dar ductos líquidos) o de la muestra
• Una placa ha de contener ro a de Bacillus cereus iden- el resultadco como: a analizar (otros productos), ex-
un mínimo de 15 colonias tificados a partir de la expresar:
características. presión: Siembra de 0,1 mL:
|
Siembra de 0,1 mL:
b Ne = a × 10: número estimado de Ba-
a= ⋅C cillus cereus por mililitro (productos |
A Menos de 10 Bacillus cereus
líquidos). por mililitro (productos líqui-
• Calcular el número N de 10 dos).
|
Bacillus cereus identifica- Ne = a × : número estimado de
d | Menos de 10/d Bacillus cereus
dos presentes en la muestra Bacillus cereus por gramo (otros pro-
problema con la expresión: por gramo (otros productos).
ductos).
Σa Siembra de 1 mL:
N= Siembra de 1 mL:
V ⋅ 1,1 ⋅ d
| Menos de 1 Bacillus cereus
| Ne = a: número estimado de Bacillus
por mililitro (productos líqui-
cereus por mililitro (productos líqui-
dos).
dos).
| |
Ne = a/d: número estimado de Bacillus Menos de 1/d Bacillus cereus
cereus por gramo (otros productos). por gramo (otros productos).
Precisión

PNT - AL - 019. Recuento de Clostridium perfringens (EN 13401)
• Menos de 150 colonias caracte- • A partir de los resultados de la • Si las dos placas retenidas, al ni- • Si en ninguna de las dos placas,
rísticas y no características, al confirmación, calcular el núme- vel de la muestra a analizar (pro- al nivel de la muestra a analizar
nivel de dos diluciones sucesi- ro a de Clostridium perfringens ductos líquidos) o de la dilución (productos líquidos) o de la dilu-
vas. mediante la expresión: madre (otros productos), contie- ción madre (otros productos),
nen menos de 15 colonias de hay colonias de Clostridium per-
• Una placa ha de contener un mí- b Clostridium perfringens, expre- fringens, dar el resultado como:
a= ×C
nimo de 15 colonias. A sar el resultado como:
| Menos de 1 Clostridium per-
| fringens por mililitro (produc-
• Calcular el número N de Clos- Ne = m: número estimado de
tridium perfringens por gramo o Clostridium perfringens por tos líquidos).
por mililitro mediante la expre- mililitro (productos líquidos). |
sión: Menos de 1/d Clostridium
| Ne = m/d: número estimado de perfringens por gramo (otros
Σa Clostridium perfringens por productos).
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d gramo (otros productos).
Precisión

37
38
PNT - AL - 020. Recuento de Clostridium perfringens (NF V 08-056)

• Menos de 150 colonias caracte- • A partir de los resultados de la • Si la placa, al nivel de la muestra • Si no hay ninguna colonia de
rísticas, al nivel de dos dilucio- confirmación, calcular el núme- a analizar (productos líquidos) o Clostridium perfringens en la
nes sucesivas. ro a de Clostridium perfringens de la dilución madre (otros pro- placa, al nivel de la muestra a
mediante la expresión: ductos), contiene menos de 15 analizar (productos líquidos) o
• Una placa ha de tener un míni- colonias, expresar el resultado de la dilución madre (otros pro-
mo de 15 colonias. b como: ductos), dar el resultado como:
a = ×C
A
| | Menos de 1 Clostridium per-
Ne = a: número estimado de
• Calcular el número de Clostri- Clostridium perfringens por fringens por mililitro (produc-
dium perfringens identificados mililitro (productos líquidos). tos líquidos).
presentes en la muestra proble- |
ma mediante la expresión: | Ne = a/d: número estimado de Menos de 1/d Clostridium
Clostridium perfringens por perfringens por gramo (otros
Σa gramo (otros productos). productos).
N=
1,1 ⋅ d
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, Ver TABLA 1
los límites de confianza de este método varían del +17,3% al –14,7%
para 150 colonias contadas y del +63,4% al –37,8% para 15 colonias
contadas.
PNT - AL - 021. Investigación de Salmonella (ISO 6579)
• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de identificación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Salmonella, en x gramos de pro-
ducto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se considera
PRESENCIA.
PNT - AL - 022. Investigación de Salmonella (NF V 08-052)
• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de identificación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Salmonella, en x gramos de pro-
ducto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se considera
PRESENCIA.
PNT - AL - 023.1. Investigación de Listeria monocytogenes (ISO 11290-1)
• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Listeria monocytogenes en x gramos
de producto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se con-
sidera PRESENCIA.
39
40
PNT - AL - 023.2. Recuento de Listeria monocytogenes (ISO 11290-2)

• Menos de 150 colonias caracte- • A partir de los resultados de la • Si las dos placas, al nivel de la • Si en ninguna de las dos placas,
rísticas, al nivel de dos dilucio- confirmación, calcular el núme- muestra a analizar (productos lí- al nivel de la muestra a analizar
nes sucesivas. ro a de colonias de Listeria mo- quidos) o de la dilución madre (productos líquidos) o de la dilu-
nocytogenes confirmadas en (otros productos), contienen me- ción madre (otros productos),
• Una placa ha de tener un míni- cada placa mediante la expre- nos de 15 colonias de Listeria hay colonias de Listeria mo-
mo de 15 colonias característi- sión: monocytogenes, hacer la media nocytogenes, dar el resultado
cas. m de las colonias contadas en las como:
b dos placas y expresar el resulta-
a = ×C
A do como: 1
| Menos de Listeria mo-
d ⋅V
• Calcular el número N de Listeria m nocytogenes por mililitro o por
| Ne = : número estimado
monocytogenes identificados d ⋅V gramo.
presentes en la muestra proble- de Listeria monocytogenes por
ma mediante la expresión: mililitro o por gramo.
Σa
N=
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
Precisión

PNT - AL - 024. Investigación de Listeria monocytogenes (NF V 08-055)
• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Listeria monocytogenes en x gramos
de producto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se con-
sidera PRESENCIA.
PNT - AL - 025. Investigación de Campylobacter termotolerantes (ISO 10272)
• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Campylobacter termotolerantes en
x gramos de producto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada
ya se considera PRESENCIA.
41
ANEXO 1: TABLAS DE LÍMITES DE CONFIANZA
TABLA 1: Límites de confianza para las estimaciones de pequeños

números de colonias
En esta tabla se dan los límites de confianza al nivel del 95% para la estimación de pequeños
números, cuando el número de colonias retenidas sobre las placas es menor que 15 micro-
organismos*.
Número de Límites de confianza al nivel 95%

microorganismos* Inferior Superior
1 <1 2
2 <1 4
3 <1 5
4 1 6
5 2 9
6 2 10
7 2 12
8 3 13
9 4 14
10 4 16
11 5 18
12 6 19
13 7 20
14 7 21
15 8 23
* Reemplazar por el nombre del microorganismo ensayado.
TABLA 2: Tabla de NMP para 3 × 1 g. (mL), 3 × 0,1 g. (mL) y 3 × 0,01 g. (mL)
Número de Categoría cuando el

Coef. número de ensayos es: Límites de confianza
resultados
positivos NMP
1 2 3 5 10 >95% >95% >99% >99%
0 0 0 <0,30 0,00 0,94 0,00 1,40
0 0 0 0,30 3 2 2 2 1 0,01 0,95 0,00 1,40
0 1 0 0,30 2 1 1 1 1 0,01 1,00 0,00 1,60
0 1 1 0,61 0 3 3 3 3 0,12 1,70 0,05 2,50
0 2 0 0,62 3 2 2 2 1 0,12 1,70 0,05 2,50
0 3 0 0,94 0 0 0 0 3 0,35 3,50 0,18 4,60
1 0 0 0,36 1 1 1 1 1 0,02 1,70 0,01 2,50
1 0 1 0,72 2 2 1 1 1 0,12 1,70 0,05 2,50
1 0 2 1,1 0 0 0 3 3 0,4 3,5 0,2 4,6
1 1 0 0,74 1 1 1 1 1 0,13 2,00 0,06 2,70
1 1 1 1,1 3 3 2 2 2 0,4 3,5 0,2 4,6
1 2 0 1,1 2 2 1 1 1 0,4 3,5 0,2 4,6
1 2 1 1,5 3 3 3 3 2 0,5 3,8 0,2 5,2
1 3 0 1,6 3 3 3 3 2 0,5 3,8 0,2 5,2
2 0 0 0,92 1 1 1 1 1 0,15 3,50 0,07 4,60
2 0 1 1,4 2 1 1 1 1 0,4 3,5 0,2 4,6
2 0 2 2,0 0 3 3 3 3 0,5 3,8 0,2 5,2
2 1 0 1,5 1 1 1 1 1 0,4 3,8 0,2 5,2
2 1 1 2,0 2 2 1 1 1 0,5 3,8 0,2 5,2
2 1 2 2,7 0 3 3 3 3 0,9 9,4 0,5 14,2
2 2 0 2,1 1 1 1 1 1 0,5 4,0 0,2 5,6
2 2 2 3,5 0 0 0 0 3 0,9 9,4 0,5 14,2
2 2 1 2,8 3 2 2 2 1 0,9 9,4 0,5 14,2
2 3 0 2,9 3 2 2 2 1 0,9 9,4 0,5 14,2
2 3 1 3,6 0 3 3 3 3 0,9 9,4 0,5 14,2
3 0 0 2,3 1 1 1 1 1 0,5 9,4 0,3 14,2
3 0 1 3,8 1 1 1 1 0 0,9 10,4 0,5 15,7
3 0 2 6,4 3 3 2 2 2 1,6 18,1 1,0 25,0
3 1 0 4,3 1 1 1 1 1 0,9 18,1 0,5 25,0
3 1 1 7,5 1 1 1 1 1 1,7 19,9 1,1 27,0
3 1 2 12 3 2 2 2 1 3 36 2 44
3 1 3 16 0 0 0 3 3 3 38 2 52
3 2 0 9,3 1 1 1 1 1 1,8 36,0 1,2 43,0
3 2 1 15 1 1 1 1 1 3 38 2 52
3 2 2 21 2 1 1 1 1 3 40 2 56
3 2 3 29 3 3 3 2 2 9 99 5 152
3 3 0 24 1 1 1 1 1 4 99 3 152
3 3 1 46 1 1 1 1 1 9 198 5 283
3 3 2 110 1 1 1 1 1 20 400 10 570
3 3 3 >110
Los límites de confianza de esta tabla tienen como finalidad dar algunas nociones sobre la influencia de
las variaciones estadísticas en los resultados. Existirán siempre otras fuentes de variaciones que, en al-
gunos casos, pueden ser importantes.
TABLA 3: Tabla de NMP para 3 × 0,1 g. (mL), 3 × 0,01 g. (mL) y 3 × 0,001 g. (mL)
Número de resultados positivos Coeficiente Límites de confianza del 95%

NMP/g*
0,1 g 0,01 g 0,001 g Inferior Superior
0 0 0 <3+ — —
0 1 0 3+ <1 17
1 0 0 4+ <1 21
1 0 1 7+ 2 27
1 1 0 7+ 2 28
1 2 0 11+ 4 35
2 0 0 9+ 2 38
2 0 1 14+ 5 48
2 1 0 15+ 5 50
2 1 1 20+ 7 60
2 2 0 21+ 8 62
3 0 0 23+ 9 130
3 0 1 39+ 10 180
3 1 0 43+ 10 210
3 1 1 75+ 20 280
3 2 0 93+ 30 380
3 2 1 150+ 50 500
3 2 2 210+ 80 640
3 3 0 240+ 90 1.400
3 3 1 460+ 100 2.400
3 3 2 1.100+ 300 4.800
3 3 3 >1.100+ —, —0,
Los resultados normales, obtenidos en el 95% de los ensayos, no están seguidos por un más. Re-
sultados «+» improbables, obtenidos en un 4% de los casos, si que están seguidos por un «+».
Las combinaciones de tubos positivos que no se muestran en la tabla, aparecen en menos del
1% de los ensayos; si se observan a menudo, significa que la técnica empleada es defectuosa
o que las suposiciones en las que se basa el NMP estimado no se han cumplido. Para estas
combinaciones que no se reflejan en la tabla se puede extrapolar un NMP a partir de la si-
guiente combinación más elevada que aparece en la tabla (por ejemplo, un caso 2 0 2 tendría
un resultado aproximado de 20, que es el NMP correspondiente al caso 2 1 1.
* Todos los resultados de NMP/g se pueden expresar como NMP/100 g multiplicando por 100.
TABLA 4: Explicación de las categorías de los resultados
Antes de empezar los ensayos se ha de decidir qué categoría será aceptada, es decir:
sólo la 1, la 1 y la 2 o bien la 1, la 2 y la 3.
Verificar, según el número de muestras examinadas por lote en la tabla de NMP adecuada, si
las series de número de tubos positivos correspondientes a las diluciones seleccionadas son
aceptables desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de
muestras examinadas y de la decisión de aceptar o de rechazar las categorías 2 y 3.
Así, por ejemplo, cuando se aceptan los resultados de la categoría 1 de la tabla, la secuencia
2 2 1 sólo se puede admitir cuando se analizan 10 muestras por lote. Al contrario, cuando los
resultados menos probables de la categoría 2 se aceptan igualmente, la secuencia 2 2 1 será
admitida en el caso de haber examinado 2, 3 ó 5 muestras. En ningún caso esta secuencia
2 2 1 es válida para una muestra única.
Para cada secuencia considerada aceptable según lo descrito, determinar el coeficiente NMP
mediante la correspondiente tabla 3.
Si la decisión es muy importante para ser tomada basándose en los resultados, se habrán de
aceptar únicamente los resultados de la categoría 1 o, como mucho, de las categorías 1 y 2.
Los resultados de la categoría 0 se habrán de considerar con mucha prudencia.
Categoría Definición
1 Cuando el número de microorganismos en el producto es igual al NMP hallado,

el resultado es uno de los que tiene la posibilidad más elevada de ser obtenido.
Existe como mucho el 5% de posibilidades de obtener un resultado que es
menos probable que el menos probable de esta categoría.

el resultado es uno de los que tiene menos posibilidades de ser obtenido, inclu-
so el menos probable de la categoría 1, pero existe como mucho el 1% de po-
sibilidades de obtener un resultado que es menos probable que el menos pro-
bable de esta categoría.

so menos posibilidades que el que menos posibilidades tiene de la categoría 2,
pero existe como mucho el 0,1% de posibilidades de obtener un resultado que
es menos probable que el menos probable en esta categoría.

so menos probable que el que menos posibilidades tiene de la categoría 3. No
existe ninguna posibilidad del 0,1% de obtener un resultado en esta categoría sin
que sea falso.
Los límites de confianza que se dan en las TABLAS 2 y 3 están destinados únicamente a su-
gerir algunas nociones de la influencia de las variaciones estadísticas sobre los resultados.
Siempre habrá otras fuentes de variaciones que puedan ser por sí mismas, alguna vez, más im-
portantes.
46
TIPO DE MEDIO
MEDIO SÓLIDO MEDIO LÍQUIDO
TIPO DE RECUENTO
RECUENTO DE COLONIAS CARACTERÍSTICAS

RECUENTO DE COLONIAS EN TOTAL
DESPUÉS DE IDENTIFICACIÓN
MÉTODO DE REFERENCIA MÉTODO DE RUTINA MÉTODO DE REFERENCIA MÉTODO DE RUTINA

ANEXO 2: EJEMPLOS
CASO GENERAL CASO GENERAL CASO GENERAL CASO GENERAL

ESTIMACIÓN ESTIMACIÓN ESTIMACIÓN ESTIMACIÓN
DE PEQUEÑOS NÚMEROS DE PEQUEÑOS NÚMEROS DE PEQUEÑOS NÚMEROS DE PEQUEÑOS NÚMEROS
CASOS PARTICULARES CASOS PARTICULARES CASOS PARTICULARES CASOS PARTICULARES

RECUENTO EN MEDIO SÓLIDO SIN IDENTIFICACIÓN
MÉTODO DE REFERENCIA
EJEMPLO 1: Caso general

Un recuento de microorganismos da como resultado:
Primera dilución retenida: Segunda dilución retenida:

10–2 10–3
168 14
Número de colonias
215 25
Entonces:
ΣC 168 + 215 + 14 + 25 422

N= = = = 19.182
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d 1 ⋅ [2 = (0,1 + 2)] ⋅ 10 –2 0, 022
Después de redondear el número obtenido, consideramos que el resultado es 19.000

(o 1,9 × 104) microorganismos por mililitro o por gramo de producto.
EJEMPLO 2: Estimación de pequeños números
Si las dos placas, al nivel de la muestra de ensayo (para productos líquidos), de la dilución
madre (para el resto de productos) o de la primera dilución sembrada o retenida, contienen me-
nos de 15 colonias (en total, características o identificadas).
Un recuento da como resultado:
Primera dilución retenida:

10–2
12
Número de colonias
13
Entonces:
ΣC 12 + 13 25
Ne = = = = 1.250
V ⋅ n ⋅ d 1 ⋅ 2 ⋅ 10 –2 0, 02
Después de redondear el resultado obtenido, consideramos que el número estimado de mi-

croorganismos por mililitro o por gramo de producto es 1.300 (o 1,3 × 103).
EJEMPLO 3: Casos particulares
En el caso de que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número in-
dicado en la norma específica) en las dos placas de una primera dilución d1, con un número de
colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias
en cada una de las placas de la dilución d1 está comprendido entre 324 y 300 (parte superior del
intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300).

10–2 10–3
310 8
Número de colonias
322 12
Utilizar el modo de cálculo del caso general a partir de las placas de las dos diluciones rete-
nidas.
En el caso de que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número
indicado en la norma específica), en las dos placas de una primera dilución d1, con un número
de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente, si el número total de co-
lonias en cada una de las placas de la dilución d1 es superior a 324 (límite superior del interva-
lo de confianza de una media ponderada igual a 300), retener sólo el resultado de los recuentos
de la dilución d2 y realizar una estimación de pequeños números, excepto en el caso de recuento
de colonias en total con un número máximo fijado en 300 colonias, si el último resultado es me-
nos que 10 (límite inferior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 15) (ver
Ejemplo 5).

10–2 10–3
380 12
Número de colonias
350 14
Proceder a una estimación de pequeños números a partir de las colonias contadas en las dos
placas de la dilución 10–3.

10–2 10–3
380 8
Número de colonias
350 6
El resultado de este recuento no es aceptable.
En el caso de que únicamente las dos placas de la última dilución sembrada tengan menos de
300 colonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica).
Última dilución retenida:

10–2
120
Número de colonias
130
Entonces:
ΣC 120 + 130 250

N′ = = = = 1.250.000
V ⋅ n ⋅ d 1 ⋅ 2 ⋅ 10 –4 0, 0002
Después de redondear el número obtenido, consideramos que el resultado es 1.300.000

MÉTODO DE RUTINA

10–2 10–3
Número de colonias 83 13
Entonces:
ΣC 83 + 13 96
N= = = = 8, 727
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d 1 ⋅ [1 + (0,1 ⋅ 1)] ⋅ 10 –2
0, 011


10–2
Número de colonias 12
Entonces:
C 12
Ne = = = 1.200
d 10 –2
Después de redondear el resultado obtenido, consideramos que el número estimado Ne de mi-

Caso en el que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número in-
dicado en la norma específica) en la placa de una primera dilución d1, con un número de colonias
menor que 15 en la placa de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias en la placa de
la dilución d1 está comprendido entre 324 y 300 (parte superior del intervalo de confianza de una
media ponderada igual a 300).

10–2 10–3
nidas.
Caso en el que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número in-
dicado en la norma específica) en la placa de una primera dilución d1, con un número de colonias
menor que 15 en la placa de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias en la placa de
la dilución d1 es superior a 324 (límite superior del intervalo de confianza de una media ponde-
rada igual a 300), retener sólo el resultado del recuento de la dilución d2 y realizar una estimación
de pequeños números, excepto en el caso de recuento de colonias en total con un número máxi-
mo fijado en 300 colonias, si el último resultado es menos que 10 (límite inferior del intervalo de
confianza de una media ponderada igual a 15) (ver Ejemplo 11).

10–2 10–3

10–2 10–3
El resultado de este recuento no es aceptable.
Caso en el que únicamente la placa de la última dilución sembrada tenga menos de 300 co-
lonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica).
Última dilución retenida:

10–4
Entonces:
C 125
N′ = = = 1.250.000
V ⋅ d 1 ⋅ 10 –4

RECUENTO EN MEDIO SÓLIDO DESPUÉS DE IDENTIFICACIÓN
MÉTODO DE REFERENCIA

10–3 10–4
66 4
Número de colonias
80 7
Se han resembrado:
• De las 66 colonias de la dilución 10–3: 8 colonias, de las cuales 6 han respondido a los cri-
terios; así: a = 50.
terios; así: a = 53.
• Las 4 colonias de la dilución 10–4, de las cuales las 4 han respondido a los criterios; así:
a = 4.
terios de identificación; así: a = 6.
Entonces:
Σa 50 + 53 + 6 + 4 113
N= = = = 51.364
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d 1 ⋅ [2 + (0,1 ⋅ 2)] ⋅ 10 –3 2, 2 ⋅ 10 –3

Si las dos placas, al nivel de la muestra de ensayo (para productos líquidos), de la dilución
madre (para el resto de productos) o de la primera dilución sembrada o retenida, contiene menos
de 15 colonias (en total, características o identificadas).

10–2
12
Número de colonias
13
Entonces:
ΣC 12 + 13 25
Ne = = = = 1.250
V ⋅ n ⋅ d 1 ⋅ 2 ⋅ 10 –2
0, 02
Después de redondear el resultado obtenido, consideramos que el número estimado de mi-

Si para las dos placas de una primera dilución d1, el número total de colonias características
y no características es mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica)
con colonias identificadas y si, en la dilución d2 siguiente hay menos de 150 colonias (o cualquier
otro número indicado en la norma específica), no se puede contar ninguna colonia identificada.

10–2 10–3
180 22
Número de colonias
210 25
con colonias identificadas sin colonias identificadas
presentes presentes
El resultado es menos de 1.000 y más de 100 microorganismos por mililitro o por gramo de
producto.

Si, en las dos placas de una primera dilución d1, el número total de colonias características y
no características es mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) sin
colonias identificadas y si, en las dos placas de la dilución d2 siguiente hay menos de 150 colo-
nias (o cualquier otro número indicado en la norma específica), no se puede contar ninguna co-
lonia identificada.

10–2 10–3
180 22
Número de colonias
210 25
sin colonias identificadas sin colonias identificadas
presentes presentes
El resultado es menos de 1.000 microorganismos por mililitro o por gramo de producto.

En el caso de que el número total de colonias características y no características sea mayor
que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en las dos placas de una pri-
mera dilución d1, con un número de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 si-
guiente, si el número total de colonias en cada una de las dos placas de la dilución d1 está com-
prendido entre 167 y 150 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual
a 150).

10–2 10–3
155 8
Número de colonias
165 12
colonias identificadas
Utilizar el modo de cálculo del caso general a partir de las placas de las dos diluciones retenidas.
Caso en el que el número total de colonias características y no características sea mayor que
150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en las dos placas de una prime-
ra dilución d1, con un número de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 si-
guiente, si el número total de colonias en cada una de las dos placas de la dilución d1 es superior
a 167 (límite superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 150), retener
sólo el resultado de los recuentos de la dilución d2 y realizar una estimación de pequeños nú-
meros.

10–2 10–3
170 12
Número de colonias
190 8
Caso que únicamente las dos placas de la última dilución sembrada tengan menos de 150 co-
lonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica) características y no caracterís-
ticas.
Última dilución sembrada:

10–4

identificadas 130
Entonces:
ΣC 120 + 130 250

N′ = = = = 1.250.000
V ⋅ n ⋅ d 1 ⋅ 2 ⋅ 10 –4 0, 0002

MÉTODO DE RUTINA

10–3 10–4
Han sido resembradas:
terios de identificación; así: a = 53.
• Las 4 colonias de la dilución 10–4, de las cuales 3 han respondido a los criterios de identi-
ficación; así: a = 3.
Entonces:
Σa 53 + 3 56
N= = = = 50.909
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d 1 ⋅ [2 + (0,1 ⋅ 1)] ⋅ 10 –3
0, 011

Primera dilución sembrada:

10–2
Número de colonias
12
identificadas
Entonces:
a 12
Ne = = = 1.200
d 0, 01
Después de redondear el resultado obtenido, consideramos que el número estimado Ne de mi-

Si, para una primera dilución d1, el número total de colonias características y no caracterís-
ticas es mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) con colonias
identificadas y si, en la dilución d2 siguiente hay menos de 150 colonias (o cualquier otro número
indicado en la norma específica), no se puede contar ninguna colonia identificada.

10–2 10–3
con colonias identificadas sin colonias identificadas
presentes presentes
El resultado es menos de 1.000 y más de 100 microorganismos por mililitro o por gramo de
producto.
Si, en una primera dilución d1, el número total de colonias características y no características
es mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) sin colonias iden-
tificadas y si, en la dilución d2 siguiente hay menos de 150 colonias (o cualquier otro número in-
dicado en la norma específica), no se puede contar ninguna colonia identificada.

10–2 10–3
sin colonias identificadas sin colonias identificadas
presentes presentes
El resultado es menos de 1.000 microorganismos por mililitro o por gramo de producto.
En caso de que el número total de colonias características y no características sea mayor que
150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en la placa de una primera dilu-
ción d1, con un número de colonias identificadas menor que 15 en la placa de la dilución d2 si-
guiente, si el número total de colonias en la placa de la dilución d1 está comprendido entre 167 y
150 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 150).

10–2 10–3
nidas.
Caso en el que el número total de colonias características y no características sea mayor que
150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en la placa de una primera dilu-
ción d1, con un número de colonias identificadas menor que 15 en la placa de la dilución d2 si-
guiente, si el número total de colonias en la placa de la dilución d1 es superior a 167 (límite su-
perior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 150), retener sólo el resultado
del recuento de la dilución d2 y realizar una estimación de pequeños números.

10–2 10–3
Proceder a una estimación de pequeños números a partir de las colonias contadas en la pla-
ca de la dilución 10–3.
Caso en el que únicamente la placa de la última dilución sembrada tenga menos de 150 co-
lonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica) características y no caracterís-
ticas.
Primera dilución sembrada:

10–4
Número de colonias
125
identificadas
Entonces:
Σa 125 125
N′ = = = = 1.250.000
V ⋅ n ⋅ d 1 ⋅ 10 –4 0, 0001

RECUENTO EN MEDIO LÍQUIDO
EJEMPLO 27: Al menos una dilución tiene los tres tubos positivos
Escoger la dilución más elevada (aquélla con menor concentración de muestra) que presen-
te tres tubos positivos, así como las dos diluciones siguientes que tengan tubos positivos (es de-
cir, aquéllas donde las concentraciones de muestra sean iguales a 1/10 y 1/100 de la primera di-
lución escogida). Ver CASO 1 en la TABLA 5.
Si se ha preparado un número insuficiente de diluciones por encima de la dilución más ele-
vada con tres tubos positivos, escoger en su lugar las tres diluciones más elevadas de la serie (es
decir, aquéllas que tengan una concentración más baja de muestra). Ver CASO 2 en la TABLA 5.
TABLA 5: Ejemplos de elecciones de resultados positivos para el cálculo

de los valores del NMP
Número de tubos positivos obtenidos a partir de

tres tubos incubados para las cantidades siguientes NMP**
de muestra sembrada por tubo*
CASO
Productos Productos Otros

10 mL 1 mL 10–1 mL 10–2 mL 10–3 mL
líquidos líquidos productos
Otros
1g 10–1 g 10–2 g 10–3 g 10–4 g mL–1 g–1
productos
1 3 3 2 1 0 1,5 · 01 1,5 · 102
2 3 3 3 0 — 2,4 · 101 2,4 · 102
3 2 2 1 1 0 7,4 7,4 · 101
4 3 3 0 0 0 2,4 2,4 · 101
5 2 2 0 1 0 2,1 · 101 2,1
* Números en negrita: combinación elegida.
** Cálculo a partir del coeficiente de NMP para los tres tipos (TABLA 1).
EJEMPLO 28: Ninguna dilución tiene los tres tubos positivos
Cuando el caso 1 no se puede aplicar, escoger las tres diluciones más elevadas de la serie
(aquéllas con menor concentración de muestra) que contengan al menos una respuesta positiva.
Ver CASO 3 en la TABLA 5.
En todos los casos donde más de una de las tres diluciones escogidas según los dos casos an-
teriores no tenga tubos positivos, retener la dilución menos elevada que no presente ningún tubo
positivo (es decir, la que tiene una mayor concentración de muestra) y las dos diluciones más ba-
jas precedentes (es decir, aquéllas con las concentraciones de muestra iguales a 10 y 100 veces la
de la primera dilución escogida, ver CASOS 4 y 5 en TABLA 5), excepto cuando sólo se en-
cuentran tubos positivos al nivel de la primera dilución preparada a partir de la muestra.
En este caso, es necesario retener las tres primeras diluciones para el cálculo el NMP, igual
que si esta serie tuviera dos diluciones sin ningún tubo positivo.
EJEMPLO 30: Determinación del coeficiente NMP
Verificar, según el número de muestras examinadas por lote en las TABLAS 2 y 3, si las se-
ries de número de tubos positivos correspondientes a las diluciones seleccionadas son aceptables
desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de muestras exami-
nadas y de la decisión de aceptar o de rechazar las categorías 2 y 3 (ver TABLA 4).
Así, por ejemplo, cuando se aceptan los resultados de la categoría 1 de la TABLA 4, la se-
cuencia 2 2 1 sólo se puede admitir cuando se analizan 10 muestras por lote. Al contrario,
cuando los resultados menos probables de la categoría 2 se aceptan igualmente, la secuencia 2 2
1 será admitida en el caso de haber examinado 2, 3 ó 5 muestras. En ningún caso esta secuencia
2 2 1 es válida para una muestra única.
Para cada secuencia considerada aceptable según lo descrito, determinar el coeficiente NMP
mediante la TABLA 2.
EJEMPLO 31: Cálculo del número más probable (NMP)
A partir del coeficiente de NMP obtenido de las TABLAS 2 y 3, determinar el número de

microorganismos más probable por mililitro o por gramo de muestra con ayuda de la expresión:
F
Cs = M ⋅ ⋅ Vs
V0
siendo:
• Cs : número más probable de microorganismos en un volumen de referencia Vs.

• M: coeficiente NMP obtenido en las TABLAS 2 y 3 por la dilución base V0.
• F: inversa de la tasa de dilución correspondiente a la dilución eventual considerada como
dilución de base utilizada (generalmente F = 10, 100, etc.).
• Vs: volumen de dilución elegido para expresar la concentración en microorganismos.
• V0: dilución de base.
Expresar el resultado de microorganismos por mililitro (producto líquido) o por gramo (res-
to de productos) como un número comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10x, siendo x el
orden de magnitud apropiado de 10.
Si el NMP es inferior a 0,3 microorganismos por mililitro (para productos líquidos) o por gra-
mo (para el resto de productos) y si se ha utilizado un modo operatorio adecuado para un número
bajo de microorganismos, el resultado deberá expresarse de la manera siguiente: menos de 1 mi-
croorganismo en 1 mL (para productos líquidos) o en 1 gramo de producto (para el resto de pro-
ductos).
CAPÍTULO TERCERO
Procedimientos de métodos de análisis

de alimentos
MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO
DE MICROORGANISMOS A 30°C
PNT - AL - 003 Basado en la norma ISO 4833 (Julio 1991)
1. Definición:
Microorganismos: Bacterias, levaduras y mohos que se desarrollan en aerobiosis, cuando el
ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agar para recuento (PCA).
Agar blanco (AB).
3. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en placas Petri
estériles.
• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.
• Verter en cada placa unos 15 mL de PCA a 45°C ± 1°C.
• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique 1.
• Incubar a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 3 h.
4. Recuento:
• Contar las colonias de aquellas placas que contengan un máximo de 300.
5. Expresión de resultados 2:
• Retener las placas que contengan un máximo de 300 colonias al nivel de dos diluciones
sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.
• Calcular el número N de microorganismos por mililitro o por gramo con la expresión:
ΣC
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
1
Si sospechamos que la muestra contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie del me-
dio, después de la solidificación verter 4 mL de AB a 45°C ±1°C y dejar reposar.
2
Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.
62
PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS 63

DÍA 1 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Muestra líquida 100 10–1 10–2 10–3 10–4

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
100 10–1 10–2 10–3 10–4

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
Verter en cada placa 15 mL de PCA a 45°C ± 1°C

Mezclar e incubar a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 3 h*
DÍA 4
Retener las placas con menos de 300 colonias
100 10–1 10–2 10–3 10–4

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
Lectura y expresión de resultados
* Si es necesario, añadir 4 mL de AB a 45°C ± 1°C.

PNT - AL - 004 Basado en la norma NF V 08-051 (Diciembre 1992)
1. Definición:
Microorganismos: Bacterias, levaduras y mohos que se desarrollan en aerobiosis, cuando el
Agar para recuento (PCA).
Agar blanco (AB).
3. Siembra:
• Sembrar 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en una placa Petri estéril.
• Verter en cada placa unos 15 mL de PCA enfriado a 45°C - 47°C.
• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique 3.
4. Recuento:
• Contar las colonias de aquellas placas que contengan un máximo de 300.
• Retener las placas que contengan un máximo de 300 colonias al nivel de dos diluciones
sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.
ΣC
N=
1,1 ⋅ d
3
Si sospechamos que la muestra contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie del me-
dio, después de la solidificación verter 4 mL de AB a 45°C - 47°C y dejar reposar.
4

DÍA 1
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Muestra líquida 100 10–1 10–2 10–3 10–4

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
100 10–1 10–2 10–3 10–4

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
Verter en cada placa 15 mL de PCA a 45°C-47°C

Mezclar e incubar a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 3 h*
DÍA 4
100 10–1 10–2 10–3 10–4

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
* Si es necesario, añadir 4 mL de AB a 45°C – 47°C.

DE LEVADURAS Y MOHOS
PNT - AL - 005 Basado en la norma ISO 7954 (Agosto 1988)
1. Definición:
Levaduras y mohos: Microorganismos que a 25°C forman colonias en un medio selectivo,
cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medio de cultivo:
Agar glucosa y cloranfenicol (CGA).
3. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en placas Petri
estériles.
• Verter en cada placa unos 15 mL de CGA a 45°C ± 1°C.
• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 5 días.
4. Recuento:
• Contar las colonias de cada placa a los 3, 4 y 5 días de incubación.
• Después de 5 días de incubación, retener las placas que contengan un máximo de 150 co-
lonias, si es posible al nivel de dos diluciones sucesivas.
• Calcular el número N de levaduras y mohos por mililitro o por gramo con la expresión:
ΣC
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
5

PNT - AL - 005 Basado en la norma ISO 7954 (Agosto 1988)
Muestra líquida 100 10–1 10–2 10–3 10–4

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
100 10–1 10–2 10–3 10–4

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
Verter en cada placa 15 mL de CGA a 45°C ± 1°C

Mezclar e incubar a 25°C ± 1°C durante 5 días
DÍA 6
100 10–1 10–2 10–3 10–4

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)

PNT - AL - 006 Basado en la norma XF V 08-059 (Noviembre 1995)
1. Definición:
Levaduras: Microorganismos aerobios mesófilos que, en cinco días, a 25°C, se desarrollan
en la superficie del medio sólido, formando colonias mates o brillantes, presentando fre-
cuentemente contorno regular y una superficie más o menos convexa cuando el ensayo se re-
aliza según el siguiente método.
Mohos: Microorganismos aerobios mesófilos, filamentosos, que en la superficie de un me-
dio sólido a 25°C, desarrollan colonias cuando el ensayo se realiza según el siguiente mé-
todo; este desarrollo puede proceder de la germinación de esporas o del crecimiento de frag-
mentos micelares.
Agar glucosa y cloranfenicol (CGA) con gentamicina.
3. Siembra:
• Sembrar 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre en placas Petri con el me-
dio CGA.
• Extender con asa de Drigalski.
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 5 días.
4. Recuento:
• Contar las colonias de cada placa a los 3, 4 y 5 días de incubación.
• Después de 5 días de incubación, retener las placas que contengan un máximo de 150 co-
lonias, al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa conten-
ga un mínimo de 15 colonias.
• Calcular el número N de levaduras y mohos por mililitro o por gramo con la expresión:
ΣC
N=
0,11 ⋅ d
6

PNT - AL - 006 Basado en la norma XF V 08-059 (Noviembre 1995)
Muestra líquida 100 10–1 10–2 10–3 10–4

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

CGA con gentamicina
100 10–1 10–2 10–3 10–4

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
Incubar a 25°C±1°C durante 5 días

DÍA 6
100 10–1 10–2 10–3 10–4

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIÓN

DE Enterobacteriaceae. TÉCNICA DEL NMP
PNT - AL - 007.1 Basado en la norma ISO 7402 (Diciembre 1993)
1. Definición:
Enterobacteriaceae: Bacterias que fermentan la glucosa y dan una reacción oxidasa nega-
tiva cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa (caldo EE) a doble y simple concen-
tración.
Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).
Agar glucosado (AG).
Agar nutritivo (AN).
3. Reactivo:
Reactivo para la prueba de la oxidasa.
4. Siembra:
Enriquecimiento:
• Sembrar 10 mL de muestra líquida o 10 mL de dilución madre en tres tubos con 10 mL de
caldo EE a doble concentración.
• Sembrar 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en tres tubos de caldo EE
a simple concentración.
• Repetir esta operación con las siguientes diluciones decimales.
Aislamiento:
• Aislar en placas de VRBG a partir de cada tubo.
Selección:
• Resembrar 5 colonias típicas bien aisladas (de color rojo violeta y a veces rodeadas de una
halo de precipitación del mismo color, o mucosas) 7 en placas de AN.
5. Confirmación bioquímica:
Prueba de la oxidasa: Se realiza con cada una de las colonias aisladas. La prueba es positiva
si al cabo de 10 sg aparece una coloración violeta.
Prueba de fermentación de la glucosa:
• Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas oxidasa k.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo
aparece una coloración amarilla.
• Contar el número de tubos positivos para cada dilución. Si al menos una de las colonias es
oxidasa k y glucosa j, consideraremos positivo el tubo a partir de cual se ha realizado el
subcultivo.
• Determinar el número más probable (NMP) con la ayuda de una tabla.
7
Algunas Enterobacteriaceae pueden provocar una decoloración de sus colonias y del medio, de manera
que si no se encuentran colonias típicas, sembrar las colonias blanquecinas.
8

DE Enterobacteriaceae. TÉCNICA DEL NMP
DÍA 1 Enriquecimiento 1 mL 1 mL 1 mL
Muestra líquida 100 10–1 10–2 10–3

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
caldo EE caldo EE
doble simple concentración
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h
DÍA 2
Aislamiento
Sembrar una placa de VRBG a partir de cada tubo

DÍA 3
Selección
Tomar 5 colonias típicas de cada placa y sembrar en AN

DÍA 4
Confirmación
oxidaxa k AG

DÍA 5
Resultado
Determinar el NMP

DE Enterobacteriaceae. TÉCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS
1. Definición:
tiva, cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
3. Reactivo:
4. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en sendas
placas Petri.
• Verter unos 15 mL de VRBG a 45°C ± 1°C.
• Una vez solidificado, cubrir con 10-15 mL del mismo medio.
• Dejar solidificar e incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
• Repetir esta operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.
5. Recuento:
• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar aquellas que tengan un diá-
metro mayor o igual que 0,5 mm, de color rojo-violeta y a veces rodeadas de un halo de
precipitación o mucosas. Consideraremos estas colonias como presuntas Enterobacteria-
ceae 9.
• Tomar cinco colonias características de cada placa retenida y sembrarlas por separado en
placas de AN.
6. Confirmación bioquímica 10:

• Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas oxida-
sa k.
9
Si la mitad de la superficie de la placa está invadida, la determinación se considerará sin valor. Si la
zona invadida fuera inferior a la mitad de la superficie de la placa, se efectúa el recuento de colonias sobre la
zona clara y se extrapola este valor a la superficie total.
10
Estas pruebas pueden realizarse simultáneamente con la siembra en AN, según criterio del laboratorio.

Si al menos el 80% de las colonias características seleccionadas son confirmadas como En-
terobacteriaceae (es decir, oxidasa k y glucosa j), el número de bacterias presentes será el
encontrado en el recuento (ver punto 5).
Si no es así, calcularemos el número a partir del porcentaje de colonias oxidasa k y gluco-
sa j sobre el número total de colonias seleccionadas.
La expresión que nos permite calcular el número N de Enterobacteriaceae por mililitro o por
gramo de producto es:
Σa
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
11

1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Verter 15 mL de VRBG a 45°C ± 1°C
Cubrir con 10-15 mL de VRBG
DÍA 2
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Contar las colonias de presuntas Enterobacteriaceae
Tomar 5 colonias características de cada placa y sembrar en AN

DÍA 3
oxidaxa k AG

DÍA 4
MÉTODO HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIÓN

DE Enterobacteriaceae CON PRE-ENRIQUECIMIENTO
PNT - AL - 008 Basado en la norma ISO 8523 (Febrero 1992)
1. Definición:
Agua de peptona tamponada (APT).
Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa (caldo EE).
3. Reactivo:
4. Siembra:
Pre-enriquecimiento:
• Realizar una dilución 1/10 en ATP.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 16 h - 20 h.
Enriquecimiento:
• Sembrar 1 mL del cultivo anterior en 10 mL de caldo EE.
Aislamiento:
• Aislar en placas con VRBG.
• Resembrar 5 colonias típicas bien aisladas (de color rojo-violeta y a veces rodeadas de un
halo de precipitación del mismo color) 12 en placas de AN.
• Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas oxida-
sa k.

Consideramos la muestra positiva en la investigación de Enterobacteriaceas si una de las co-
lonias características es oxidasa k y glucosa j.
12
Algunas Enterobacteriaceae pueden provocar una decoloración de sus colonias y del medio, de ma-
nera que si no se encuentran colonias típicas, tomar de las colonias blanquecinas y sembrar.
13

DE Enterobacteriaceae CON PRE-ENRIQUECIMIENTO
PNT - AL - 008 Basado en la norma ISO 8523 (Febrero 1992)
DÍA 1 Pre-enriquecimiento 1 g de muestra
10 mL ATP
Incubar a 37°C ± 1°C durante 16 h-24 h
DÍA 2
Enriquecimiento
1 mL
10 mL caldo EE
DÍA 3
VRBG

DÍA 4
AN

DÍA 5
Confirmación
oxidaxa k AG

DÍA 6
Resultado
Glucosa j (color amarillo)

PNT - AL - 009 Basado en la norma NF V 08-054 (Octubre 1993)
1. Definición:
3. Reactivo:
4. Siembra:
• Sembrar en una placa Petri 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre y verter
unos 15 mL de VRBG a 45°C - 47°C.
• Una vez solidificado, cubrir con unos 5 mL del mismo medio.
• Dejar solidificar en incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
• Repetir la operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.
5. Recuento:
• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar aquellas con un diámetro ma-
yor o igual que 0,5 mm, de color rojo violeta y a veces rodeadas de una halo de precipi-
tación del mismo color. Consideraremos estas colonias como presuntas Enterobacteria-
ceae.
• Tomar cinco colonias características de cada placa retenida y sembrarlas por separado en
placas de AN.
Prueba de la oxidasa:
• Se realiza con cada una de les colonias aisladas. La prueba es positiva si al cabo de 10 sg
aparece una coloración violeta.
• Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las cepas oxidasa k.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo apa-
rece una coloración amarilla.

• Retener las placas que contengan un máximo de 150 colonias características y no carac-
terísticas al nivel de dos diluciones sucesivas (una placa debe contener un mínimo de 15
colonias características).
• Calcular el número N de Enterobacteriaceae identificadas (oxidasa k y glucosa j) me-
diante la expresión:
b
a= ×C
5
• Calcular el número N de Enterobacteriaceae identificados presentes en la muestra pro-

blema, como media ponderada a partir de dos diluciones sucesivas, con la expresión:
Σa
N=
1,1 ⋅ d
14

PNT - AL - 009 Basado en la norma NF V 08-054 (Octubre 1993)
1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Verter 15 mL de VRBG a 45°C-47°C

Cubrir con unos 5 mL de VRBG
DÍA 2
Recuento
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Contar las colonias de presuntas Enterobacteriaceae
Aislamiento
Tomar 5 colonias características de cada placa y sembrar en AN

DÍA 3
Confirmación
AG
oxidaxa k
DÍA 4
Resultado
Glucosa j (color amarillo)
MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES.

TÉCNICA DEL NMP
1. Definición:
Coliformes: Bacterias que a 30°C son capaces de fermentar la lactosa con producción de gas
cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
Caldo de triptona lauril sulfato (TSL).
Caldo lactosado biliado verde brillante (BGBL).
3. Siembra:
• Sembrar 10 mL de muestra líquida o 10 mL de dilución madre en tres tubos de TSL a do-
ble concentración.
• Sembrar 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en tres tubos de TSL a sim-
ple concentración.
• Repetir esta operación con las siguientes diluciones decimales 15.
• Incubar a 30°C ± 1°C durante:
— 24 h ± 2 h en tubos de concentración doble.
— 24 h ± 2 h ó 48 h ± 2 h en tubos de concentración simple.
• Realizar lecturas al cabo de 24 h y 48 h.
4. Confirmación:
• Retener los tubos que presentan formación de gas.
• A partir de cada tubo con gas, sembrar con asa de Kolle en BGBL.
• Incubar a 30°C ± 1°C, realizando lecturas al cabo de 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario).
• Consideramos la reacción positiva si se produce desprendimiento de gas.

• Contar el número total de tubos con producción de gas.
• Retener 3 diluciones, según el caso:
a) Cuando al menos una dilución presenta 3 tubos positivos, elegir la más diluida que
presente los 3 tubos positivos y las dos diluciones siguientes con tubos positivos.
b) En caso contrario, elegir las tres diluciones más diluidas que contengan al menos un
tubo positivo.
• Determinar el NMP con la ayuda de una tabla.
15
Realizar un número de diluciones suficiente para que todos los tubos de la última dilución sean ne-
gativos.
16

TÉCNICA DEL NMP
DÍA 1 1 mL 1 mL 1 mL

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
TSL a simple concentración
TSL a doble
concentración
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario)

DÍA 2
Sembrar a partir de los tubos con gas en BGBL

*
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario)

DÍA 3
Contar el número de tubos con produccion de gas

Determinar el NMP
* Introducir el asa dos veces, sin agitar.

TÉCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS
1. Definición:
Coliformes: Bacterias que a 30°C son capaces de fermentar la lactosa cuando el ensayo se re-
aliza según el siguiente método.
Agar lactosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL).
3. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en sendas
placas Petri estériles.
• Verter 15 mL de VRBL a 45°C ± 2°C.
• Mezclar y dejar solidificar.
• Preparar de la misma manera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio.
• Cubrir con 4 mL del mismo medio a 45°C ± 2°C.
• Dejar solidificar e incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
4. Recuento:
• Contar las colonias características de coliformes (de diámetro mayor o igual de 0,5 mm, de
color rojo-violeta y a veces rodeadas de un halo de precipitación) en las placas que conten-
gan menos de 150 colonias características y/o no características.

• Retener las placas que contengan un máximo de 150 colonias características al nivel de
dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga más de 15 colo-
nias características.
• Calcular el número N de coliformes por mililitro o por gramo de producto con la expre-
sión:
ΣC
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
17

TÉCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Placa
testigo
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Verter 15 mL de VRBL a 45°C ± 2°C
Mezclar y dejar solidificar
Cubrir con 4 mL de VRBL a 45°C ± 2°C

Incubar a 30°C ± 1°C o 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h
DÍA 2
Retener las placas con menos de 150 colonias características
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)

DE COLIFORMES TOTALES.
1. Definición:
Coliformes: Bacterias que a 30°C forman colonias características en el agar lactosado con
bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL) cuando el ensayo se realiza según el siguiente
método.
Agar lactosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL).
3. Siembra:
• Sembrar en una placa Petri 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre.
• Verter 15 mL de VRBL a 45°C - 47°C.
• Cubrir con unos 5 mL del mismo medio a 45°C - 47°C.
• Dejar solidificar en incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
4. Recuento:
• Contar las colonias características de coliformes (de diámetro mayor o igual de 0,5 mm, de
color rojo-violeta y a veces rodeadas de un halo de precipitación) en las placas que con-
tengan menos de 150 colonias características y/o no características.

• Retener las placas que contengan un máximo de 150 colonias características y/o no ca-
racterísticas al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa con-
tenga más de 15 colonias características.
• Calcular el número N de coliformes por mililitro o gramo de producto mediante la expre-
sión:
ΣC
N=
1,1 ⋅ d
18

DE COLIFORMES TOTALES.

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Placa 100 10–1 10–2 10–3

testigo (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Verter 15 mL de VRBL a 45°C ± 47°C

Cubrir con 5 mL de VRBL a 45°C ± 47°C

DÍA 2
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)

DE Escherichia coli PRESUNTIVOS. TÉCNICA DEL NMP
PNT - AL - 013 Basado en la norma ISO 7251 (Septiembre 1994)
1. Definición:
Escherichia coli: Bacterias que a 45°C fermentan la lactosa con producción de gas y que a
esta misma temperatura producen indol a partir del triptófano cuando el ensayo se realiza se-
gún el siguiente método.
Caldo de triptona lauril sulfato (TSL).
Caldo Escherichia coli (Caldo EC).
Agua de triptona (AT).
3. Reactivo:
Reactivo de Kovacs.
4. Siembra:
• Sembrar 10 mL de muestra líquida o 10 mL de dilución madre en tres tubos de TSL a do-
ble concentración.
• Sembrar 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en tres tubos de TSL a sim-
ple concentración.
• Repetir esta operación con las siguientes diluciones decimales.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario).
5. Confirmación:
• A partir de cada tubo con formación de gas, sembrar con asa de Kolle en Caldo EC y en
AT, atemperados a 45°C ± 2°C.
• Incubar en un baño a 45°C ± 0,5°C durante 48 h ± 2 h.
6. Recuento:
Prueba del Indol:
• Añadir 0,5 mL de reactivo de Kovacs a los tubos de AT.
• Mezclar y examinar al cabo de 1 min.
• Una coloración roja en la fase alcohólica indica reacción j.
Formación de gas:
• La formación de gas en la campana de Durham indica reacción j.

• Retener 3 diluciones según el caso:
a) Cuando al menos una dilución presenta 3 tubos positivos, elegir la más diluida que
presente los 3 tubos positivos y las dos diluciones siguientes con tubos positivos.
b) En caso contrario, elegir las tres diluciones más diluidas que contengan al menos un
tubo positivo.
• Determinar el NMP con la ayuda de una tabla.
19

DE Escherichia coli PRESUNTIVOS. TÉCNICA DEL NMP
PNT - AL - 013 Basado en la norma ISO 7251 (Septiembre 1994)
1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
TSL a doble TSL a simple concentración
concentración
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+24 h si es necesario)
DÍA 2
Sembrar a partir de los tubos con gas en EC y AT a 45°C ± 2 ± C
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Incubar en baño a 45°C ± 0,5 ± C durante 48 h ± 2 h
DÍA 4
Añadir 0,5 mL de reactivo de Kovacs a los tubos de AT
Mezclar y examinar al cabo de 1 min

Contar el número de tubos con coloración roja y formación de gas
EC AT
Determinar el NMP

DE Escherichia coli β-GLUCURONIDASA POSITIVOS
1. Definición:
Escherichia coli β-glucuronidasa positivos: Bacterias que a 44°C forman colonias caracte-
rísticas en el agar con tergitol (PTX), adicionado de un substrato cromogénico (BCIG) que
revele la presencia de β-glucuronidasa cuando el ensayo se realiza según el siguiente mé-
todo.
Agar con tergitol - BCIG (PTX)
3. Siembra:
• Sembrar en una placa Petri 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre.
• Verter 15 mL de PTX a 45°C - 47°C.
NOTA: En caso de sospechar la presencia de Escherichia coli estresados, es conveniente rea-

lizar una primera incubación a 37°C ± 1°C durante 4 h y luego la incubación a 44°C ± 1°C
durante 18 h - 20 h.
4. Recuento:
• Contar las colonias características de Escherichia coli β-glucuronidasa positivos (de color
azul) en las placas que contengan menos de 150 colonias características y no característi-
cas.

• Retener las placas que contengan menos de 150 colonias al nivel de dos diluciones suce-
sivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias caracte-
rísticas.
• Calcular el número N de Escherichia coli β-glucuronidasa positivos mediante la expresión:
Σa
N=
1,1 ⋅ d
20

DE Escherichia coli β-GLUCURONIDASA POSITIVOS

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Verter en 15 mL de PTX a 45°C-47°C

DÍA 2
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE ESTAFILOCOCOS

COAGULASA POSITIVOS (CPS). TÉCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS
PNT - AL - 015.1 Basado en la norma ISO 6888-1 (Febrero 1999)
1. Definición:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias características y/o
no características en la superficie de un medio de cultivo selectivo, y que dan una reacción
positiva en la prueba de la coagulasa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
Medio de Baird-Parker (BP).
Caldo de cerebro-corazón (BHI).
3. Reactivo:
Plasma de conejo.
4. Siembra:
• Sembrar por duplicado 0,1 mL de la muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre en dos
placas Petri con medio BP.
• Repetir esta operación con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales 21.
• Extender con asa de Drigalsky.
• Tapar y dejar absorber durante 15 min. a T ambiente.
• Incubar durante 24 h - 48 h a 37°C ± 1°C.
5. Recuento:
• Después de 24 h ± 2 h de incubación, marcar en la placa las colonias características (de 1
a 1,5 mm de diámetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas de una zona clara).
• Incubar durante 24 h ± 2 h más.
• Marcar las colonias características (de 1,5 a 2,5 mm de diámetro; parte de la zona clara
puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias), y también las colonias no ca-
racterísticas (éstas pueden no tener zona clara).
• Retener las placas que tengan un máximo de 300 colonias, con 150 colonias característi-
cas y no características al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una
placa contenga un mínimo de 15 colonias.
21
Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm (por
duplicado).
6. Confirmación:
• Elegir al azar de cada placa seleccionada:
— 5 colonias características si sólo hay colonias características.
— 5 colonias no características si sólo hay colonias no características.
— 5 colonias características y 5 colonias no características si están presentes ambos tipos.
— Si hay menos de 5 colonias, de cualquier tipo, elegirlas todas.
• Sembrar en un tubo con BHI.
• Añadir 0,1 mL de cada cultivo a tubos con 0,3 mL de plasma de conejo.
• Incubar a 37°C ± 1°C.
• Examinar la coagulación del plasma al cabo de 1/2 h, 1 h, 4 h, 6 h y, si es negativo, hasta
las 24 h ± 2 h de incubación. Consideramos la reacción positiva cuando el coágulo ocupa
más de 1/2 del volumen ocupado inicialmente por el líquido.
NOTA: Realizar un control negativo añadiendo 0,1 mL de BHI estéril al plasma de conejo
e incubar sin sembrar y un control positivo con CPS.

• Calcular el número a de estafilococos coagulasa positivos identificados por placa retenida
mediante la expresión:
b c c b nc nc
a= ⋅ c + nc ⋅ c
Ac A
• Calcular el número N de estafilococos coagulasa positivos identificados presentes en la

muestra problema mediante la expresión:
Σa
N=
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
22

PNT - AL - 015.1 Basado en la norma ISO 6888-1 (Febrero 1999)
1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
10 mL 1 mL 1 mL 1 mL
BP
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Tapar y dejar absorber durante 15 min

Incubar durante 24 h ± 2 h a 37°C ± 1°C
DÍA 2
Marcar las colonias características
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
DÍA 3
Marcar las colonias características y no características

Retener las placas que tengan menos de 150 colonias
Sembrar en BHI (según caso) CONTROL j

DÍA 4
CONTROL j CONTROL k
0,1 mL de cada cultivo 0,1 mL BHI estéril
0,3 mL
plasma de conejo
Incubar a 37°C ± 1°C
Examinar la coagulación al cabo de 1/2 h, 1 h, 4 h, 6 h (hasta 24 h ± 2 h)
DÍA 5

PNT - AL - 015.2 Basado en la norma ISO 6888-2 (Abril 1999)
1. Definición:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias características en el
medio de agar selectivo de plasma de conejo y fibrinógeno cuando el ensayo se realiza según
Agar con plasma de conejo y fibrinógeno (RPF).
3. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en dos pla-
cas Petri.
• Verter en cada placa unos 3 mm de RPF a 47°C ± 0,5°C 23.
• Tapar y dejar absorber durante 15 min a T ambiente.
• Incubar durante 18 h - 24 h a 37°C ± 1°C (+ 18 h - 24 h si es necesario).
4. Recuento:
• Retener las placas que contengan que contengan un máximo de 300 colonias, con 100 co-
lonias características al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos
una placa contenga un mínimo de 15 colonias características.
• Contar las colonias características de cada placa, que en RPF pequeñas, negras o grises, o
incluso blancas, están rodeadas de un halo de precipitación que indica la presencia de
coagulasa.

Calcular el número N de estafilococos coagulasa positivos presentes por mililitro o por gra-
mo de producto con la expresión:
ΣC
N=
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
23
Añadir el suplemento a la base en el momento de preparar las placas.
24

PNT - AL - 015.2 Basado en la norma ISO 6888-2 (Abril 1999)
Muestra líquida 100 10–1 10–2 10–3 10–4

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)
100 10–1 10–2 10–3 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–4)
Verter unos 3 mm de RPF a 47°C ± 0,5°C
Mezclar y dejar absorber durante 15 min
Incubar durante 18 h-24 h a 37°C ± 1°C (+18 h-24 h si es necesario)
DÍA 2
100 10–1 10–2 10–3 10–4

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4) (10–5)

COAGULASA POSITIVOS (CPS). TÉCNICA CON CONFIRMACIÓN DE COLONIAS
PNT - AL - 016.1 Basado en la norma NF V 08-057-1 (Noviembre 1994)
1. Definición:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias características y no
características en la superficie de un medio de cultivo selectivo, y que dan una reacción po-
sitiva a la coagulasa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
Medio de Baird-Parker (BP).
Caldo cerebro-corazón (BHI).
3. Reactivo:
Plasma de conejo.
4. Siembra:
• Sembrar 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre en una placa Petri con BP.
• Repetir la operación con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales 25.
• Incubar durante 24 h - 48 h a 37°C ± 1°C.
5. Recuento:
• Después de 24 h ± 2 h de incubación, marcar en la placa las colonias características (de 1
a 1,5 mm de diámetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas de una zona clara).
• Incubar durante 24 h ± 2 h más.
• Marcar las colonias características (de 1,5 a 2,5 mm de diámetro; parte de la zona clara
puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias), y también las colonias no ca-
racterísticas (éstas pueden no tener zona clara).
• Retener las placas que tengan menos de 150 colonias características y no características al
nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una de las placas contenga un
mínimo de 15 colonias.
25
duplicado). En este caso, realizaremos las operaciones de recuento y confirmación sobre el conjunto de estas
placas.
6. Confirmación 26:
• Elegir al azar 3 colonias características de cada placa seleccionada (opcionalmente también
3 colonias no características) y sembrar en un tubo con BHI.
• Añadir 0,1 mL de cada cultivo a tubos con 0,3 mL de plasma de conejo.
• Incubar a 37°C ± 1°C.
• Examinar la coagulación del plasma al cabo de 1/2 h, 1 h, 4 h, 6 h y, si es negativo, hasta
las 24 h ± 2 h de incubación. Consideramos la reacción positiva cuando el coágulo ocupa
más de 3/4 del volumen ocupado por el líquido.
NOTA: Realizar un control negativo añadiendo 0,1 mL de BHI estéril al plasma de conejo
e incubar sin sembrar y un control positivo sembrando CPS.

• Calcular el número a de estafilococos coagulasa positivos identificados por placa retenida
mediante la expresión:
b c c b nc nc
a= ⋅ c + nc ⋅ c
Ac A
• Calcular el número N de estafilococos coagulasa positivos identificados presentes en la

muestra problema mediante la expresión:
Σa
N=
V ⋅ 1,1 ⋅ d
26
Realizar la prueba de la catalasa (facultativa), reteniendo las colonias catalasa j.
27

COAGULASA POSITIVOS (CPS). TÉCNICA CON CONFIRMACIÓN DE COLONIAS
1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

BP
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)

DÍA 2
Marcar las colonias características
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
DÍA 3
Marcar las colonias características y no características

Retener las placas que tengan menos de 150 colonias
Elegir 3 colonias de cada placa y tipo y sembrar en BHI CONTROL j

DÍA 4
CONTROL j CONTROL k
0,1 mL de cada cultivo 0,1 mL BHI estéril
0,3 mL
plasma de conejo
Incubar a 37°C ± 1°C
Examinar la coagulación al cabo de 1/2 h, 1 h, 4 h, 6 h (hasta 24 h ± 2 h)
DÍA 5

COAGULASA POSITIVOS (CPS). TÉCNICA SIN CONFIRMACIÓN DE COLONIAS
1. Definición:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias características en un
medio sólido selectivo con plasma de conejo y fibrinógeno cuando el ensayo se realiza según
Agar con plasma de conejo y fibrinógeno (RPF).
3. Siembra:
• Verter en cada placa unos 10 mL de RPF a 47°C ± 0,5°C 28.
• Tapar y dejar absorber durante 15 min a T ambiente.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (+ 18 h - 24 h si fuera necesario).
4. Recuento:
• Contar las colonias características de cada placa, que son negras o grises, pequeñas y es-
tán rodeadas de una zona opaca o turbia, indicativa de la presencia de coagulasa.
• Retener las placas que contengan menos de 100 colonias características al nivel de dos di-
luciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 co-
lonias características.

Calcular el número N de estafilococos coagulasa positivos por mililitro o por gramo con la
expresión:
ΣC
N=
1,1 ⋅ d
28
Añadir el suplemento a la base en el momento de preparar las placas.
29

COAGULASA POSITIVOS (CPS). TÉCNICA SIN CONFIRMACIÓN DE COLONIAS

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Verter en cada placa 10 mL de RPF

Mezclar e incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h-24 h
(+18 h-24 h si es necesario)
DÍA 2
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)

DE Bacillus cereus
PNT - AL - 017 Basado en la norma ISO 7932 (Enero 1994)
1. Definición:
Bacillus cereus: Microorganismos lecitinasa j que no fermentan el manitol cuando el
análisis se realiza según el siguiente método.
Agar manitol yema de huevo con polimixina (MYPA).
Medio Voges-Proskauer (MR-VP).
Medio nitrato (MN).
3. Reactivos:
• Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP):
— solución de α-naftol.
— solución de hidróxido potásico.
— cristales de creatina.
• Reactivos para la investigación de nitritos:
— solución de 5-2 ANSA.
— solución de ácido sulfanílico.
— solución de ácido acético.
— zinc en polvo.
4. Siembra:
• Sembrar por duplicado 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre una placa
de MYPA.
• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales 30.
• Tapar y dejar absorber durante unos 15 min. a T ambiente.
• Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (+ 24 h si es necesario).
5. Recuento:
• Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al nivel de 2 dilu-
ciones sucesivas. Es necesario que una placa contenga un mínimo de 15 colonias carac-
terísticas.
• Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosadas, que no fermentan ma-
nitol y casi siempre rodeadas de una zona de precipitado).
NOTA: Si las placas contienen un gran número de microorganismos manitol j, el color ro-
sado característico puede desaparecer.
30
duplicado).
6. Confirmación:
• Elegir al azar 5 colonias de presuntos Bacillus cereus de cada placa seleccionada (si hay
menos de 5 elegirlas todas) y sembrar:
— Por picadura en los tubos de AG, regenerado (10 min en agua hirviendo).
— Por emulsión en tubos de MR-VP.
— Por emulsión en tubos de MN a 30°C (1°C.
• Incubar a 30°C (1°C durante 24 h (+ 24 h para MR-VP).
7. Lectura:
AG:
Interpretación: Positivo cuando aparece coloración amarilla.
MR-VP:
• Transferir de cada tubo 1 mL de cultivo a un tubo vacío.
• Añadir 0,2 mL de solución de hidróxido de potasio, 0,6 mL de solución de (-naftol y al-
gunos cristales de creatina.
• Mezclar enérgicamente y dejar reposar durante 1 h.
Interpretación: Una coloración rosa eosina en la superficie del tubo indica reacción posi-
tiva.
MN:
• Añadir a cada tubo de 0,2 a 0,5 mL de reactivo completo para la investigación de nitritos.
Interpretación: Consideramos nitritos (si aparece una coloración roja. Generalmente la re-
acción es instantánea; si no aparece coloración roja en 15 minutos, añadir zinc en polvo, y si
a los 10 minutos no se colorea, consideramos la prueba positiva.
8. Interpretación de las pruebas bioquímicas: Bacillus cereus es:
Manitol en MYPA k
Lecitina en MYPA j
Glucosa j
Voges-Proskauer j
Nitritos j

• Si al menos un 80% de las colonias seleccionadas son confirmadas, tomar como número
de Bacillus cereus el obtenido en el recuento (ver punto 5). En los demás casos, se calcu-
la el porcentaje de los confirmados entre los seleccionados.
Σa
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
31

DE Bacillus cereus
1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

MYPA
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h-24 h (+ 24 h si es necesario)
DÍA 2
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Contar las colonias de presuntos B. cereus
Elegir al azar 5 colonias presuntas de cada placa y sembrar en:
MR-VP AG (regenerado) MN (a 308C ± 1°C)

Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h (+ 24 h para MN-VP)
DÍA 3
1 mL
+ reactivos
+ reactivos
Nitritos j si aparece
VP j si aparece AG j si aparece coloración roja o si
coloración rosa coloración amarilla después de añadir Zn
no se colorea

DE Bacillus cereus
PNT - AL - 018 Basado en la norma XP V 08-058 (Noviembre 1995)
1. Definición:
Bacillus cereus: Microorganismos lecitinasa j que no fermentan el manitol cuando el en-
sayo se realiza según el siguiente método.
Agar manitol yema de huevo con polimixina (MYPA).
Agar sangre (AS).
Agar movilidad (AM).
3. Siembra:
• Sembrar 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre en una placa de MYPA.
• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales 32.
• Tapar y dejar absorber durante unos 15 min a T ambiente.
4. Recuento:
• Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al nivel de 2 dilu-
ciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias
características.
• Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosadas, que no fermentan ma-
nitol y casi siempre rodeadas de una zona de precipitado).
NOTA: Si las placas contienen un gran número de microorganismos manitol j, el color ro-
sado característico puede desaparecer.
5. Confirmación:
• Elegir al azar 3 colonias de presuntos Bacillus cereus de cada placa seleccionada (si hay
menos de 3, elegirlas todas) y sembrar:
— Estrías paralelas en AS (prueba de la hemólisis)
— Por picadura en AM (prueba de la movilidad) 33.
32
Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm.
33
La movilidad se pone en evidencia por el desarrollo bacteriano a lo largo del tubo y en profundidad a
partir del punto de picadura.
6. Interpretación:
Bacillus cereus presenta las siguientes características:
Medio Resultados confirmando

de cultivo Bacillus cereus
MYPA Formación de colonias típicas
Agar sangre Bacillus cereus es muy hemolítico
Agar movilidad Bacillus cereus es móvil

Si al menos un 80% de las colonias seleccionadas son confirmadas, tomar como número de
Bacillus cereus el obtenido en el recuento (ver punto 5). En los demás casos, se calcula el
porcentaje de los confirmados entre los seleccionados.
• Calcular el número a de Bacillus cereus presentes con la expresiòn:
b
a= ⋅C
A
• De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Bacillus ce-
reus por mililitro o por gramo con la expresión:
Σa
N
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
34

DE Bacillus cereus
PNT - AL - 018 Basado en la norma XP V 08-058 (Noviembre 1995)
1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

MYPA
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h-24 h (+ 24 h si es necesario)
DÍA 2
100 10–1 10–2 10–3

(10–2) (10–3) (10–4)
Contar las colonias de presuntos B. cereus
Elegir al azar 3 colonias presuntas de cada placa y sembrar en:
AS AM
DÍA 3

DE Clostridium perfringens.
PNT - AL - 019 Basado en la norma EN 13401 (Abril 1999)
1. Definición:
Clostridium perfringens: Bacterias que forman colonias características (rodeadas de un
halo negro) en el medio selectivo especificado, y que dan reacciones de confirmación posi-
tivas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
Agar triptona-sulfito con cicloserina (TSC).
Medio tioglicolato (TIO).
Medio lactosa sulfito (LS).
3. Reactivos:
Metabisulfito sódico al 1,2%.
Citrato férrico amoniacal al 1%.
4. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de muestra líquida o 1 mL dilución madre en placas Petri es-
tériles.
• Verter en cada placa unos 15 mL de TSC a 47°C ± 0,5°C 35.
• Añadir 10 mL del mismo medio y dejar solidificar.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios.
5. Recuento:
• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar las colonias negras de pre-
suntos Clostridium perfringens, si es posible al nivel de 2 diluciones sucesivas. Es nece-
sario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.
6. Confirmación:
• Elegir al azar 5 colonias características de cada placa seleccionada (si hay menos de 5 ele-
girlas todas) y sembrar con pipeta Pasteur en medio TIO regenerado (10 minutos en
agua hirviendo).
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h en jarras para anaerobios.
• Transferir 5 gotas al medio LS regenerado (10 minutos en agua hirviendo).
• Añadir 0,5 mL de cada uno de los reactivos (recién preparados).
• Incubar en un baño de agua a 46°C ± 0,5°C durante 18 h - 24 h.
35
Entre la siembra y esta operación no deben transcurrir más de 15 minutos.
7. Lectura:
Considerar positivos los tubos que presentan más de 1/4 de gas en la campana Durham y que
tengan un precipitado negro.
NOTA: En caso de duda, transferir 5 gotas del cultivo en el medio LS a otro tubo con el
mismo medio. Incubar a 46°C ± 0,5°C durante 18 h - 24 h en un baño de agua e interpretar
según lo descrito.
8. Interpretación:
Consideramos que las bacterias que forman colonias negras características en el medio
TSC y que se confirman positivamente en el medio LS son Clostridium perfringens.

• Calcular el número a de colonias de Clostridium perfringens presentes con la expresión:
b
a= ⋅C
A
• De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Clostridium
perfringens por mililitro o por gramo con la expresión:
Σa
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
36

PNT - AL - 019 Basado en la norma EN 13401 (Abril 1999)
1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
En menos de 15 min, verter 15 mL de TSC a 47°C ± 0,5°C

Cubrir con 10 mL de TSC
Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios
DÍA 2
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Contar las colonias negras
Elegir 5 colonias de cada placa y sembrar en medio TIO regenerado
Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h-24 h en jarras para anaerobios

DÍA 3
Transferir con pipeta Pasteur 5 gotas al medio LS regenerado
+ reactivos
Incubar a 46°C ± 0,5°C durante 18 h-24 h en un baño de agua

DÍA 4

PNT - AL - 020 Basado en la norma NF V 08-056 (Abril 1994)
1. Definición:
Clostridium perfringens: Bacterias que forman colonias negras en el medio selectivo espe-
cificado y que dan reacciones de confirmación positivas cuando el ensayo se realiza según el
siguiente método.
Agar triptosa-sulfito con cicloserina (TSC).
Medio tioglicolato (TIO).
Medio lactosa sulfito (LS).
3. Reactivos:
Metabisulfito sódico al 1,2%.
Citrato férrico amoniacal al 1%.
4. Siembra:
• Verter en cada placa unos 15 mL de TSC a 47°C (0,5°C) 37.
• Añadir unos 10 mL del mismo medio y dejar solidificar.
5. Recuento:
• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar las colonias negras de pre-
suntos Clostridium perfringens, si es posible al nivel de 2 diluciones sucesivas. Es nece-
sario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.
6. Confirmación:
• Elegir al azar 3 colonias características de cada placa seleccionada y sembrar con pipeta
Pasteur en medio TIO regenerado (10 minutos en agua hirviendo) 38.
• Transferir 5 gotas al medio LS regenerado (10 minutos en agua hirviendo).
• Añadir 0,5 mL de cada uno de los reactivos (recién preparados).
• Incubar en un baño de agua a 46°C ± 0,5°C durante 24 h ± 2 h.
37
Entre la siembra y esta operación no deben transcurrir más de 15 minutos.
38
Si no es posible seleccionar colonias características bien aisladas, sembrar 3 grupos de colonias en el
medio TIO. Incubar en anaerobiosis a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h y aislar en placas con TSC (ver punto
3). Escoger de cada placa al menos una colonia característica aislada y confirmar.
7. Lectura:
Considerar positivos los tubos que presentan más de 1/3 gas en la campana Durham y que
tengan un precipitado negro.
NOTA: En caso de duda, transferir 5 gotas del cultivo en el medio LS a otro tubo con el
mismo medio. Incubar a 46°C ± 0,5°C durante 18 h - 24 h en un baño de agua e interpretar
según lo descrito.
8. Interpretación:
Consideramos que las bacterias que forman colonias negras características en el medio
TSC y que se confirman positivamente en el medio LS son Clostridium perfringens.

• Calcular el número a de colonias de Clostridium perfringens por mililitro o por gramo con
la expresión:
b
a= ⋅C
A
• De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Clostridium
perfringens por mililitro o por gramo con la expresión:
Σa
N=
1,1 ⋅ d
39

PNT - AL - 020 Basado en la norma NF V 08-056 (Abril 1994)
1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1

Dilución madre (10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
En menos de 15 min, verter 15 mL de TSC a 47°C ± 0,5°C

Cubrir con 10 mL de TSC
DÍA 2
100 10–1 10–2 10–3

(10–1) (10–2) (10–3) (10–4)
Contar las colonias negras
Elegir 3 colonias de cada placa y sembrar en medio TIO regenerado

DÍA 3
Transferir con pipeta Pasteur 5 gotas al medio LS regenerado
+ reactivos
Incubar a 46°C ± 0,5°C durante 24 h ± 2 h en un baño de agua

DÍA 4

DE Salmonella
PNT - AL - 021 Basado en la norma ISO 6579 (Diciembre 1993)
1. Definición:
Salmonella: Microorganismos que forman colonias características en los medios selectivos
especificados, y que tienen las características bioquímicas y serológicas descritas cuando el
Caldo con verde de malaquita y cloruro de magnesio o de Rappaport-Vassiliadis modifi-
cado (RV).
Caldo selenito-cistina (SC).
Agar rojo fenol y verde brillante (BGA).
Medio Hektoen (HK).
Agar Kligler.
Agar nutritivo semisólido (ANS).
3. Reactivos:
Solución salina (SS).
Reactivo para la investigación de la β-galactoxidasa (ONPG).
Solución de fenilalanina al 0,5% (FA).
Solución de cloruro férrico al 10%.
Galerías miniaturizadas de orientación e identificación bioquímica (API).
4. Sueros:
Antisueros polivalentes «O», «Vi» y «H».
5. Siembra:
• Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de APT a 25 mL o 25 g de muestra.
Enriquecimiento:
• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con 10 mL de RV.
• Sembrar 10 mL del cultivo en un frasco con 100 mL de SC.
• Incubar el tubo de RV a 42°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
• Incubar el frasco de SC a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+24 h si es necesario).
Aislamiento 40:
• Aislar en placas de BGA a partir de cada tubo de RV incubado durante 24 h ± 2 h.
• Realizar la misma operación en HK.
• Aislar en placas de BGA a partir de cada frasco de SC 41 incubado durante 24 h ± 2 h.
• Realizar la misma operación en HK.
40
Si tras 20 h - 24 h de incubación el crecimiento es débil o no aparecen colonias típicas de Salmonella,
incubar de nuevo las placas a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.
41
No agitar el frasco de SC.

• Aislar en placas de BGA a partir de cada frasco de SC incubado durante 48 h ± 2 h.
• Aislar en placas de HK a partir de cada frasco de SC incubado durante 48 h ± 2 h.
6. Confirmaciones:
• Retener de cada aislamiento 5 colonias típicas o sospechosas de Salmonella (si en algu-
na placa hay menos de 5, elegirlas todas), que sobre BGA son incoloras o rosas, con un
halo rojo y sobre Hektoen son verde-azulado con un centro negro.
• Sembrar en placas de AN.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h 42.
Pruebas bioquímicas:
* KLIGLER
• Sembrar las colonias seleccionadas en estría y por picadura.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h. Consideraremos los siguientes resultados:
Base Amarillo Glucosa j

Rojo o sin cambio de color Glucosa k
Negro Formación de H2S
Burbujas o fisuras Formación de gas a partir de la glucosa
Pendiente Amarillo Lactosa j
Rojo o sin cambio de color Lactosa k
Interpretación: Los cultivos típicos de Salmonella responden a una pendiente roja

con o sin formación de gas y base amarilla, con formación de H2S en un 90% de los
casos 43.
* INVESTIGACIÓN DE LA β-GALACTOSIDASA
• Emulsionar el cultivo en 0,25 mL de SS.
• Añadir 0,25 mL de ONPG.
• Mezclar e incubar en a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h, haciendo lecturas al cabo de
1
/2 h, 1 h, 2 h y 24 h.
Interpretación: Cuando la reacción es positiva aparece una coloración amarilla.
NOTA 1: En caso de obtener un Kligler lactosa j o una β-galactosidasa j que al mis-
mo tiempo presente formación de sufhídrico, sembrar en medio lisina-hierro para des-
cartar así las salmonelas del grupo IIIa y IIIb.
* INVESTIGACIÓN DE LA FENILALANINA DESAMINASA
• Emulsionar el cultivo en 0,5 mL de APT.
• Añadir 0,5 mL de FA.
• Mezclar e incubar en a 37°C ± 1°C durante 4 h.
• Añadir una gota de cloruro férrico al 10%.
42
Si fuera necesario, volver a aislar en AN e incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h - 24 h.
43
Existen algunas cepas de Salmonella lactosa j. En este caso, una confirmación preliminar de Sal-
monella no debe basarse únicamente en los resultados obtenidos en el Kligler.
Interpretación: Cuando la reacción es positiva aparece una coloración verde espinaca,

mientras que cuando ésta es negativa, el color que aparece es amarillo.
* GALERÍA DE IDENTIFICACIÓN 44
• Realizar una emulsión en SS.
• Sembrar según las indicaciones del fabricante.
Interpretación: Comparar los resultados obtenidos con el patrón de colores y con-
sultar el índice analítico y/o el «software» APILAB PLUS.
Pruebas serológicas:
* ELIMINACIÓN DE LAS CEPAS AUTO-AGLUTINABLES
• Depositar una gota de SS sobre un portaobjetos.
• Hacer una emulsión del cultivo sospechoso.
• Remover durante 30 s - 60 s.
Interpretación: La cepa es auto-aglutinable si se forman agrupamientos irregulares, de
manera que no puede realizar la identificación serológica.
* ESTUDIO DE LOS ANTÍGENOS «O» y «Vi»
• Hacer una emulsión del cultivo puro en una gota de cada uno de los sueros polivalen-
tes sobre un portaobjetos 45.
• En caso de no obtener un resultado positivo, hacer una emulsión del cultivo puro en
una gota de antisuero «Vi» sobre un portaobjetos 45.
• Realizar las pruebas con los sueros monovalentes «O» correspondientes al suero po-
livalente que ha dado positivo (según tabla del proveedor).
Interpretación: La reacción se considera positiva si hay aglutinación.
* ESTUDIO DE LOS ANTÍGENOS «H»
• Sembrar una colonia pura no auto-aglutinable en ANS.
• Hacer una emulsión del cultivo puro en una gota de antisuero «H», sobre un portaob-
jetos 45.
7. Interpretación de las pruebas bioquímicas:

Las colonias presuntivas de Salmonella presentan las siguientes características:

Kligler típico.

FA k.

β-galatosidasa k.

API según perfil típico.
NOTA 2: Salmonella Typhi no produce gas de glucosa. Las subespecies IIIa y IIIb pueden
ser lactosa j o k, pero son siempre β-galatosidasa j. Salmonella Paratyphi A da reac-
ción negativa a la descarboxilación de la L-lisina. Así que para el estudio de estas cepas
puede ser útil realizar pruebas bioquímicas complementarias.
44
La norma permite realizar todas las pruebas bioquímicas con una galería miniaturizada (API).
45
Utilizar los sueros polivalentes y monovalentes uno después del otro.
8. Interpretación de las pruebas serológicas:

Reacciones Auto-
Reacciones serológicas Interpretación
bioquímicas aglutinación
Típicas No Antígeno «O», «Vi» o «H» positivo Salmonella
Típicas No Negativo Posible Salmonella
Típicas Sí No realizadas Posible Salmonella
No típicas No Antígeno «O», «Vi» o «H» positivo Posible Salmonella
No típicas No Negativo No Salmonella
9. Confirmación definitiva:
Las cepas consideradas como Salmonella o como posible Salmonella deben ser enviadas a
un centro especializado para la identificación de este microorganismo y la determinación
definitiva del serotipo.
10. Expresión de resultados:

Indicar la presencia/ausencia de Salmonella en 25 mL o 25 g de producto.

DE Salmonella
Pre-riquecimiento 25 mL o 25 g de muestra
DÍA 1 225 mL de APT
DÍA 2
Enriquecimiento
0,1 mL 10 mL
10 mL de RV 100 mL de SC
Incubar a 42°C ± 1°C Incubar a 37°C ± 1°C
durante 24 h ± 2 h durante 24 h ± 2 h
(+24 h si es necesario)
DÍA 3
Aislamiento
BGA HK BGA HK
Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h-24 h (+24 h si es necesario)

DÍA 4
BGA HK

DÍA 5
Elegir 5 colonias de cada placa

Sembrar en AN

DÍA 6
Confirmaciones

DE Salmonella
Pruebas bioquímicas
DÍA 6 AGAR KLIGLER

DÍA 7
INVESTIGACIÓN DE LA β-GALACTOSIDASA* INVESTIGACIÓN DE LA FENILALANINA

0,25 mL de ONPG 0,5 mL de FA
0,25 mL de SS 0,5 mL de SS
Incubar a 37°C ± 1°C, Incubar a 37°C ± 1°C

con lecturas al cabo de durante 4 h
1 2
/ h, 1 h, 2 h y 24 h
Añadir 1 gota de
cloruro férrico
DÍA 8
Si las pruebas de la β-galactosidasa y fenilalanina son k, realizar un API
Pruebas serológicas
ELIMINACIÓN DE LAS ESTUDIO DE LOS ANTÍGENOS
CEPAS AUTOAGLUTINABLES
ANS
SS «O» «V1» Incubar a 37°C ± 1°C

durante 18 h-24 h
«H»
* Ver NOTA 1, pág. 113

DE Salmonella
PNT - AL - 022 Basado en la norma NF V 08-052 (Septiembre 1993)
1. Definición:
Salmonella: Microorganismos que forman colonias características en los medios selectivos
especificados y que tienen las características bioquímicas y serológicas descritas cuando el
Caldo con verde de malaquita y cloruro de magnesio o de Rappaport-Vassiliadis modifi-
cado (RV).
Caldo selenito-cistina (SC).
Medio Hektoen (HK).
Agar Kligler.
3. Reactivos:
Solución salina (SS).
Reactivo para la investigación de la β-galactoxidasa (ONPG).
Solución de fenilalanina al 0,5% (FA).
Cloruro férrico al 10%.
Galerías miniaturizadas de orientación e identificación bioquímica (API).
4. Suero:
Antisuero «O».
5. Siembra:
• Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de APT a 25 mL o 25 g de muestra (x mL
o x g de muestra + 9x mL de APT).
Enriquecimiento:
• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con 10 mL de RV.
• Sembrar 2 mL del cultivo en un tubo con 20 mL de SC.
• Incubar el tubo de RV a 42°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.
• Incubar el frasco de SC a 37°C ± 1°C 18 h - 24 h.
Aislamiento 46:
• Aislar en placas de HK a partir de cada tubo de RV.
• Aislar en placas de HK a partir de cada tubo de SC 47.
46
Si tras 20 h - 24 h de incubación el crecimiento es débil o no aparecen colonias típicas de Salmonella,
incubar de nuevo las placas a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.
47
No agitar el frasco de SC.
6. Confirmaciones:
• Retener de cada aislamiento 2 o más colonias típicas o sospechosas de Salmonella 48, que
en medio HK son de color verde-azulado, con o sin centro negro.
* KLIGLER
• Sembrar las colonias seleccionadas en estría y por picadura.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h. Consideraremos los siguientes resultados:

Pendiente Amarillo Lactosa j
Rojo o sin cambio de color Lactosa k
Interpretación: Los cultivos típicos de Salmonella responden a una pendiente roja con
o sin formación de gas y base amarilla, con formación de H2S en un 90% de los casos 49.
* INVESTIGACIÓN DE LA β-GALACTOSIDASA
• Emulsionar el cultivo en 0,25 mL de SS.
• Añadir 0,25 mL de ONPG.
• Mezclar e incubar en a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h, haciendo lecturas al cabo de
1
/2 h, 1 h, 2 h y 24 h.
Interpretación: Cuando la reacción es positiva aparece una coloración amarilla.
NOTA 1: En caso de obtener un Kligler lactosa j o una β-galactosidasa j que al mis-
mo tiempo presente formación de sufhídrico, sembrar en medio lisina-hierro para des-
cartar así las salmonelas del grupo IIIa y IIIb.
* INVESTIGACIÓN DE LA FENILALANINA DESAMINASA
• Emulsionar el cultivo en 0,5 mL de APT.
• Añadir 0,5 mL de FA.
• Mezclar e incubar en a 37°C ± 1°C durante 4 h.
• Añadir una gota de cloruro férrico al 10%.
Interpretación: Cuando la reacción es positiva aparece una coloración verde espinaca,
mientras que cuando ésta es negativa, el color que aparece es amarillo.
* GALERÍA DE IDENTIFICACIÓN 50
• Realizar una emulsión en SS.
• Sembrar según las indicaciones del fabricante.
Interpretación: Comparar los resultados obtenidos con el patrón de colores y consultar
el índice analítico y/o el «software» APILAB PLUS.
48
Si fuera necesario, volver a aislar en AN e incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h - 24 h.
49
Existen algunas cepas de Salmonella lactosa j. En este caso, una confirmación preliminar de Sal-
monella no debe basarse únicamente en los resultados obtenidos en el agar Kligler.
50
La norma permite realizar todas las pruebas bioquímicas con una galería miniaturizada (API).
Pruebas serológicas:
* ELIMINACIÓN DE LAS CEPAS AUTO-AGLUTINABLES
• Depositar una gota de SS sobre un portaobjetos.
• Hacer una emulsión del cultivo sospechoso.
Interpretación: La cepa es auto-aglutinable si se forman agrupamientos irregulares, de
manera que no puede realizar la identificación serológica.
* ESTUDIO DEL ANTÍGENO «O»
• Hacer una emulsión del cultivo puro en una gota de antisuero «O», sobre un portaob-
jetos 51.
7. Interpretación de las pruebas bioquímicas:


Kligler típico.

FA k.

β-galatosidasa k.

API según perfil típico.
NOTA 2: Salmonella Typhi no produce gas a partir de glucosa. Las subespecies IIIa y IIIb
pueden ser lactosa j o k, pero son siempre β-galatosidasa j. Salmonella Paratyphi A da
reacción negativa a la descarboxilación de la L-lisina. Así que para el estudio de estas ce-
pas puede ser útil realizar pruebas bioquímicas complementarias.
8. Interpretación de las pruebas serológicas:

Reacciones Auto-
Reacciones serológicas Interpretación
bioquímicas aglutinación
Típicas No Antígeno «O» positivo Salmonella
Típicas No Negativo Posible Salmonella
Típicas Sí No realizadas Posible Salmonella
No típicas No Negativo No Salmonella
9. Confirmación definitiva:
Las cepas consideradas como Salmonella o como posible Salmonella deben ser enviadas a
un centro especializado para la identificación de este microorganismo y la determinación
definitiva del serotipo.
10. Expresión de resultados:

Indicar la presencia/ausencia de Salmonella en 25 mL o 25 g de producto (x mL ó x g de
producto).
51
Utilizar los sueros poli y monovalentes uno después del otro.

DE Salmonella
DÍA 1 Pre-enriquecimiento 25 mL o 25 g de muestra

225 mL de APT

DÍA 2
Enriquecimiento
0,1 mL 2 mL
10 mL de RV 20 mL de SC
durante 18 h-24 h durante 18 h-24 h
DÍA 3
Aislamiento
HK HK

DÍA 4
Retener de cada medio 2 o más colonias típicas o sospechosas
Confirmaciones

DE Salmonella
AGAR KLIGLER
DÍA 5 Pruebas bioquímicas

DÍA 6
INVESTIGACIÓN DE LA β-GALACTOSIDASA* INVESTIGACIÓN DE LA FENILALANINA

0,25 mL de ONPG 0,5 mL de FA
0,25 mL de SS 0,5 mL de SS
Incubar a 37°C ± 1°C, con lecturas Incubar a 37°C ± 1°C durante 4 h

al cabo de 1/2 h, 1 h, 2 h y 24 h
Añadir 1 gota de cloruro férrico

DÍA 7
Si las pruebas de la β-galactosidasa y fenilalanina son k, realizar un API
DÍA 8
Pruebas serológicas
ELIMINACIÓN DE LAS ESTUDIO DE LOS ANTÍGENOS

CEPAS AUTOAGLUTINABLES
SS «O»
* Ver NOTA 1, pág. 119

DE Listeria monocytogenes
PNT - AL - 023.1 Basado en la norma ISO 11290-1 (Diciembre 1997)
1. Definición:
Listeria monocytogenes: Microorganismos que forman colonias características en los medios
selectivos especificados y que poseen las características bioquímicas, morfológicas y fisio-
lógicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
Caldo Fraser semi (FS).
Caldo Fraser completo (FC).
Agar OXFORD.
Agar PALCAM.
Agar triptona de soja-extracto de levadura (TSYEA).
Agar sangre (AS).
Caldo para la utilización de los glúcidos (ramnosa y xilosa).
3. Reactivos:
Solución de peróxido de hidrógeno.
Suplemento para el medio Fraser semi.
Suplemento para el medio Fraser completo.
4. Cepas:
Cepa de Rhodococcus equi (ATCC 25923).
Cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 6939).
5. Siembra:
• Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de FS a 25 mL o 25 g de muestra (x mL x g
de muestra + 9x mL de medio).
Enriquecimiento:
• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con FC.
Aislamiento:
• Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar OXFORD.
• Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar PALCAM.
• Sembrar el cultivo de enriquecimiento en agar OXFORD.
• Sembrar el cultivo de enriquecimiento en agar PALCAM.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario).
NOTA 1: En agar OXFORD, al cabo de 24 h de incubación, las colonias de Listeria sp son

pequeñas, de color grisáceo, rodeadas de un halo negro. Después de incubar 24 h más, do-
blan su tamaño, se vuelven más oscuras, a veces con reflejos verdosos, apareciendo un halo
negro y una depresión central.
En agar PALCAM, al cabo de 24 h de incubación, las colonias de Listeria sp. son pequeñas,
de color verde con reflejos grisáceos, eventualmente con un centro negro y siempre rodeadas
de un halo negro. Después de incubar 24 h más, aparece una depresión central.
6. Confirmación de Listeria sp:

• A partir de cada placa incubada, tomar 5 colonias presuntivas de Listeria sp. (si una placa
tiene menos de 5 colonias, retenerlas todas).
• Aislar en TSYEA.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (o hasta que haya un desarrollo satisfactorio)52.
NOTA 2: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeñas, convexas, inco-
loras, translúcidas y con bordes regulares.
Prueba de la catalasa:
Realizar la prueba en una colonia aislada en TSYEA.
Coloración de Gram:
Las colonias de Listeria sp. se presentan en forma de pequeños y finos bacilos Gram j.
Examen de movilidad 53:
• Sembrar por picadura una colonia en AM.
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+ 3 días si es necesario).
• Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son móviles y dan un cultivo
típico en forma de sombrilla.
7. Confirmación de Listeria monocytogenes:

Investigación de la hemólisis:
• Sembrar por picadura en AS una colonia aislada en TSYEA.
• Sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y negativo (Listeria inno-
cua).
• Examinar con luz blanca. Listeria monocytogenes presenta una estrecha zona de clara y li-
gera β-hemólisis.
Utilización de glúcidos:
• Sembrar en xilosa y ramnosa una colonia aislada en TSYEA.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 5 días. La reacción es positiva si aparece una coloración
amarilla.
Test de CAMP:
• Sembrar en paralelo en AS las cepas de Rhodococcus equi y de Staphylococcus aureus.
• Sembrar en perpendicular las cepas problema, junto con dos cepas control (Listeria mo-
nocytogenes y Listeria innocua).
NOTA 3: La reacción es positiva si hay un aumento de la zona de β-hemólisis en la inter-

sección de la cepa a ensayar con cada uno de los otros cultivos.
52
En caso necesario, realizar el test de iluminación de Henry. Listeria sp. aparece de color azulado con
una superficie granulada.
53
Si se observa al microscopio, Listeria sp. aparece como bacilos finos y cortos, con movilidad en for-
ma de voltereta.
8. Interpretación:
Todas las Listeria sp. se presentan como pequeños bacilos Gram j, móviles, catalasa j.
Listeria monocytogenes se diferencia de las demás especies por las características siguientes:
Producción ácido CAMP test

Especie Hemólisis
Ramnosa Xilosa S. aureus R. equi
L. monocytogenes + + – + –
L. innocua – V – – –
L. ivanovii + – + – +
L. seeligeri (+) – + (+) –
L. welshimeri – V + – –
L. grayi – – – – –
siendo:
* V: reacción variable
* (+): reacción débil
* +: reacción positiva en más del 90%
* –: ausencia de reacción

Pre-enriquecimiento
DÍA 1 25 mL o 25 g de muestra
225 mL de FS
DM + suplemento (x mL)

DÍA 2
Enriquecimiento
0,1 mL
+0,1 mL de suplemento
Agar OXFORD Agar PALCAM FC

durante 24 h ± 2 h (+24 h si nec.) durante 48 h ± 2 h
DÍA 3
Aislamiento
Agar OXFORD Agar PALCAM

DÍA 4
Confirmación del género
Sembrar 5 colonias de cada placa en TSYEA
DÍA 5
PRUEBA DE LA CATALASA MOVILIDAD COLORACIÓN GRAM

* Imagen después de incubación
AM
AM: Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+3 días si es necesario)
Confirmación de la especie*
INVESTIGACIÓN HEMÓLISIS UTILIZACIÓN GLÚCIDOS TEST CAMP
AS Ramnosa Xilosa AS
Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+4 h días para glúcidos)
DÍA 6
Lectura

1. Definición:
Listeria monocytogenes: Microorganismos que forman colonias características en los me-
dios selectivos especificados y que poseen las características bioquímicas, morfológicas y
fisiológicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
Agar PALCAM.
Agar sangre (AS).
3. Reactivo:
4. Cepas:
Cepa de Rhodococcus equi (ATCC 25923).
Cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 6939).
5. Siembra:
• Preparar la dilución madre añadiendo 100 mL de APT a 10 mL o 10 g de muestra (x mL
o x g de muestra + 9x mL de medio).
• Dejar en reposo durante 1 h ± 5 min.
• Sembrar por duplicado 0,1 mL de la dilución madre en agar PALCAM.
• Repetir esta operación con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales 54.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+ 18 h - 24 h si es necesario).
6. Recuento:
• Contar las colonias que, tras 24 h de incubación, sean pequeñas, de color grisáceo y ro-
deadas de un halo negro. Después de incubar 24 h más, las colonias son mayores, even-
tualmente con reflejos verdosos y con una depresión central.
• Retener las placas con menos de 150 colonias características, si es posible al nivel de dos
diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 co-
lonias.
54
duplicado).
7. Confirmación de Listeria sp.:

• Tomar cinco colonias presuntivas de Listeria sp. de cada placa retenida y sembrar por se-
parado en placas de TSYEA.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (o hasta que haya un desarrollo satisfactorio) 55.
NOTA: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeñas, convexas, inco-
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h ± 3 días.
• Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son móviles y dan un culti-
vo típico en forma de sombrilla.

• Sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y negativo (Listeria in-
nocua).
• Examinar con luz blanca. Listeria mococytogenes presenta una estrecha zona de clara y
ligera β-hemólisis.
amarilla.
Test de CAMP:
• Sembrar en perpendicular las cepas problema, junto con dos cepas control (Listeria
monocytogenes y Listeria innocua). La reacción es positiva si hay un aumento de la zona
de β-hemólisis en la intersección de la cepa a ensayar con cada uno de los otros cultivos.
9. Interpretación:
Todas las Listeria sp. se presentan como pequeños bacilos Gram j, móviles, catalasa j.
Listeria monocytogenes se diferencia de las demás especies por las características descritas
en la tabla del PNT-AL-023.1.
55
56
Si se observa al microscopio, Listeria sp aparece como bacilos finos y cortos, con movilidad en for-
ma de voltereta.

• Calcular el número a de colonias de Listeria monocytogenes presentes con la expresión:
b
a= ⋅C
A
• De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Listeria
monocytogenes por mililitro o por gramo con la expresión:
Σa
N=
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
57

25 mL o 25 g de muestra
DÍA 1 225 mL de FS
DM
Dejar en reposo durante 1 h ± 5 min
1 mL 1 mL 1 mL
10–1 10–2 10–3 10–4
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

Agar PALCAM
10–1 10–2 10–3 10–4

Tapar y dejar absorber durante 15 min a T ambiente
Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+18 h-24 h si es necesario)
DÍA 2
10–1 10–2 10–3 10–4

DÍA 3
INVESTIGACIÓN HEMÓLISIS* UTILIZACIÓN GLÚCIDOS* TEST CAMP*

1. Definición:
Listeria monocytogenes: Microorganismos que forman colonias características en los medios
selectivos especificados y que poseen las características bioquímicas, morfológicas y fisio-
lógicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
Caldo Fraser semi (FS).
Caldo Fraser completo (FC).
Agar OXFORD.
Agar PALCAM.
Agar sangre (AS).
3. Reactivos:
Suplemento para el medio Fraser semi.
Suplemento para el medio Fraser completo.
4. Cepas:
Cepa de Rhodococcus equi (CIP 5869).
Cepa de Staphylococcus aureus (CIP 5710).
5. Siembra:
• Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de FS a 25 mL o 25 g de muestra (x mL o
x g de muestra + 9x mL de medio).
• Incubar a 30°C ±1°C durante 24 h ±2 h.
Enriquecimiento:
• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con FC.
Aislamiento 58:
• Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar OXFORD.
• Sembrar en agar OXFORD el cultivo de enriquecimiento incubado durante 24 h.
• Sembrar en agar OXFORD el cultivo de enriquecimiento incubado durante 48 h.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h 2 h (+ 24 h si es necesario).
NOTA 1: En agar OXFORD, al cabo de 24 h de incubación, las colonias de Listeria sp. son
pequeñas, de color grisáceo, rodeadas de un halo negro. Después de incubar 24 h más, do-
blan su tamaño, se vuelven más oscuras, a veces con reflejos verdosos, apareciendo un halo
negro y una depresión central.
58
Según el tipo de flora acompañante de las muestras, podemos sustituir el agar Oxford por agar
PALCAM.
6. Identificación de Listeria sp.:

• A partir de cada placa incubada, tomar 5 colonias presuntivas de ser Listeria sp. (si una
placa tiene menos de 5 colonias, retenerlas todas).
• Sembrar en TSYEA.
• Incubar a 37°C ±1°C durante 18 h - 24 h (o hasta que haya un desarrollo satisfactorio) 59.
NOTA 2: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeñas, convexas, inco-
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+ 3 días si es necesario).
• Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son móviles y dan un cultivo
típico en forma de sombrilla.

• Sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y negativo (Listeria inno-
cua).
• Examinar con luz blanca. Listeria mococytogenes presenta una estrecha zona de clara y li-
gera β-hemólisis.
amarilla.
Test de CAMP:
• Sembrar en perpendicular las cepas problema, junto con dos cepas control (Listeria mo-
nocytogenes y Listeria innocua).
NOTA 3: Considerar la reacción positiva si hay un aumento de la zona de β-hemólisis en la

intersección de la cepa a ensayar con cada uno de los otros cultivos.
59
60
Si se observa al microscopio, Listeria sp. aparece como bacilos finos y cortos, con movilidad en for-
ma de voltereta.
8. Interpretación:
Todas la Listeria sp. se presentan como pequeños bacilos Gram j, móviles catalasa j. Lis-
teria monocytogenes se diferencia de las demás especies por las características siguientes:
Producción ácido CAMP test

Especie Hemólisis
Ramnosa Xilosa S. aureus R. equi
L. monocytogenes + + – + –
L. innocua – V – – –
L. ivanovii + – + – +
L. seeligeri (+) – + (+) –
L. welshimeri – V + – –
L. grayi – – – – –
siendo:
* V: reacción variable
* (+): reacción débil
* +: reacción positiva en más del 90%
* –: ausencia de reacción

Pre-enriquecimiento 25 mL o 25 g de muestra
DÍA 1 225 mL de FS
DM + suplemento (x mL)

DÍA 2
Enriquecimiento
* 24 h si es necesario
0,1 mL
+0,1 mL de suplemento
Agar OXFORD FC
DÍA 3 durante 24 h ± 2 h* durante 24 h ± 2 h* durante 48 h ± 2 h*
DÍA 4
Aislamiento
Agar OXFORD
DÍA 5
Confirmación del género
DÍA 6

AM
Confirmación de la especie*
INVESTIGACIÓN HEMÓLISIS UTILIZACIÓN GLÚCIDOS TEST CAMP

DÍA 6
Lectura

DE Campylobacter TERMOTOLERANTES
1. Definiciones:
Campylobacter termotolerantes: Microorganismos que forman colonias típicas en me-
dios selectivos sólidos cuando se incuban a 42°C y que poseen una movilidad característi-
ca y las propiedades bioquímicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente
método.
Caldo de Park y Sanders.
Agar de Karmali (AK).
Agar Butzler modificado.
Caldo de Brucella (CB).
Agar de sangre Columbia.
Agar citrato de hierro tres azúcares (TSI).
Agar de sangre Mueller Hinton.
3. Reactivos:
Sangre de caballo desfibrinada.
Solución de antibióticos «A».
Solución de antibióticos «B».
Solución H2O2 al 3%.
Reactivo para la detección de la hidrólisis del hipurato.
• Solución de hipurato sódico.
• Solución de nihidrina al 3,5%.
Discos de ácido nalidíxico.
Discos de cefalotina.
4. Siembra:
• Preparar la dilución madre añadiendo 9x mL de caldo Park y Sanders a x (g o mg) de
muestra.
• Sembrar con asa en AK.
• Sembrar con asa en agar Butzler modificado.
• Incubar a 42°C ± 1°C en atmósfera microaerófila, inspeccionando al cabo de 48 h y 72 h
(+ 2 días si es necesario).
Pre-enriquecimiento 61:
• Incubar la dilución madre de caldo Park y Sanders durante 4 h a 32°C ± 1°C en atmósfe-
ra microaerófila.
61
En ciertos casos, se puede sustituir el caldo Park y Sanders por caldo Preston. Ver norma ISO
10272.
Enriquecimiento:
• Añadir la solución antibiótica «B» al 5%.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 2 h y luego 40 h ± 2 h a 42°C ± 1°C en atmósfera microae-
rófila.
Aislamiento:
• Sembrar el cultivo enriquecido en AK.
• Sembrar el cultivo enriquecido en agar Butzler modificado.
• Incubar a 42°C ± 1°C en atmósfera microaerófila durante 24 h (+ 4 días si es necesario).
NOTA: En AK las colonias de Campylobacter termotolerantes son grises, planas y húme-
das, con tendencia a extenderse. En agar Butzler las colonias características pueden virar a
marrón y pueden tener distintos tamaños.
5. Confirmación:
• Retener de cada medio 5 colonias características o sospechosas.
Morfología y movilidad:
• Hacer una tinción Gram de una colonia de cada placa y examinar al microscopio.
• Emulsionar cada colonia de bacilos Gram k curvados en 1 mL de CB y observar la mo-
vilidad; Campylobacter se mueve en forma de sacacorchos.
• Sembrar las colonias que posean estas características en agar Columbia sangre e incubar
en atmósfera microaerófila a 42°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
6. Identificación
Crecimiento a 25°C:
• Sembrar con asa las colonias anteriores en CB.
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 2-5 días en atmósfera microaerófila.
• Examinar si hay crecimiento.
* PRUEBA DE LA OXIDASA
* AGAR TSI
• Sembrar en TSI las colonias seleccionadas.
• Incubar a 42°C (1°C durante 24 h (+ 5 días si es necesario) en atmósfera microaerófila.
Interpretación: Consideraremos los siguientes resultados:

Pendiente Amarillo Lactosa j / Sacarosa j
Rojo o sin cambio de color Lactosa k / Sacarosa k
* PRUEBA DE LA CATALASA
* SENSIBILIDAD AL ÁCIDO NALIXÍDICO Y A LA CEFALOTINA
• Realizar una suspensión en CB de densidad 0,5 en la escala McFarland.
• Diluir la suspensión 1:10 con el mismo caldo.
• Inundar la superficie de una placa de agar Mueller Hinton al 5% de sangre con la sus-
pensión.
• Dejar en contacto durante 5 minutos y eliminar el exceso.
• Secar las placas en la estufa a 37°C ± 1°C durante 10 minutos.
• Colocar en la superfície del agar un disco de ácido nalidíxico (30 μg) y un disco de ce-
falotina (30 μg).
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2h en atmósfera microaerófila.
Interpretación: Consideraremos resistente la bacteria si hay crecimiento hasta el límite
del disco y sensible si hay zonas sin crecimiento (zonas de inhibición).
* DETECCIÓN DE LA HIDRÓLISIS DEL HIPURATO
• Sembrar las colonias de bacilos Gram k aisladas en tubo de hemolisis con 0,4 mL de
solución de hipurato sódico.
• Mezclar e incubar a 37°C ± 0,5°C durante 2 h en un baño de agua.
• Añadir, sin mezclar, 0,2 mL de solución de nihidrina en la superficie de la solución de
hipurato sódico.
• Incubar durante 10 minutos más.
Interpretación: Consideramos la reacción positiva si aparece coloración violeta oscuro.
7. Interpretación de resultados:
Las colonias de Campylobacter sp. son:

Bacilos pequeños y curvados.

Con movilidad característica.

Gram k.

Oxidasa j.

Glucosa k.

Lactosa k.

Sacarosa k.

Producción de gas k.
Consideramos presencia de Campylobacter sp. si al menos una colonia presenta estas ca-
racterísticas.
Características C. jejuni C. coli C. lari C. upsaliensis

Crecimiento de 25°C – – – –
H2S (Agar TSI)* – (+) – –
Ácido nalixídico S S R S
Hidrólisis del hipurato + – – –
Catalasa + + + – o débil
Cefalotina R R R S
Leyenda: +: positivo; –: negativo; (+): débilmente positivo; S: sensible; R: resistente
* Débil producción de H2S en el agua de condensación al cabo de 5 días.
62

DE Camylobacter TERMOTOLERANTES
x g o x mL de muestra
DÍA 1 9x mL de caldo de Park y Sanders DÍA 1
+ suplementos
Pre-enriquecimiento
AK Agar Butzler modificado
Incubar a 42°C ± 1°C en atm. Incubar a 32°C ± 1°C en atm.
microaerófila durante 48 h y 72 h microaerófila durante 4h
(+2 días si es necesario)
DÍA 3
Enriquecimiento
Añadir solución antibiótica B al 5%

Incubar a 37°C ± 1°C durante 2 h
DÍA 3
Aislamiento
AK Agar Butzler modificado

Incubar a 42°C ± 1°C durante 24 h (+4 días si es necesario)
en atmósfera microaerófila
DÍA 4 DÍA 4
Seleccionar 5 colonias típicas o sospechosas de cada placa

Tinción Gram de cada colonia. Examinar al microscopio
Emulsionar las colonias Gram k curvadas en 1 mL de CB
Observar la movilidad. Debe ser en forma de sacacorchos
Sembrar estas colonias en Agar Columbia sangre

Incubar a 42°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h en atmósfera microaerófila
DÍA 5 DÍA 5
Identificación
DE Campylobacter TERMOTOLERANTES
CRECIMIENTO A 25°C PRUEBA DE LA OXIDASA AGAR TSI SENSIBILIDAD ÁCIDO NALIXÍDICO HIDRÓLISIS DEL HIPURATO
Y CEFALOTINA
CB CB de densidad 0,5 10–1 0,4 mL hipurato sódico

Incubar a 25°C ± 1°C j si en 10 s aparece Incubar a 42°C Incubar en un baño a
en atm. microaerófila coloración malva en atm. microaerófila 37°C ± 0,5°C durante 2 h
durante 2-4 días durante 24 h
(+5 días si es necesario)
Agar Mueller-Hinton 0,2 mL de solución de

al 5% de sangre nihidrina en superficie
PRUEBA DE LA CATALASA Dejar en contacto durante
5 min y eliminar el exceso
Secar en estufa a Incubar 10 min más
37°C ± 1°C durante 10 min
PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS
j si al cabo de 30 s
aparecen burbujas j si aparece
coloración violeta
Colocar un disco de ácido nalixídico (30 μg)

y otro de cafalotina (30 μg)
139
Incubar a 25°C ± 1°C en atm. microaerófila durante 24 h ± 2 h

CAPÍTULO CUARTO
Procedimiento general de preparación

de medios de cultivo (PNT - ME - 001)
PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN
PNT - ME - 001
DE MEDIOS DE CULTIVO
1. OBJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la preparación de los

medios de cultivo necesarios para realizar los análisis de alimentos y aguas.
Se aplica a todos los medios de cultivo que se preparan en Microbiología y se utilizan en los en-
sayos que se realizan en el laboratorio.
3. REFERENCIAS
crobiológicos.
• Catálogos de las casas comerciales suministradoras.
4. PROCEDIMIENTO
Se redactará un PNT para cada uno de los medios de cultivo necesarios para realizar los ensa-
yos de el laboratorio; en él se darán instrucciones de trabajo para facilitar y agilizar su prepa-
ración.
Estos procedimientos se denominan PNT - ME y constan de los siguientes apartados:
0. Carátula.
1. Finalidad de uso.
2. Principios.
3. Preparación.
4. Composición en g/l.
5. Controles del medio preparado.
6. Conservación.
4.1. Carátula
En la carátula deberemos indicar:
• Nombre completo del medio de cultivo que se va a preparar, según su denominación en el

método o el PNT - AL en el que se utiliza y, entre paréntesis, las siglas con las que se le
conoce en el laboratorio.
• Tipo y número del PNT: PNT - ME - seguido por un número de tres cifras. Los procedi-
mientos se han numerado según el orden en el que aparecen en los PNT - AL.
143
4.2. Finalidad de uso
La finalidad de uso explica la utilidad del medio de cultivo en el ensayo en el que se utiliza.
4.3. Principios
En este apartado se explica, de manera resumida, la actividad del medio o de alguno de sus com-
ponentes en el análisis.
4.4. Preparación
Se señala, de forma clara y concisa, cada uno de los pasos a seguir para preparar el medio de cul-
tivo, indicando:
• la cantidad de medio deshidratado necesario (en caso de no disponer de medio preparado,

figurará la frase «disolver los ingredientes» e indicaremos el tipo y cantidad de compo-
nentes en el apartado composición en g/l);
• el tipo, volumen y, en caso necesario, la calidad del diluyente utilizado;
• el modo de disolución;
• la cantidad de medio a repartir, indicando el tipo y volumen del recipiente;
• si se esteriliza en autoclave, señalar el tiempo y temperatura; en caso contrario, indicar el
tipo y características del proceso de esterilización empleado;
• en caso de añadir algún reactivo, indicar el momento de adición, nombre de la sustancia y
cantidad, indicando también el número de PNT - RE - correspondiente (en caso de tratar-
se de reactivos compuestos por distintas sustancias) o la referencia comercial (en caso de
reactivos simples);
• todas las operaciones particulares de cada medio (atemperar, dejar los tubos en posición in-
clinada...).
4.5. Composición en g/l
Este apartado es una lista de cada uno de los ingredientes, indicando su nombre, calidad (si es ne-
cesario) y cantidad exacta.
NOTA 1: Esta lista está elaborada a partir de las instrucciones del fabricante del medio uti-
lizado en el laboratorio en el que se han redactado los PNT, de manera que se tendrá que
adaptar, en cada caso, a las instrucciones del proveedor.
4.6. Controles del medio preparado
Estos controles se realizan para confirmar la calidad del medio de cultivo y constan de cuatro
pruebas 1:
• Control macroscópico (examen visual).

• Control de pH.
• Control de esterilidad.
• Control de eficacia.
1
Estos controles se explican en el PNT - ME - 002 sobre control de calidad de medios de cultivo.
PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 145
En este apartado se exponen las características físicas y de pH que debe reunir el medio pre-
parado, indicando asimismo las cepas a ensayar y los caracteres a estudiar en el control de efi-
cacia, basados principalmente en la morfología y el color de las colonias y en las reacciones de
diferenciación y selectividad.
4.7. Conservación
Indicar, para cada tipo de recipiente utilizado, las condiciones de tiempo y temperatura necesarias
para la conservación del producto en condiciones óptimas, de manera que su eficacia no se vea
alterada.
En aquellos medios de cultivo que se puedan alterar con la luz o la humedad, deberán indi-
carse estas condiciones particulares de almacenamiento.
NOTA 2: Cuando se indica que el medio de cultivo debe utilizarse inmediatamente, se per-
mite que el producto se pueda emplear durante un periodo de 5 horas después de su prepa-
ración.
CAPÍTULO QUINTO
Procedimiento general de control de calidad

de medios de cultivo (PNT - ME - 002)
PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL
PNT - ME - 002
DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO
1. OBJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la realización de los con-
troles de medios de cultivo.
Se aplica a todos los medios de cultivo que se preparan en Microbiología y se utilizan en los en-
sayos que se realizan en el laboratorio.
3. REFERENCIAS
crobiológicos.
4. PROCEDIMIENTO
Los medios de cultivo utilizados en los ensayos del laboratorio deben pasar unos controles, que
se especifican en el apartado 5 de su PNT - ME correspondiente.
En general se realiza:
• Un control macroscópico.
• Un control de pH a 25°C.
• Un control de esterilidad.
• Un control de eficacia.
Los controles del medio se deben realizar el mismo día o como máximo al siguiente de su
preparación.
4.1. Control macroscópico
El control macroscópico es un examen visual que se realiza en todos los casos para poder des-
cartar cualquier error importante en la preparación del reactivo. Se observa si su consistencia (lí-
quida o sólida), su color y su aspecto (transparente, opalescente, con o sin precipitado...) co-
rresponden con los que se indican en el PNT.
4.2. Control de pH
Se realiza con un pHímetro una medición del pH del medio a una temperatura de 25°C; el valor
obtenido ha de corresponder con el indicado en el PNT correspondiente, donde se da un intervalo
de aceptación de ± 0,2.
149
4.3. Control de esterilidad
Este control se efectúa para comprobar que el medio de cultivo no está contaminado, cosa que lo
haría inadecuado para su finalidad.
Después de incubar el medio (un 10% del lote preparado) a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 4 h,
se observa su aspecto, transparencia, si hay turbidez o cambio en el color, si hay gas en la
campana de Durham... Se desechará el medio que presente alteraciones en alguno de estos ca-
racteres.
En el caso de los medios no transparentes, realizar un subcultivo en un medio de cultivo no
selectivo (AN, PCA, TSA). Los medios destinados a controles de esterilidad deberán incubarse
en su totalidad.
4.4. Control de eficacia
Este control se realiza para comprobar la eficacia del medio de cultivo, observando determinados
caracteres que el crecimiento de determinadas cepas (que se especifican en el PNT - ME co-
rrespondiente) produce en el medio que se está controlando.
Se siembran tantas placas o tubos con medio de cultivo como cepas distintas se requieran
para el control y se incuban en las mismas condiciones de tiempo y temperatura que se necesitan
para el análisis de alimentos o de aguas en que interviene el medio.
Después de la incubación se evalúan las características dadas en el PNT - ME, observando
aspectos como el crecimiento y color de las colonias, el color del medio, la formación de preci-
pitado o de gas, si hay o no halo...
CAPÍTULO SEXTO
Procedimiento de preparación
de medios de cultivo
RELACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y PNT - AL EN EL QUE APARECEN
PNT-ME MEDIOS SIGLAS PNT-AL
003 PEPTONA SALINA PS TODOS

003
004 AGAR PARA RECUENTO PCA
004
003
005 AGAR BLANCO AB
004
005
006 AGAR GLUCOSA Y CLORANFENICOL CGA
006
CALDO TAMPONADO CON BILIS, VERDE BRILLANTE CALDO 007.1
007
Y GLUCOSA EE 008
007.1
007.2
008 AGAR BILIS CRISTAL VIOLETA Y GLUCOSA VRBG
008
009
007.1
007.2
009 AGAR GLUCOSADO AG 008
009
017
007.1
007.2
008
010 AGAR NUTRITIVO AN
009
021
022
011 CALDO NUTRITIVO CN
008
021
012 AGUA DE PEPTONA TAMPONADA APT
022
023.2
010
013 CALDO DE TRIPTONA LAURIL SULFATO TSL
013
014 CALDO LACTOSADO BILIADO VERDE BRILLANTE BGBL 010
AGAR LACTOSADO BILIADO AL CRISTAL VIOLETA 011
015 VRBL
Y ROJO NEUTRO 012
016 CALDO EC EC 013
017 AGUA DE TRIPTONA AT 013
018 AGAR CON TERGITOL-BCIG PTX 014
015.1
019 MEDIO DE BAIRD-PARKER BP
016.1
015.1
020 CALDO CEREBRO-CORAZÓN BHI
016.1
015.2
021 AGAR CON PLASMA DE CONEJO Y FIBRÓGENO RPF
16.2
017
022 AGAR MANITOL YEMA DE HUEVO CON POLIMIXINA MYPA
018
023 MEDIO VOGES-PROSKAUER MR-VP 017
024 MEDIO NITRATO MN 017
153
PNT-ME MEDIOS SIGLAS PNT-AL
018
025 AGAR SANGRE AS 023.1
023.2
024
018
023.1
026 AGAR MOVILIDAD AM
023.2
024
019
027 AGAR TRIPTONA-SULFITO CON CICLOSERINA TSC
020
019
028 MEDIO TIOGLICOLATO TIO
0020
019
029 MEDIO LACTOSA SULFITO LS
020
CALDO CON VERDE DE MALAQUITA Y CLORURO DE 021
030 RV
MAGNESIO O DE RAPPAPORT-VASSILIADIS MODIFICADO 022
021
031 CALDO SELENTO-CISTINA VSC
022
032 AGAR ROJO FENOL Y VERDE BRILLANTE BGA 021
021
033 HEKTOEN
022
021
034 AGAR KLIGLER
022
035 AGAR NUTRITIVO SEMISÓLIDO 021
023.1
036 CALDO FRASER SEMI FS
024
023.1
037 CALDO FRASER COMPLETO FC
024
023.1
038 AGAR OXFORD
024
023.1
039 AGAR PALCAM 023.2
024
023.1
040 AGAR TRIPTONA DE SOJA-EXTRACTO DE LEVADURA TSYEA 023.2
024
023.1
041 CALDO PARA LA UTILIZACIÓN DE LOS GLÚCIDOS 023.2
024
042 CALDO DE PARK Y SANDERS 025
043 AGAR KARMALI AK 025
044 AGAR BUTZLER MODIFICADO 025
045 CALDO DE BRUCELLA CB 025
046 AGAR DE SANGRE COLUMBIA 025
047 AGAR DE SANGRE MUELLER-HINTON 025
048 AGAR CITRATO DE HIERRO TRES AZÚCARES TSI 025
049 CALDO TRIPTONA DE SOJA TSB RE-004
PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 155
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN

PNT - ME - 003
DE LA PEPTONA SALINA (PS)
1. Finalidad de uso:
PS (Peptona Salina) es un diluyente que se utiliza para realizar la dilución madre y los ban-
cos de diluciones.
2. Principios:
Se trata de un medio no inhibidor que facilita la recuperación de microorganismos estre-
sados.
3. Preparación:
• Disolver los ingredientes en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir:
| 9 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm. o
| el volumen necesario, según uso, en frascos de capacidad adecuada (uno de los dos).
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
4. Composición en g/l:
Peptona .......................................................................................................................... 1
Cloruro sódico ............................................................................................................... 8,5
5. Controles del medio preparado:

| Control macroscópico: Caldo de color amarillo claro, sin precipitado.
| pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
Microorganismo Crecimiento
Listeria monocytogenes Bueno
Escherichia coli Bueno
6. Conservación:
| Frascos ............................................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 004
DEL AGAR PARA RECUENTO (PCA)
PCA (Plate Count Agar) es un medio de cultivo utilizado para la multiplicación y recuento
por inclusión de todos los microorganismos aerobios mesófilos poco exigentes, en alimentos.
2. Principios:
La composición del medio permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos.
3. Preparación:
• Disolver 23,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Según el uso:
| Placas:
Repartir 150 mL de medio en frascos de 250 mL.
Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
Repartir asépticamente en placas.
| Tubos:
Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
Dejar solidificar en posición inclinada.
Triptona.......................................................................................................................... 10
Extracto de levadura....................................................................................................... 2,5
Glucosa........................................................................................................................... 1
Agar bacteriológico........................................................................................................ 15

| Control macroscópico: Medio sólido de color ámbar, ligeramente opalescente.
| pH a 25°C: 7,0 + 0,2.
Staphylococcus aureus Bueno
6. Conservación:
| Frascos ........................................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con tapón de rosca .............................................................. 3 meses a 2°C-8°C.
| Placas ............................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 005
DEL AGAR PARA BLANCO (AB)
AB (Agar Blanco) se utiliza en el método ISO 4833 para el recuento en alimentos de mi-
croorganismos aerobios mesófilos poco exigentes cuando se sospecha que el producto a ana-
lizar contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie de los medios.
2. Principios:
El AB cubre el medio de cultivo, facilitando así el recuento de las colonias.
3. Preparación:
• Disolver 18 g de agar en 1 L de agua destilada.
• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
Agar bacteriológico ....................................................................................................... 18

| Control macroscópico: Medio de color blanquecino.
| pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.
6. Conservación:

PNT - ME - 006
DEL AGAR GLUCOSA Y CLORANFENICOL (CGA)
CGA (Agar Glucosa y Cloranfenicol) es un medio de cultivo utilizado para el recuento de le-
vaduras y mohos en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene extracto de levadura y glucosa, que favorecen el crecimiento de las le-
vaduras y mohos.
La presencia del clorafenicol, que es un antibiótico estable al calor, inhibe el crecimiento de
bacterias.
3. Preparación:
NOTA: Cuando este medio se utiliza para el recuento de levaduras y mohos según la
norma AFNOR (XF V 08-059), y en caso que se sospeche la presencia de contaminación
importante por bacterias Gram negativas, añadimos al medio 2 mL de SUPLEMENTO
ANTIMICROBIANO DE GENTAMICINA (PNT-RE-003). Homogeneizar sin incorporar
aire. Repartir en placas Petri estériles y dejar solidificar.
Extracto de levadura ...................................................................................................... 5
Glucosa .......................................................................................................................... 20
Cloranfenicol ................................................................................................................. 0,1

| pH a 25°C: 6,6 ± 0,2.
Saccharomyces cerevisiae Bueno
Aspergillus niger Bueno
Escherichia coli Nulo
6. Conservación:
| Placas .............................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL

PNT - ME - 007 CALDO TAMPONADO CON BILIS, VERDE BRILLANTE
Y GLUCOSA (CALDO EE)
El CALDO EE (Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa) es un medio de cul-
tivo selectivo utilizado para la detección de enterobacterias en alimentos.
2. Principios:
La presencia simultanea de bilis y verde brillante inhibe el crecimiento de la mayoría de bac-
terias Gram positivas y de las Gram negativas no enterobacterias.
Los fosfatos de sodio y potasio hacen que se mantenga el pH del medio, mejorando así su
capacidad de recuperación.
3. Preparación:
• Remover suavemente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
Peptona ..................................................................................................................... 10
Glucosa ..................................................................................................................... 5
Fosfato disódico ........................................................................................................ 6,45
Fosfato monopotásico ............................................................................................... 2
Bilis de buey desecada .............................................................................................. 20
Verde brillante .......................................................................................................... 0,015

| Control macroscópico: Caldo de color verde, translúcido y sin precipitado.
| pH a 25°C: 7,2 + 0,2.
Salmonella Enteritidis Bueno
Enterococcus faecalis Nulo
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ................................................................ 3 meses a 2°C-8°C.

PNT - ME - 008
DEL AGAR BILIS CRISTAL VIOLETA Y GLUCOSA (VRBG)
VRBG (Agar Bilis Cristal Violeta y Glucosa) es un medio de cultivo selectivo utilizado para
el aislamiento y recuento de enterobacterias en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene cristal violeta y sales biliares que inhiben el crecimiento de la flora
acompañante Gram positiva. La presencia del rojo neutro permite que se forme un halo vio-
leta al borde de las colonias debido a la acidificación de la glucosa y precipitación de las sa-
les biliares.
Las colonias de enterobacterias adquieren en este medio coloración violácea.
3. Preparación:
• Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.
• Disolver 39,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.
• Repartir 150 mL de medio en frascos estériles de 250 mL.
• NO AUTOCLAVAR.
Peptona de carne ....................................................................................................... 7
Extracto de levadura ................................................................................................. 3
Glucosa ..................................................................................................................... 10
Sales biliares ............................................................................................................. 1,5
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Rojo neutro ............................................................................................................... 0,03
Violeta cristal ............................................................................................................ 0,002
Agar bacteriológico .................................................................................................. 13

| Control macroscópico: Medio sólido de color granate claro.
| pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.
Color Color
colonias medio
Escherichia coli Bueno Rojo Rojo
Salmonella Enteritidis Bueno Rojo Rojo
Staphylococcus aureus Nulo
6. Conservación:
Utilizar inmediatamente.

PNT - ME - 009
DEL AGAR GLUCOSADO (AG)
AG (Agar Glucosado) es un medio de cultivo utilizado para observar si el microorganismo
estudiado es capaz de fermentar la glucosa.
2. Principios:
La fermentación de la glucosa provoca la acidificación del medio, de manera que el indica-
dor (púrpura de bromocresol) hará que el color pase de púrpura a amarillo al disminuir el
pH.
3. Preparación:
• Mantener los tubos en posición vertical.
• Justo antes del empleo, fundir, dejándolo hervir durante unos 10 minutos, y enfriar rápi-
damente a la temperatura de incubación (30°C ± 1°C).
Triptona .................................................................................................................... 10
Extracto de levadura ................................................................................................. 1,5
Glucosa ..................................................................................................................... 10
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Púrpura de bromocresol ............................................................................................ 0,015

| Control macroscópico: Medio sólido de color púrpura, ligeramente opalescente.
| pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.
Microorganismo Color medio

Staphylococcus aureus Amarillo
Bacillus cereus Amarillo
Pseudomonas aeruginosa Violeta
6. Conservación:
| Tubos con sero-tapón ...................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 010
DEL AGAR NUTRITIVO (AN)
AN (Agar Nutritivo) es un medio de cultivo utilizado para el crecimiento y/o recuento de mi-
croorganismos poco exigentes.
2. Principios:
El medio suministra los elementos nutritivos necesarios para el crecimiento de una amplia
variedad de microorganismos.
3. Preparación:
• Disolver 35 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición y mantener durante 1-2 min, hasta conseguir una completa disolución.
• Según el uso:
| Placas:
Repartir 150 mL de medio en frascos de 250 mL.
Esterilizar en el autoclave a 120°C durante 15 min.
Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
Repartir asépticamente en placas.
| Tubos:
Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
Esterilizar en el autoclave a 120°C durante 15 min.
Dejar solidificar en posición inclinada.
| Frascos: Almacenar según indicaciones.
Triptona .......................................................................................................................... 10
Extracto de carne ........................................................................................................... 5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
| pH a 25°C: 7,1 ± 0,2.
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ............................................................... 3 meses a 2°C-8°C.
| Placas .............................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 011
DEL CALDO NUTRITIVO (CN)
CN (Caldo Nutitivo) es un medio de cultivo utilizado para el crecimiento y/o recuento de mi-
croorganismos poco exigentes.
2. Principios:
3. Preparación:
• Esterilizar en el autoclave a 120°C durante 15 min.
Triptona .......................................................................................................................... 10
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5

| Control macroscópico: Caldo de color ámbar, ligeramente opalescente.
| pH a 25°C: 7,1 ± 0,2.
6. Conservación:

PNT - ME - 012
DEL AGUA DE PEPTONA TAMPONADA (APT)
APT (Agua de Peptona Tamponada) es un medio de cultivo utilizado para realizar un pre-en-
riquecimiento de Salmonella en alimentos.
2. Principios:
El medio revitaliza las salmonelas que hayan podido sufrir daños en el tratamiento de los ali-
mentos.
El cloruro sódico actúa manteniendo la balanza osmótica y los dos fosfatos conservan tam-
ponado el medio.
3. Preparación:
• Repartir 225 mL de medio en frascos de 250 mL o según uso.
Peptona pancreática de carne ........................................................................................ 10
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Fosfato disódico ............................................................................................................ 9
Fosfato monopotásico ................................................................................................... 1,5

| Control macroscópico: Caldo de color amarillo claro sin precipitado.
| pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.
6. Conservación:

PNT - ME - 013
DEL CALDO DE TRIPTONA LAURIL SULFATO (TLS)
TLS (Caldo de Triptona Lauril Sulfato) es un medio de cultivo selectivo utilizado para la de-
tección y recuento de coliformes totales y Escherichia coli en alimentos.
2. Principios:
Gracias a su excelente capacidad nutritiva y a la presencia de fosfatos, este medio permite un
rápido crecimiento de coliformes y la producción de gran cantidad de gas a partir de la fer-
mentación de la lactosa, incluso con poco inóculo.
El medio contiene lauril sulfato sódico, que inhibe el crecimiento de la flora acompañante sin
interferir en el crecimiento de los coliformes.
3. Preparación:
Medio de simple concentración:
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm, provistos de campana de Durham.
• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.
Medio de doble concentración:
Triptona ...................................................................................................................... 20
Lactosa ........................................................................................................................ 5
Fosfato dipotásico ....................................................................................................... 2,75
Fosfato monopotásico ................................................................................................. 2,75
Cloruro sódico ............................................................................................................ 5
Lauril sulfato sódico ................................................................................................... 0,1
| Control macroscópico: Caldo de color ámbar, limpio y sin precipitado.
| pH a 25°C: 6,8 ± 0,2.
Microorganismo Crecimiento Formación de gas

Escherichia coli Bueno Positiva
6. Conservación:
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL CALDO

PNT - ME - 014
LACTOSADO BILIADO VERDE BRILLANTE (BGBL)
BGBL (Caldo Lactosado Biliado Verde Brillante) es un medio de cultivo utilizado para la
detección y recuento de coliformes totales y fecales en alimentos (prueba presuntiva y
confirmativa).
2. Principios:
El medio contiene bilis al 2% y verde brillante, de manera que inhibe el crecimiento de prác-
ticamente todas las bacterias Gram positivas.
El crecimiento se demuestra por la turbidez del medio, y la fermentación de la lactosa por la
formación de gas en la campana de Durham.
3. Preparación:
Medio de simple concentración:
Medio de doble concentración:
Triptona ................................................................................................................... 10
Bilis bacteriológica de buey .................................................................................... 20
Lactosa .................................................................................................................... 10
Verde brillante ......................................................................................................... 0,0133

| Control macroscópico: Caldo de color verde brillante, campana sin gas.
| pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.

Escherichia coli Bueno Positivo
Salmonella Enteritidis Bueno Negativo
6. Conservación:

PNT - ME - 015 AGAR LACTOSADO CON BILIS AL CRISTAL VIOLETA
Y ROJO NEUTRO (VRBL)
VRBL (Agar Lactosado con Bilis al Cristal Violeta y Rojo Neutro) es un medio de cultivo
selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de coliformes.
2. Principios:
El medio contiene cristal violeta y sales biliares que inhiben el crecimiento de la flora
acompañante Gram positiva.
La fermentación de la lactosa provoca la acidificación del medio, dando unas colonias de co-
lor rojo debido al indicador (rojo neutro) y a veces con un halo de precipitación de ácidos bi-
liares.
3. Preparación:
• NO AUTOCLAVAR.
Triptona .................................................................................................................... 7
Lactosa ...................................................................................................................... 10
Sales biliares ............................................................................................................. 1,5
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Rojo neutro ............................................................................................................... 0,03
Violeta cristal ............................................................................................................ 0,002

| Control macroscópico: Medio sólido de color granate claro, ligeramente opalescente.
| pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.
Color Color
colonias medio
Escherichia coli Bueno Rojo Rojo
Pseudomonas aeruginosa Bueno Naranja No cambia
6. Conservación:

PNT - ME - 016
DEL CALDO Escherichia coli (CALDO EC)
El CALDO EC (Caldo Escherichia coli) es un medio de cultivo utilizado para la confirma-
ción y recuento (NMP) de coliformes fecales y Escherichia coli.
2. Principios:
Las sales biliares inhiben el crecimiento de las bacterias Gram positivas, así como de los mi-
croorganismos no adaptados al medio ambiente intestinal.
La temperatura de incubación (44°C) hace que la técnica sea más selectiva.
El crecimiento se demuestra por la turbidez, mientras que la fermentación de la lactosa se
observa por la formación de gas dentro de la campana de Durham.
3. Preparación:
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm provistos de campana de Durham.
Peptona pancreática de carne ........................................................................................ 20
Lactosa .......................................................................................................................... 5
Mezcla de sales biliares ................................................................................................. 1,5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Fosfato disódico ............................................................................................................ 4
Fosfato monopotásico ................................................................................................... 1,5

| Control macroscópico: Caldo de color ámbar claro, campana sin gas.
| pH a 25°C: 6,9 ± 0,2.

Salmonella Enteritidis Escaso Negativo
6. Conservación:

PNT - ME - 017
DEL AGUA DE TRIPTONA (AT)
AT (Agua de Triptona) es un medio de cultivo utilizado para la observación de la producción
de indol por parte de algunos microorganismos, principalmente de la familia de las Entero-
bacterias.
2. Principios:
En condiciones de aerobiosis, algunos microorganismos degradan el triptófano y lo con-
vierten en indol mediante la enzima triptofanasa. Éste es detectado por el reactivo de Kovacs
o por una mezcla de ácido nítrico y nitrato sódico, coloreando de rojo el medio.
3. Preparación:
• Calentar suavemente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 × 100 mm con tapón de rosca.
Peptona de caseína ......................................................................................................... 10
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5

| Control macroscópico: Caldo de color ámbar claro.
| pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.
Microorganismo Crecimiento Color rojo

Salmonella Enteritidis Bueno Negativo
6. Conservación:

PNT - ME - 018
DEL AGAR CON TERGITOL-BCIG (PTX)
PTX (Agar con Tergitol-BCIG) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el recuento
de Escherichia coli β-D-glucuronidasa positivos en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene tergitol-7, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas, limita la
invasión de Proteus y favorece la recuperación de Escherichia coli.
El BCIG es un substrato cromógeno; la mayoría de cepas de Escherichia coli tienen β-D-
glucuronidasa, que hidroliza el BCIG, dándole una coloración azul.
3. Preparación:
Peptona de carne ....................................................................................................... 5
Fosfato dipotásico ..................................................................................................... 0,3
Tergitol-7 .................................................................................................................. 0,095
BCIG ......................................................................................................................... 0,05

| Control macroscópico: Medio sólido blanquecino, ligeramente opalescente.
| pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.
Microorganismo Crecimiento Color colonias

Escherichia coli Bueno Azul
Citrobacter freundii Bueno Blanco
6. Conservación:
| Frascos ............................................................ 1 mes a 2°C-8°C, resguardados de la luz.

PNT - ME - 019
DEL MEDIO DE BAIRD-PARKER (BP)
BP (Baird-Parker) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el recuento de estafiloco-
cos, principalmente los CPS (Estafilococos Coagulasa Positivos) en alimentos.
2. Principios:
El cloruro de litio y el telurito potásico inhiben la flora acompañante; el telurito también es
el responsable de la coloración negra que adquieren las colonias capaces de reducirlo. La gli-
cina y el piruvato sódico estimulan el crecimiento de los estafilococos.
La adición de sulfametazina inhibe el crecimiento de Proteus, mientras que la yema de hue-
vo deja patente la acción de la lecitinasa.
3. Preparación:
• Disolver 58 g de medio deshidratado en 950 mL de agua destilada.
• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco:
| 10 mL de SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO (PNT-RE-004).
| 2 mL de TELURITO POTÁSICO AL 1% (PNT-RE-005).
| 5 mL de SULFAMETAZINA AL 0,2% 1 (PNT-RE-006).
• Homogeneizar sin incorporar aire.

• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.
• Dejar solidificar.
4. Composición en g/950 mL:
Triptona .......................................................................................................................... 10
Piruvato sódico .............................................................................................................. 10
Glicina ............................................................................................................................ 12
Cloruro de litio ............................................................................................................... 5
| Control macroscópico: Medio sólido amarillo opaco.
| pH a 25°C: 6,8 ± 0,2.
Microorganismo Crecimiento Color colonias Halo

Staphylococcus aureus Bueno Negro Positivo
Staphylococcus epidermidis Bueno Negro-grisáceo Negativo
6. Conservación:
| Frascos con medio base .................................................................. 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas .............................................................................................. 15 días a 2°C-8°C.
1
En caso que se sospeche la presencia de Proteus.

PNT - ME - 020
DEL CALDO DE CEREBRO-CORAZÓN (BHI)
BHI (Caldo de Cerebro - Corazón) es un medio nutritivo tamponado utilizado para el culti-
vo de una amplia variedad de microorganismos exigentes, tanto aerobios como anaerobios
facultativos, como Streptococcus sp., Meningococcus sp. y Staphylococcus sp.
2. Principios:
El elevado contenido de compuestos nutritivos de este medio favorece el rápido crecimien-
to de los microorganismos, manteniendo además sus características de antigenidad, viru-
lencia y toxicidad.
El medio permite realizar la prueba de la coagulasa para los estafilococos.
3. Preparación:
Extracto de cerebro ....................................................................................................... 7,8
Extracto de corazón ....................................................................................................... 9,7
Peptona de gelatina ....................................................................................................... 10
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Fosfato disódico ............................................................................................................ 2,5
Glucosa .......................................................................................................................... 2

| Control macroscópico: Caldo de color ámbar.
| pH a 25°C: 7,4 ± 0,2.
Estreptococcus pyogenes Bueno
6. Conservación:
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR

PNT - ME - 021
CON PLASMA DE CONEJO Y FIBRINÓGENO (RPF)
RPF (Agar base Baird-Parker con Plasma de Conejo y Fibrinógeno) es un medio de cultivo
utilizado para el recuento sin necesidad de confirmación de los CPS (Estafilococos Coagu-
lasa Positivos) en alimentos.
2. Principios:
El suplemento RFP (Rabbit Plasma Fibrinogen) permite observar la acción de la coagulasa
de los estafilococos y contiene un inhibidor de la tripsina para evitar la fibrinólisis total o
parcial de los halos formados en torno a las colonias coagulasa positivas.
3. Preparación:
• Fundir el medio base BP y atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• Añadir 10 mL de agua destilada estéril a un frasco de suplemento RPF.
• Mezclar suavemente hasta la disolución completa.
• Añadir el suplemento RPF al medio base BP.
MEDIO BASE:
Triptona ................................................................................................................... 10
Extracto de carne ..................................................................................................... 5
Extracto de levadura ................................................................................................ 1
Piruvato sódico ........................................................................................................ 10
Glicina ..................................................................................................................... 12
Cloruro de litio ........................................................................................................ 5
Agar bacteriológico ................................................................................................. 12,5
SUPLEMENTO RPF:
Fibrinógeno bovino ................................................................................................. 3,75 g
Plasma de conejo ..................................................................................................... 50 mL
Inhibidor de tripsina ................................................................................................ 50 mg
Telurito potásico ..................................................................................................... 25 mg
| Control macroscópico: Medio sólido de color ámbar, opalescente.
| pH a 25°C: 7,6 ± 0,2.
Microorganismo Crecimiento Halo

Staphylococcus aureus Bueno Positivo
Staphylococcus epidermidis Bueno Negativo
6. Conservación:

PNT - ME - 022
MANITOL YEMA DE HUEVO CON POLIMIXINA (MYPA)
MYPA (Agar Manitol Yema de Huevo con Polimixina) es un medio de cultivo utilizado
para la detección y recuento de Bacillus cereus en alimentos.
2. Principios:
El manitol contenido en el medio nos permite la diferenciación de Bacillus cereus, que es un
microorganismo manitol negativo, frente a la flora acompañante manitol positiva, que hace
que el rojo fenol del medio vire de rojo a amarillo.
Asimismo, el crecimiento de la flora acompañante se ve inhibido por la polimixina, que no
afecta al crecimiento Bacillus cereus.
Bacillus cereus produce lecitinasa, de manera que degrada la lecitina de la yema de huevo
formando un halo de precipitado alrededor de sus colonias.
3. Preparación:
• Disolver 46 g de medio deshidratado en 0,9 L de agua destilada.
• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco:
| 20 mL de SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO (PNT-RE-004).
| 2 mL de SULFATO DE POLIMIXINA B AL 4% (PNT-RE-007).

Peptona ..................................................................................................................... 10
Manitol ...................................................................................................................... 10
Cloruro sódico .......................................................................................................... 10
Extracto de carne ...................................................................................................... 1
Rojo fenol ................................................................................................................. 0,025
| Control macroscópico: Medio sólido de color rojo-rosado.
| pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.
Color Color
Microorganismo Crecimiento Halo
colonias medio
Bacillus cereus Bueno Incoloro Rojo +
Staphylococccus aureus Bueno Amarillo Amarilo +/–
6. Conservación:
| Frascos con medio base ................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas ............................................................................................ 1 semana a 2°C-8°C.

PNT - ME - 023
DEL MEDIO VOGES PROSKAUER (MR-VP)
MR-VP (Rojo de Metil-Voges Proskauer) es un medio utilizado como prueba bioquímica
para diferenciar los microorganismos (principalmente enterobacterias) según la vía que
utilicen para degradar la glucosa.
2. Principios:
Algunos microorganismos fermentan la glucosa por la vía llamada ácido-mixta, produ-
ciendo una importante acidificación del medio. Así, al añadir el indicador rojo de metilo este
se mantendrá de color rojo a pH < 4,4. En caso que pH > 5,1 el medio se volverá amarillo.
Otros microorganismos la fermentan por la vía de degradación del 2,3-butanodiol; este
metabolito se manifiesta con los reactivos para Voges-Proskauer (solución de α-naftol y de
KOH), que en una reacción positiva dan un color rosa violáceo en la parte superior del tubo.
3. Preparación:
• Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 × 100 mm con tapón de rosca.
Peptona de carne .............................................................................................................. 7
Glucosa ............................................................................................................................ 5
Fosfato dipotásico ............................................................................................................ 5

| Control macroscópico: Caldo de color ámbar translúcido.
| pH a 25°C: 6,9 ± 0,1.
Microorganismo Rojo metilo Voges Proskauer

Escherichia coli Positivo Negativo
Enterobacter cloacae Negativo Positivo
NOTA: La lectura se realiza con:

ROJO DE METILO (PNT-RE-008)

SOLUCIÓN DE α-NAFTOL + KOH AL 40% (PNT-RE-009)

SOLUCIÓN DE KOH AL 40% (PNT-RE-010)
6. Conservación:

PNT - ME - 024
DEL MEDIO NITRATO (MN)
MN (Medio Nitrato) es un medio de cultivo que pone en evidencia la capacidad del micro-
organismo de reducir los nitratos a nitritos.
2. Principios:
La presencia de nitritos se manifiesta mediante la adición de reactivos, que hacen que el me-
dio se vuelva rojo.
3. Preparación:
Peptona ............................................................................................................................ 5
Extracto de carne ............................................................................................................. 3
Nitrato potásico ................................................................................................................ 1

| Control macroscópico: Caldo de color ámbar translúcido.
| pH a 25°C: 7,0 ± 0,1.
Microorganismo Crecimiento Formación de NO2

Pseudomonas aeruginosa Bueno Negativo
NOTA: La lectura se realiza con:

REACTIVO DE NITRATOS (PNT-RE-019)
6. Conservación:

PNT - ME - 025
DEL AGAR SANGRE (AS)
AS (Agar Sangre) es un medio de cultivo con elevado poder nutritivo utilizado para el re-
cuento, aislamiento y conservación de microorganismos delicados.
2. Principios:
La composición nutritiva del medio permite la recuperación de microorganismos sin inter-
ferir en sus reacciones hemolíticas.
3. Preparación:
• Añadir un 5% de SANGRE DE CORDERO ESTÉRIL.
• Mezclar suavemente.
• Repartir en placas Petri estériles.
NOTA: El medio se puede preparar en doble capa poniendo en el fondo de la placa una
capa sin sangre.
Peptona .......................................................................................................................... 15
Hígado hidrolizado ........................................................................................................ 2,5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Agar ............................................................................................................................... 12

| Control macroscópico: Medio sólido de color rojo sangre.
| pH a 25°C: 7,4 ± 0,2.
Microorganismo Crecimiento Hemólisis

Staphylococcus aureus Bueno β +++
Streptococcus pyogenes Bueno β +++
6. Conservación:
| Frascos con medio base ................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas ............................................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 026
DEL AGAR MOVILIDAD (AM)
AM (Agar Movilidad) es un medio de cultivo que permite diferenciar entre microorganismos
móviles o inmóviles.
2. Principios:
El medio contiene una cantidad muy pequeña de agar, permitiendo así visualizar el despla-
zamiento de los microorganismos móviles y el estancamiento de los inmóviles.
3. Preparación:
• Disolver los componentes en 1 L de agua destilada.
• Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Enfriar en posición vertical a temperatura ambiente.
Peptona de caseína ........................................................................................................ 20
Peptona de carne ........................................................................................................... 6,1
Agar bacteriológico ....................................................................................................... 3,5

| Control macroscópico: Medio translúcido, ligeramente opalescente.
| pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.
Microorganismo Movilidad
Proteus hauseri Positivo
Klebsiella pneumoniae Negativo
6. Conservación:

PNT - ME - 027
AGAR TRIPTONA-SULFITO CON CICLOSERINA (TSC)
TSC (Agar Triptona-Sulfito con Cicloserina) es un medio de cultivo selectivo utilizado para
el aislamiento y recuento de clostridios sulfito-reductores en alimentos.
2. Principios:
Los clostridios reducen el sulfito a sulfuro, que reacciona con el citrato de hierro formando
un halo negro alrededor de las colonias por la precipitación del sulfuro de hierro.
La presencia de cicloserina da más especificidad al medio.
3. Preparación:
• Repartir 20 mL en tubos de 18 × 180 mm o 150 mL en frascos de 250 mL de capacidad,
según su uso.
• En el momento de preparar los tubos o frascos, añadir el SUPLEMENTO DE CICLO-
SERINA:
| En tubos: 0,2 mL.
| En frascos: 1,5 mL.
Triptona .......................................................................................................................... 15
Peptona de carne ............................................................................................................ 5
Metabisulfito sódico ...................................................................................................... 1
Citrato férrico amoniacal ............................................................................................... 1

| Control macroscópico: Medio sólido de color ámbar.
| pH a 25°C: 7,6 ± 0,2.
Clostridium perfringens Bueno Negras
6. Conservación:
| Frascos con medio base ...................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ......................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 028
DEL TIOGLICOLATO (TIO)
TIO (Tioglicolato) es un medio de cultivo utilizado para controles de esterilidad orientado a
bacterias anaerobias estrictas o facultativas.
2. Principios:
La reducción de la cisteína y del sulfito sódico crea unas condiciones adecuadas para mi-
croorganismos anaerobios, ayudando también a ello la presencia de agar.
La resazurina se utiliza como de indicador de óxido reducción.
La ausencia de agentes selectivos permite el crecimiento de la mayoría de los microorga-
nismos.
3. Preparación:
• Dejar atemperar a temperatura ambiente.
NOTA: En el momento de utilizar, regenerar el medio colocando los tubos durante 10 min
en un baño hirviendo y dejar atemperar.
Triptona .................................................................................................................... 15
Glucosa ..................................................................................................................... 5,5
Cloruro sódico .......................................................................................................... 2,5
Tioglicolato sódico ................................................................................................... 0,5
Cisteína ..................................................................................................................... 0,5
Resazurina ................................................................................................................ 0,001
Agar bacteriológico .................................................................................................. 0,75
| Control macroscópico:
— Medio regenerado: Caldo de color ámbar traslúcido.

— Medio no regenerado: Caldo ligeramente espeso de color ámbar traslúcido con la su-
perficie rosada brillante.
| pH a 25°C: 7,1 ± 0,2.
Estreptococcus pyogenes Bueno
Clostridium perfringens Bueno
6. Conservación:
| Tubos con sero-tapón . .............................. 1 mes a T ambiente, resguardados de la luz.

PNT - ME - 029
DEL MEDIO LACTOSA SULFITO (LS)
LS (Lactosa Sulfito) es un medio de cultivo selectivo utilizado para la identificación de Clos-
tridium perfringens en alimentos.
2. Principios:
La presencia de campana de Durham permite observar la fermentación de la lactosa.
El medio contiene metabisulfito y una sal de hierro, que reaccionan dando lugar a un preci-
pitado negro de sulfuro de hierro.
La temperatura de incubación (46°C ± 1°C) hace que el medio sea más selectivo.
3. Preparación:
• En el momento de utilizar, añadir asépticamente a cada tubo:
| 0,5 mL de METABISULFITO SÓDICO AL 1,2% (PNT-RE-12).
| 0,5 mL de CITRATO DE HIERRO AMONIACAL AL 1% (PNT-RE-13).
NOTA: En el momento de utilizar, regenerar el medio colocando los tubos durante 10 min
en un baño hirviendo y dejar atemperar (antes de incorporar los reactivos).
Triptona ......................................................................................................................... 5
Extracto de levadura ...................................................................................................... 2,5
Lactosa .......................................................................................................................... 10
Cloruro sódico ............................................................................................................... 2,5
Clorhidrato de cisteína .................................................................................................. 0,3

| Control macroscópico (medio regenerado): Caldo de color ámbar claro. Al regenerar el
medio, la campana puede tener un poco de aire que desaparece al enfriarse.
| pH a 25°C: 7,1 ± 0,1.
Gas Precipitado
(1/4 de la campana) negro
Clostridium perfringens Bueno Positivo Positivo
6. Conservación:
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL CALDO

PNT - ME - 030 CON VERDE DE MALAQUITA Y CLORURO DE MAGNESIO
(RAPPAPORT-VASSILIADIS MODIFICADO) (RV)
RV (Caldo de Rappaport-Vassiliadis modificado) es un medio de cultivo selectivo utilizado
para el enriquecimiento de Salmonella en aguas y alimentos.
2. Principios:
El medio está formulado basándose en cinco características diferenciales de Salmonella res-
pecto a otras enterobacterias:

Capacidad de resistir altas presiones osmóticas.

Capacidad de multiplicación a pH relativamente bajos.

Son relativamente más resistentes a la presencia del verde de malaquita.

Tienen relativamente menos requerimientos nutricionales.

La temperatura de incubación es un factor selectivo.
3. Preparación:
• Calentar suavemente hasta conseguir una completa disolución.
Peptona de soja ......................................................................................................... 4,5
Cloruro sódico .......................................................................................................... 7,2
Dihidrogenofosfato de potasio .................................................................................. 1,26
Fosfato dipotásico ..................................................................................................... 0,18
Cloruro de magnesio anhidro ................................................................................... 13,58
Verde de malaquita ................................................................................................... 0,036

| Control macroscópico: Caldo translúcido de color azul-verdoso.
| pH a 25°C: 5,2 ± 0,2.
Salmonella Typhimurium Bueno
6. Conservación:

PNT - ME - 031
DEL CALDO SELENITO-CISTINA (SC)
SC (Caldo Selenito-Cistina) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el enriqueci-
miento de Salmonella en aguas y alimentos.
2. Principios:
El selenito sódico inhibe el crecimiento de bacterias intestinales, coliformes y enterococos,
principalmente en las primeras 6-12 h siguientes al inicio de la incubación. Después, el efec-
to inhibidor disminuye lentamente. Así, Salmonella, Proteus y Pseudomonas no son inhi-
bidos.
La cistina mejora sensiblemete el crecimiento de Salmonella.
3. Preparación:
• Disolver 23 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min.
• Repartir 90 mL de medio en frascos estériles de 250 mL o 18 mL en tubos de 18 × 180 mm.
• NO AUTOCLAVAR.
• Enfriar rápidamente en un baño de agua.
NOTA: Al calentar el medio, evitar respirar los vapores, pues son altamente tóxicos.
Polipeptona ................................................................................................................. 5
Lactosa ........................................................................................................................ 4
Fosfato monosódico .................................................................................................... 10
Selenito sódico ............................................................................................................ 4
Cistina ......................................................................................................................... 0,01

| Control macroscópico: Caldo de color ámbar-anaranjado.
| pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.
| Control de esterilidad
Escherichia coli Regular
Staphylococcus aureus Malo/Nulo
6. Conservación:
| Frascos ............................................................... 1 semana a 4°C, resguardados de la luz.
| Tubos con sero-tapón ........................................ 1 semana a 4°C, resguardados de la luz.

PNT - ME - 032
DEL AGAR ROJO FENOL Y VERDE BRILLANTE (BGA)
BGA (Agar Rojo Fenol y Verde Brillante) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el
aislamiento de Salmonella en aguas y alimentos.
2. Principios:
El medio de cultivo tiene una fuerte concentración de verde brillante, de manera que inhibe
notablemente el crecimiento de la mayoría de microorganismos, excepto Salmonella.
La presencia de lactosa y sacarosa permite una buena diferenciación de Salmonella, que da
colonias rosadas con un anillo rojo, frente al resto de flora acompañante, que forma colonias
más pequeñas de color verde-amarillo, debido a la acidificación producida por la fermenta-
ción de la lactosa y/o de la sacarosa.
3. Preparación:
• NO AUTOCLAVAR.
Triptona .................................................................................................................... 10
Lactosa ...................................................................................................................... 10
Sacarosa .................................................................................................................... 10
Fosfato disódico ........................................................................................................ 1
Fosfato monosódico .................................................................................................. 0,6
Rojo fenol ................................................................................................................. 0,09
Verde brillante .......................................................................................................... 0,005
| Control macroscópico: Medio sólido de color rojo.
| pH a 25°C: 6,9 ( 0,2
Color Color
colonias anillo
Escherichia coli Moderado Amarilo Amarillo
Salmonella Enteritidis Bueno Rosa Rojo
6. Conservación:
| Placas .................................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 033
DEL MEDIO HEKTOEN (HK)
HK (HEKTOEN) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de entero-
bacterias patógenas, principalmente Shigella y Salmonella.
2. Principios:
El medio tiene un elevado valor nutritivo, y las sales biliares que contiene inhiben el creci-
miento de la flora Gram positiva y algunos Gram negativos.
Los indicadores azul de bromotimol y fucsina ácida permiten la diferenciación de las bac-
terias lactosa positivo (de color amarillo-naranja) de las lactosa negativo (de color azul-ver-
doso).
La presencia de tiosulfato sódico permite la producción de SH2, que al combinarse con ci-
trato férrico forma un compuesto negro en el centro de las colonias.
3. Preparación:
• NO AUTOCLAVAR.
• Dejar secar la superficie del medio en cabina para evitar posteriores expansiones de
Proteus.
Hidrolizado de carne ................................................................................................. 12
Sales biliares ............................................................................................................. 9
Lactosa ...................................................................................................................... 12
Sacarosa .................................................................................................................... 12
Salicina ..................................................................................................................... 2
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Tiosulfato sódico ...................................................................................................... 5
Citrato férrico amoniacal .......................................................................................... 1,5
Azul de bromotimol .................................................................................................. 0,065
Fucsina ácida ............................................................................................................ 0,040

| Control macroscópico: Medio sólido de color verde oscuro, opalescente.
| pH a 25°C: 7,6 ± 0,2.
Microorganismo Crecimiento Color colonias Color anillo

Shigella flexneri Muy bueno Verde No hay
Salmonella Enteritidis Muy bueno Verde con centro negro No hay
Escherichia coli Bueno Amarillo-naranja Salmón
6. Conservación:
| Placas ............................................................................................ 1 semana a 2°C-8°C.

PNT - ME - 034
DEL AGAR KLIGLER
KLIGLER es un medio de cultivo diferencial utilizado principalmente para la identificación
de Enterobacteriaceae mediante la detección de la fermentación de la glucosa y de la lacto-
sa, así como de la producción de gas y ácido sulfhídrico.
2. Principios:
La fermentación de la glucosa se manifiesta por la producción de ácido, de manera que el in-
dicador vira de rojo a amarillo, aunque en la superficie vuelve el color rojo debido a que,
como hay poco azúcar, la producción de ácido es muy limitada y se produce una alcalini-
zación por oxidación.
En cambio, cuando fermenta la lactosa, la abundante producción de ácido impide la reoxi-
dación, y el medio permanece de color amarillo en la parte inclinada del tubo.
La producción de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato se manifiesta por el ennegreci-
miento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro en presencia de citrato férrico.
3. Preparación:
• Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Dejar solidificar en posición inclinada con una pendiente corta y fondo abundante (ambos
de ± 3 cm).
Triptona .................................................................................................................... 20
Glucosa ..................................................................................................................... 1
Lactosa ...................................................................................................................... 10
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Tiosulfato sódico ...................................................................................................... 0,5
Citrato férrico ........................................................................................................... 0,5
Rojo fenol ................................................................................................................. 0,025
| Control macroscópico: Medio sólido de color rojo-marrón.
| pH a 25°C: 7,4 ± 0,2.
Microorganismo Crecimiento Pendiente Fondo Gas SH2

Shigella flexneri Bueno Roja Amarillo – –
Citrobacter freundii Bueno Amarilla Amarillo + +
6. Conservación:

PNT - ME - 035
DEL AGAR NUTRITIVO SEMISÓLIDO (ANS)
ANS (Agar Nutritivo Semisólido) es un medio de cultivo utilizado para el crecimiento y/o
recuento de microorganismos poco exigentes.
2. Principios:
3. Preparación:
• Llevar a ebullición y mantener durante 1-2 min, hasta conseguir una completa disolución.
• Esterilizar en el autoclave a 120°C durante 15 min.
• Repartir asépticamente en placas.
Triptona ......................................................................................................................... 10
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Agar bacteriológico ....................................................................................................... 7,5

| Control macroscópico: Medio semisólido de color ámbar, ligeramente opalescente.
| pH a 25°C: 7,1 ± 0,2.
6. Conservación:
| Placas .............................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 036
DEL CALDO FRASER SEMI (FS)
FS (Fraser Semi) es un medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Lis-
teria monocytogenes en alimentos.
2. Principios:
Listeria hidroliza la esculina del medio en glucosa y esculetina, que forma un complejo de
color negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.
La elevada concentración de cloruro sódico del medio incrementa su selectividad, mientras
que el cloruro de litio inhibe el crecimiento de la mayoría de cocos entéricos que también
pueden hidrolizar la esculina. Asimismo, la acriflavina inhibe el crecimiento de otros mi-
croorganismos Gram positivos.
El ácido nalixídico bloquea la replicación del ADN de las bacterias sensibles a este agente
antibacteriano.
3. Preparación:
• En el momento de utilizar, enfriar el medio a 25°C ± 2°C y añadir 2,25 mL de SUPLE-
MENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI (PNT-RE-014).
Polipeptona ................................................................................................................. 10
Extracto de levadura ................................................................................................... 5
Extracto de carne ........................................................................................................ 5
Cloruro sódico ............................................................................................................. 20
Fosfato disódico anhidro ............................................................................................ 9,6
Esculina ...................................................................................................................... 1
Cloruro de litio ............................................................................................................ 3
| Control macroscópico: Caldo de color ámbar, homogéneo.
| pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.
6. Conservación:
| Frascos con medio completo ........................................................ 1 semana a 2°C-8°C,
resguardados de la luz.

PNT - ME - 037
DEL CALDO FRASER COMPLETO (FC)
FC (Fraser Completo) es un medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de
Listeria monocytogenes en alimentos.
2. Principios:
Listeria hidroliza la esculina del medio en glucosa y esculetina, que forma un complejo de
color negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.
La elevada concentración de cloruro sódico del medio incrementa su selectividad, mientras
que el cloruro de litio inhibe el crecimiento de la mayoría de cocos entéricos que también
pueden hidrolizar la esculina. Asimismo, la acriflavina inhibe el crecimiento de otros mi-
croorganismos Gram positivos.
El ácido nalixídico bloquea la replicación del ADN de las bacterias sensibles a este agente
antibacteriano.
3. Preparación:
• En el momento de utilizar, enfriar el medio a 25°C ± 2°C y añadir a cada tubo 0,1 mL de
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER COMPLETO (PNT-RE-015).
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mL.
Polipeptona ................................................................................................................. 10
Cloruro sódico ............................................................................................................ 20
Fosfato disódico anhidro ............................................................................................ 9,6
Esculina ...................................................................................................................... 1
Cloruro de litio ............................................................................................................ 3
| Control macroscópico: Caldo de color ámbar, homogéneo.
| pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.
6. Conservación:
| Frascos con medio completo ........................................................ 1 semana a 2°C-8°C,
resguardados de la luz.

PNT - ME - 038
DEL AGAR OXFORD
OXFORD es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de Listeria mo-
nocytogenes en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de Listeria, extracto de levadura,
que es una fuente de vitamina B y almidón, que es la fuente de energía para el desarrollo mi-
crobiano.
La concentración de cloruro sódico del medio mantiene su equilibrio osmótico.
Listeria es capaz de hidrolizar la esculina en glucosa y esculetina, que forma un compuesto
negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.
3. Preparación:
• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco 1 mL de SU-
PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD (PNT-RE-016).
Polipeptona .................................................................................................................... 20
Almidón ........................................................................................................................ 1
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Esculina ......................................................................................................................... 1
Citrato férrico amoniacal .............................................................................................. 0,5
Cloruro de litio .............................................................................................................. 15
| Control macroscópico: Medio sólido de color amarillo verdoso, con reflejos azulados, li-
geramente opalescente.
| pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.

Listeria monocytogenes Bueno/Muy bueno Verde oliva, rodeadas de un halo negro
Enterococcus faecalis Débil/Nulo
6. Conservación:
| Frascos con medio base ................................................................. 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas con medio completo ........................................................... 1 semana a 2°C-8°C,
resguardadas de la luz.

PNT - ME - 039
DEL AGAR PALCAM
PALCAM es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de Listeria mo-
nocytogenes en alimentos.
2. Principios:
La acción combinada de la ceftazidima y el cloruro de litio hace que el medio sea muy se-
lectivo.
La fermentación del manitol por parte de las bacterias contaminantes hace que el rojo fenol
se vuelva amarillo.
El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de Listeria, extracto de levadura,
que es una fuente de vitamina B, glucosa y almidón, que son la fuente de energía para el de-
sarrollo microbiano.
La concentración de cloruro sódico del medio mantiene el equilibrio osmótico.
Listeria es capaz de hidrolizar la esculina en glucosa y esculetina, que forma un compuesto
negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.
3. Preparación:
• Enfriar y mantener en un baño a 45°C - 48°C.
PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM (PNT-RE-017).
Polipeptona ................................................................................................................. 20
Glucosa ....................................................................................................................... 0,5
Almidón ...................................................................................................................... 1
Cloruro sódico ............................................................................................................ 5
Esculina ...................................................................................................................... 0,8
Citrato férrico amoniacal ............................................................................................ 0,5
Cloruro de litio ............................................................................................................ 15
Manitol ........................................................................................................................ 10
Rojo fenol ................................................................................................................... 0,08
Agar bacteriológico .................................................................................................... 13

| Control macroscópico: Medio sólido de color rojo, ligeramente opalescente.
| pH a 25°C: 7,1 ± 0,2.

Listeria monocytogenes Bueno/Muy bueno Verde oliva, rodeadas de un halo negro
6. Conservación:
| Frascos con medio base ................................................................. 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas con medio completo ........................................................... 1 semana a 2°C-8°C,

PNT - ME - 040
TRIPTONA DE SOJA-EXTRACTO DE LEVADURA (TSYEA)
TSYEA (Agar Triptona de Soja-Extracto de Levadura) es un medio de cultivo utilizado para
el crecimiento y/o recuento de una gran variedad de microorganismos exigentes.
2. Principios:
3. Preparación:
• Disolver los componentes en 1 L de agua destilada.
Triptona ......................................................................................................................... 17
Peptona de soja .............................................................................................................. 3
Glucosa .......................................................................................................................... 2,5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5

| Control macroscópico: Medio sólido de color ámbar.
| pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.
Streptococcus pyogenes Bueno
6. Conservación:
| Placas .............................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 041 CALDO PARA LA UTILIZACIÓN DE LOS GLÚCIDOS
(RAMNOSA Y XILOSA)
El CALDO PARA LA UTILIZACIÓN DE LOS GLÚCIDOS (RAMNOSA Y XILOSA) es
un medio de cultivo utilizado para observar si el microorganismo estudiado es capaz de fer-
mentar estos glúcidos.
2. Principios:
La fermentación de la ramnosa y la xilosa provoca la acidificación del medio, de manera que
el indicador (púrpura de bromocresol) hará que el color pase de púrpura a amarillo al dis-
minuir el pH.
3. Preparación:
• Repartir 4,5 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• En el momento de utilizar, añadir asépticamente a cada tubo (según la solución que pre-
paremos):
| 0,5 mL de SOLUCIÓN DE RAMNOSA, o
| 0,5 mL de SOLUCIÓN DE XILOSA.

NOTA: Las soluciones de glúcidos se preparan disolviendo 5 g de L-ramnosa o 5 g de D-
xilosa en 100 mL de agua destilada. Esterilizar por filtración.
Peptona ....................................................................................................................... 10
Cloruro sódico ............................................................................................................ 5
Púrpura de bromocresol .............................................................................................. 0,02
| Control macroscópico: Medio sólido de color púrpura.
| pH a 25°C: 6,8 ± 0,2.
Color medio Color medio

Microorganismo
ramnosa xilosa
Listeria monocytogenes Amarillo Violeta
Listeria ivanovii Violeta Amarillo
6. Conservación:
| Tubos de medio base con tapón de rosca ....................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos de medio base con sero-tapón ............................................. 1 mes a 2°C-8°C.
| Tubos de medio completo con tapón de rosca ............................... 3 meses a 2°C-8°C.
| Tubos de medio completo con sero-tapón ...................................... 1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 042
DEL CALDO DE PARK Y SANDERS
El CALDO DE PARK Y SANDERS es un medio de cultivo utilizado para el enriqueci-
miento selectivo de Campylobacter en alimentos.
2. Principios:
El elevado contenido de compuestos nutritivos de este medio favorece el rápido crecimien-
to de los microorganismos, manteniendo además sus características de antigenidad, viru-
lencia y toxicidad.
3. Preparación:
• Disolver los ingredientes en 945 mL de agua destilada.
• En el momento de utilizar, añadir asépticamente a cada frasco:
| 50 mL de SANGRE DE CABALLO DESFIBRINADA.
| 5 mL de SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «A» (PNT-RE-018).
4. Composición en g/945mL:
Triptona ...................................................................................................................... 10
Peptona de carne ......................................................................................................... 10
Glucosa ....................................................................................................................... 1
Citrato sódico .............................................................................................................. 1
Cloruro sódico ............................................................................................................ 5
Hidrogenosulfito sódico ............................................................................................. 0,1
Piruvato sódico ........................................................................................................... 0,25

| Control macroscópico: Caldo de color ámbar, ligeramente opalescente.
| pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.
Campylobacter sp. Bueno
6. Conservación:

PNT - ME - 043
DEL AGAR KARMALI (AK)
AK (Agar de Karmali) es un medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Campylo-
bacter en alimentos, después de un enriquecimiento previo.
2. Principios:
El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de colonias de Campylobacter,
extracto de levadura, que es una fuente de vitamina B y almidón, que es la fuente de energía
para el desarrollo microbiano.
La concentración de cloruro sódico del medio mantiene su equilibrio osmótico, mientras que
la cicloheximida previene el desarrollo de levaduras.
El carbón activo, piruvato sódico y hematina favorecen el crecimiento y la aerotolerancia de
Campylobacter.
3. Preparación:
PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR DE KARMALI (PNT-RE-020).
Polipeptona ............................................................................................................... 3
Almidón .................................................................................................................... 1
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Piruvato sódico ......................................................................................................... 0,1
Carbón activo ............................................................................................................ 4
Hematina ................................................................................................................... 0,032
Cicloheximida ........................................................................................................... 0,1

| Control macroscópico: Medio sólido de color negro.
| pH a 25°C: 7,4 ± 0,2.
Campylobacter jejuni Bueno/Muy bueno
Campylobacter coli Bueno
6. Conservación:
| Frascos con medio base ............................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas con medio completo .......................................................... 1 semana a 2°C-8°C,

PNT - ME - 044
DEL AGAR BUTZLER MODIFICADO
El AGAR BUTZER MODIFICADO es un medio de cultivo selectivo utilizado para el ais-
lamiento de Campylobacter en alimentos, después de un enriquecimiento previo.
2. Principios:
El medio contiene elementos adecuados para el crecimiento de colonias de Campylobacter.
3. Preparación:
• Fundir el medio base AGAR DE SANGRE COLUMBIA (PNT-ME-046) en un baño a
45°C - 48°C.
• Añadir el SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER (PNT-RE-021).
• En el momento de utilizar, secar las placas, en una cabina, hasta que la superficie esté li-
bre de humedad.
Ver PNT-ME-053.

| pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.
Campylobacter jejuni Bueno/Muy bueno
Campylobacter coli Bueno
6. Conservación:
| Frascos con medio base ............................................................. 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas con medio completo, sin secar ....................................... 4 horas a T ambiente o
3 días a 2°C-8°C.

PNT - ME - 045
DEL CALDO DE BRUCELLA (CB)
CB (Caldo de Brucella) es un medio de cultivo no selectivo para microorganismos exigen-
tes.
2. Principios:
El medio tiene un elevado poder nutritivo.
El bisulfito sódico actúa como agente reductor.
3. Preparación:
• Repartir en frascos o tubos, según uso.
Triptona ......................................................................................................................... 10
Peptona de carne ........................................................................................................... 10
Glucosa .......................................................................................................................... 1
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Bisulfito sódico ............................................................................................................. 0,1

| Control macroscópico: Caldo transparente de color ámbar, sin precipitado.
| pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.
Brucella abortus* Bueno/Muy bueno
Campylobacter jejuni Bueno
* Incubar en CO2.
6. Conservación:
| Frascos con medio base .................................................................. 6 meses a 2°C-8°C.

PNT - ME - 046
DEL AGAR DE SANGRE COLUMBIA
AGAR DE SANGRE COLUMBIA es un medio de cultivo altamente nutritivo utilizado para
el aislamiento de una gran variedad de microorganismos exigentes.
2. Principios:
El medio contiene peptona, que favorece el crecimiento de las colonias y extracto de leva-
dura, que es una fuente de vitamina B.
El almidón, además de proporcionar energía, actúa como agente desintoxicante.
La adición de sangre de cordero desfibrinada favorece la detección de reacciones hemolíti-
cas y suministra el factor X necesario para el crecimiento de un gran número de bacterias.
3. Preparación:
• En el momento de utilizar, añadir asépticamente 5 mL de SANGRE DE CORDERO
ESTÉRIL.
bre de humedad.
Polipetona ................................................................................................................... 17
Peptona pancreática .................................................................................................... 3
Almidón de maíz ........................................................................................................ 1
Cloruro sódico ............................................................................................................ 5
Agar bacteriológico .................................................................................................... 13,5
| Control macroscópico: Medio sólido opaco de color rojo.
| pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.
Microorganismo Crecimiento Tipo de hemólisis

Streptococcus pyogenes Bueno/Muy bueno Beta
Staphylococcus aureus Muy bueno Beta/Gamma
6. Conservación:
1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 047
DEL AGAR DE SANGRE MUELLER-HINTON
AGAR DE SANGRE MUELLER-HINTON es un medio de cultivo utilizado para el estudio
de la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos y sulfamidas.
2. Principios:
Este medio se utiliza junto a unos discos de papel impregnados con antibióticos. Al situar los
discos en el agar, estos absorben una cantidad de agua suficiente para disolver el antibiótico,
que se difunde en el medio.
De esta forma de crea un gradiente de concentración de antibiótico alrededor del disco,
mientras que las bacterias inoculadas se van multiplicando hasta que encuentran una zona
con una cantidad inhibitoria de antibiótico.
3. Preparación:
• Añadir 5 mL de SANGRE DE CORDERO ESTÉRIL.
• Mezclar suavemente.
• Repartir asépticamente el medio en placas Petri estériles formando una capa de unos 4 mm
de grosor.
bre de humedad.
Hidrolizado de caseína ................................................................................................ 17,5
Infusión de carne ........................................................................................................ 2
Almidón soluble ......................................................................................................... 1,5
Agar bacteriológico .................................................................................................... 17

| pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.
Streptococcus pyogenes Bueno/Muy bueno
6. Conservación:
1 mes a 2°C-8°C.

PNT - ME - 048
AGAR CITRATO DE HIERRO TRES AZÚCARES (TSI)
TSI (Agar Citrato de Hierro Tres Azúcares) es un medio de cultivo utilizado para la identi-
ficación de enterobacterias.
2. Principios:
La fermentación de los azúcares contenidos en el medio (glucosa, lactosa y sacarosa) pro-
duce una acidificación que hace que éste pase de rojo a amarillo.
Las bacterias que fermentan únicamente la glucosa se detectan al volver el medio rápida-
mente a su coloración inicial en la parte superior del tubo. Aquéllas que no fermentan nin-
guno de los tres azúcares no harán cambiar el color del medio.
La producción de ácido sulfhídrico se observa por la presencia de deposiciones negras de
sulfuro de hierro en el fondo del tubo producidas por la reacción del tiosulfato en presencia
del citrato férrico.
Asimismo, la producción de gas en la fermentación se detecta por la aparición de burbujas o
la rotura del agar.
3. Preparación:
• Repartir 5-6 mL en tubos de 16 × 160 mm.
• Inclinar los tubos para obtener un fondo y una pendiente de ±3 cm de profundidad.
Peptona ..................................................................................................................... 14
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Lactosa ...................................................................................................................... 10
Sacarosa .................................................................................................................... 10
Glucosa ..................................................................................................................... 1
Citrato férrico ........................................................................................................... 0,3
Tiosulfato sódico ...................................................................................................... 0,3
Rojo fenol ................................................................................................................. 0,024

| Control macroscópico: Medio sólido de color rojizo.
| pH a 25°C: 7,4 ± 0,2.
Microorganismo Crecimiento Pendiente Fondo Gas SH2

Shigella flexneri Bueno Roja Amarillo – –
Citrobacter freundii Bueno Amarilla Amarillo + +
6. Conservación:
| Tubos sin inclinar ......................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos inclinados ........................................................................... 1 semana a 2°C-8°C.

PNT - ME - 049
DEL CALDO TRIPTONA DE SOJA (TSB)
TSB (Caldo Triptona de Soja) es un medio de cultivo nutritivo universal utilizado para el
crecimiento y recuperación de microorganismos exigentes (aerobios o anaerobios).
2. Principios:
La composición del medio permite el crecimiento satisfactorio de una amplia variedad de
microorganismos.
El cloruro sódico mantiene el equilibrio osmótico, mientras que el fosfato dipotásico man-
tiene el pH.
3. Preparación:
• Disolver 30 gr de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
Triptona ......................................................................................................................... 17
Peptona de soja .............................................................................................................. 3
Glucosa .......................................................................................................................... 2,5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Fosfato dipotásico ......................................................................................................... 2,5

| Control macroscópico: Caldo de color ámbar, translúcido.
| pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.
6. Conservación:
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
CAPÍTULO SÉPTIMO
Procedimiento general de preparación

de reactivos (PNT - RE - 001)
PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN
PNT - RE - 001
DE REACTIVOS
1. OBJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la preparación de los re-
activos necesarios para realizar los análisis de alimentos y aguas.
Se aplica a todos los reactivos que se preparan en la Unidad de Microbiología, y se utilizan en los
ensayos que se realizan en este laboratorio.
3. REFERENCIAS
• ISO 7218 (1996): Microbiología de alimentos. Reglas generales para los exámenes mi-
crobiológicos.
4. PROCEDIMIENTO
Se redactará un PNT para cada uno de los reactivos necesarios para realizar los ensayos de este
laboratorio; en él se darán instrucciones de trabajo para facilitar y agilizar su preparación.
Estos procedimientos se denominan PNT - RE y constan de los siguientes apartados:
0. Carátula.
1. Finalidad de uso.
2. Principios.
3. Preparación.
4. Composición.
5. Controles del reactivo preparado.
6. Conservación.
7. Medios utilizados.
4.1. Carátula
En la carátula deberemos indicar:
• Nombre del reactivo que se va a preparar, según su denominación en el método o el

PNT - AL en el que se utiliza. Si el producto puede ser empleado con distinta concentra-
ción, ésta deberá constar en el título.
• Tipo y número del PNT: PNT - RE - seguido por un número de tres cifras. Los procedi-
mientos se han numerado según el orden en el que aparecen en los PNT - ME.
209
4.2. Finalidad de uso
La finalidad de uso explica la utilidad del reactivo en el ensayo en el que se utiliza.
4.3. Principios
En este apartado se explica, de manera resumida, el modo de acción del reactivo.
4.4. Preparación
Se indica, de forma clara y concisa, cada uno de los pasos a seguir para preparar el reactivo, in-
dicando la cantidad de los ingredientes necesarios, el tipo, volumen y calidad del diluyente uti-
lizado, el modo de disolverlos y, en caso necesario, el modo de esterilización (tiempo y tempe-
ratura si se esteriliza con autoclave o tipo de membrana si la esterilización es por filtración).
NOTA 1: Es frecuente que los ingredientes del reactivo se presenten en viales cuyo conte-
nido es una mezcla de las cantidades necesarias de los componentes. En este caso, sólo se in-
dicará el volumen de diluyente necesario para reconstituirlo. Estas presentaciones y recons-
tituciones dependen de las marcas comerciales. Siempre habrá que cumplir las indicaciones
del proveedor.
4.5. Composición
Este apartado es una lista de cada uno de los ingredientes, indicando su nombre, calidad (si es ne-
cesario) y cantidad exacta. Incluiremos también la cantidad y calidad de los diluyentes, excepto
cuando la preparación se realiza a partir de un vial a reconstituir.
NOTA 2: Esta lista está elaborada a partir de las instrucciones del fabricante del medio uti-
lizado en el laboratorio en el que se han redactado los PNT, de manera que se tendrá que
adaptar, en cada caso, a las instrucciones del proveedor.
4.6. Controles del reactivo preparado
Estos controles (detallados en el PNT-RE-002) se realizan para confirmar la calidad del reactivo
y constan de dos pruebas:
• Control macroscópico (examen visual).

• Control microscópico (examen analítico), formado por un control de esterilidad y otro de
eficacia. Estos controles no se hacen en todos los productos y su realización dependerá del
tipo de reactivo.
Cuando son reactivos preparados por casas comerciales o suplementos de medios de cultivo,
se asume que estos han sido controlados por el proveedor.
4.7. Conservación
Indicar las condiciones de tiempo y temperatura necesarias para la conservación del producto en
condiciones óptimas, de manera que su finalidad no se vea alterada.
PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS (PNT - RE - 001) 211
En aquellos reactivos que se puedan alterar con la luz o la humedad, deberán indicarse estas
condiciones particulares de almacenamiento.
NOTA 3: Cuando se indica que el reactivo debe utilizarse inmediatamente, se permite que
el producto se pueda emplear durante un periodo de 5 horas después de su preparación.
4.8. Medios utilizados
En este apartado se señalan los medios o reacciones bioquímicas en los que se emplea el reacti-
vo, indicando la cantidad y el momento en que se añade.
CAPÍTULO OCTAVO
Procedimiento general de control

de calidad de reactivos (PNT - RE - 002)
PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL
PNT - RE - 002
DE CALIDAD DE REACTIVOS
1. OBJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la realización de los con-
troles de reactivos.
Se aplica a todos los reactivos que se preparan en la Unidad de Microbiología y se utilizan en los
ensayos que se realizan en este laboratorio.
3. REFERENCIAS
• ISO 7218 (1996): Microbiología de alimentos. Reglas generales para los exámenes mi-
crobiológicos.
4. PROCEDIMIENTO
Los reactivos utilizados en los ensayos del laboratorio deben pasar unos controles, que se espe-
cifican en el apartado 5 de su PNT - RE correspondiente. Estos controles se adaptan según el tipo
de reactivo y su finalidad de uso.
En general se realiza:
• Un control macroscópico.
• Un control de esterilidad.
• Un control de eficacia.
En algunos reactivos se han de hacer controles periódicos, tal como se indica en su PNT - RE
correspondiente, para asegurar que no pierden calidad durante su almacenamiento.
4.1. Control macroscópico
El control macroscópico es un examen visual que se realiza en todos los casos para poder des-
cartar cualquier error importante en la preparación del reactivo. Se observa si su consistencia (en
general líquida), su color y su aspecto (transparente, opalescente, con o sin precipitado...) co-
rresponden con los que se indican en el PNT.
4.2. Control de esterilidad
Este control se efectúa en aquellos productos que, por su composición, son susceptibles de
contaminarse, cosa que les haría inadecuados para su finalidad.
215
El control de esterilidad debe realizarse en cabina de flujo laminar, utilizando un medio de

cultivo para microorganismos aerobios (en general TSB) y otro para anaerobios (en general TIO).
Ambos medios se especifican en el PNT - RE correspondiente.
La operación consiste en introducir en los medios correspondientes una pequeña cantidad de
reactivo, en general 1 mL. En el medio TIO, sembrar en el fondo del tubo, evitando introducir
aire.
Después de incubar a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 2 h, se observa si hay turbidez o cambio en
el color.
NOTA 1: Antes de utilizar, el medio TIO se ha de regenerar, desoxigenándolo durante

10 minutos en un baño con agua hirviendo.
NOTA 2: En caso de duda, se realiza un subcultivo, sembrando con asa en TSYEA a

partir del medio TSB y en TSYEA y TSC sin cicloserina a partir del medio TIO. Incubar
a 30°C ± 1°C durante 48 h ± 2 h (cuando se siembra a partir del medio TIO, incubar en
anaerobiosis).
4.3. Control de eficacia
Este control se realiza para comprobar la eficacia del reactivo. Sin embargo, el control se efectúa
únicamente en aquellos productos que se elaboran en el mismo laboratorio, pues se supone
que las preparaciones comerciales garantizan su eficacia. Así pues, en PNT - RE correspondiente
indicará si se debe realizar el control de eficacia, señalando, en este caso, las cepas y el medio
que se han de utilizar.
En ciertos reactivos, como el ONPG y la FA, se hace un control con cepas positivas, otro con
cepas que dan un resultado negativo y un control sin sembrar. En otros casos el control se reali-
za después de la inclusión del producto en el medio de cultivo, como sucede con la yema de hue-
vo, los antibióticos y los suplementos, o se utilizan como reveladores de reacciones bioquímicas,
combinándose con los medios de cultivo u otros substratos.
CAPÍTULO NOVENO
Procedimientos de preparación
de reactivos
RELACIÓN DE REACTIVOS Y MEDIO AL QUE SE AÑADEN
MEDIO AL
PNT-RE REACTIVOS QUE SE PNT-ME
AÑADE
003 SUPLEMENTO ANTIMICROBIANO DE GENTAMICINA CGA 006
004 SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO BP/MYPA 019/022
005 TELURITO POTÁSICO AL 1% BP 019
006 SULFAMETAZINA AL 0,2% BP 019
007 SULFATO DE POLIMIXINA B AL 4% MYPA 022
008 ROJO DE METILO MR-VP 023
009 SOLUCIÓN DE α-NAFTOL MR-VP 023
010 SOLUCIÓN DE KOH AL 40% MR-VP 023
011 REACTIVO DE NITRATOS MN 024
012 METABISULFITO SÓDICO AL 1,2% LS 029
013 CITRATO FÉRRICO AMONIACAL AL 1% LS 029
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER

014 FC 036
SEMI
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER

015 FC 037
COMPLETO
016 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD OXFORD 038
017 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM PALCAM 039
SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «A» PARA EL CALDO PARK Y

018 042
DE PARK Y SANDERS SANDERS
SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «B» PARA EL CALDO PARK Y

019 042
DE PARK Y SANDERS SANDERS
020 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR KARMALI AK 043
021 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER BUTZLER 044
022 REACTIVO DE KOVACS 017
023 SOLUCIÓN SALINA SS
REACTIVO PARA LA INVESTIGACIÓN DE LA

024 ONPG
β-GALACTOSIDASA
025 SOLUCIÓN DE FENILALANINA AL 0,5% FA
026 CLORURO FÉRRICO AL 10%
219

PNT - RE - 003
SUPLEMENTO ANTIMICROBIANO DE GENTAMICINA
GENTAMICINA es un suplemento antimicrobiano selectivo que se añade al medio CGA
para el recuento de levaduras y mohos en alimentos según el método AFNOR.
2. Principios:
Este antibiótico inhibe el crecimiento de la mayoría de bacterias, favoreciendo así el desa-
rrollo de levaduras y mohos.
3. Preparación:
• Añadir asépticamente 5 mL de agua destilada estéril al vial con el producto liofilizado.
• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.
• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.
NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re-
constitución y conservar según lo indicado en el punto 6.
4. Composición:
Sulfato de gentamicina............................................................................................... 25 mg.
5. Controles del reactivo preparado:

| Control macroscópico: Líquido incoloro.
| Control de eficacia: En CGA con levaduras y mohos.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir .......................................... A 2°C-8°C, protegidos de la luz,
hasta la fecha de caducidad.
| Vial reconstituido ............................................. 1 mes a 2°C-8°C, protegidos de la luz.
| Placas preparadas .............................................. Usar el mismo día de la preparación.
7. Medios utilizados:
| CGA (PNT-ME-006): Añadir 2 mL de suplemento a 100 mL de medio.
PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS 221

PNT - RE - 004
DE LA SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO
La SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO es un aditivo que se añade a algunos
medios para enriquecerlos y para facilitar la identificación por la acción lecitinasa.
2. Principios:
La adición de yema de huevo a medios sólidos en placa permite visualizar una zona clara al-
rededor de las colonias que poseen proteasas y a veces otro halo de precipitación por lipo-
lisis.
3. Preparación:
• Limpiar los huevos con agua y jabón.
• Aclarar, secar y rociar con alcohol, dejándolo evaporar.
• Romper la cáscara por un extremo y hacer un agujero con unas tijeras estériles.
• Aspirar la clara con una pipeta estéril de 5 mL con la punta rota.
• Transferir la yema a un frasco estéril de 250 mL.
• Diluir con agua destilada estéril en una proporción 1:4.
• Homogeneizar por agitación.
• Calentar en un baño a 45°C ± 0,5°C durante 2 h.
• Dejar sedimentar en nevera durante 18 h - 24 h.
• Separar el sobrenadante de forma aséptica y trasvasarlo a un recipiente estéril.
4. Composición:
Yema de huevo ................................................................................... 1 unidad (≅ 20 mL).
Agua destilada .................................................................................... 80 mL.

| Control macroscópico: Solución líquida de color amarillo anaranjado.
| Control de esterilidad: En TSB y TIO.
| Control de eficacia: En BP con Staphylococcus aureus o en MYPA con Bacillus cereus.
6. Conservación:
A 4°C, realizando controles de esterilidad periódicamente y antes de cada uso.
| BP (PNT-ME-019): Añadir 10 mL de suplemento a 190 mL de medio, en el momento de
preparar las placas.
| MYPA (PNT-ME-022): Añadir 20 mL de suplemento a 180 mL de medio, en el momento
de preparar las placas.

PNT - RE - 005
DEL TELURITO POTÁSICO AL 1%
El TELURITO POTÁSICO AL 1% es un agente selectivo que se utiliza en algunos medios
para estafilococos como reactivo inhibidor y diferencial.
2. Principios:
Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos Gram negativos y de los Gram
positivos que no son capaces de reducirlo.
Hay una correlación entre la capacidad de reducción del telurito potásico a teluro y la pato-
genicidad de los estafilococos.
Los estafolococos que pueden reducir el telurito a teluro, formando colonias negras.
3. Preparación:
• Disolver 1 g de telurito potásico en 100 mL de agua destilada.
• Esterilizar por filtración con filtro de membranas de 0,45 μ de tamaño de poro.
4. Composición:
Telurito potásico ................................................................................................... 1 g.
Agua destilada ....................................................................................................... 100 mL.

| Control de eficacia: En BP con Staphylococcus aureus.
6. Conservación:
A 4°C, protegido de la luz.
| BP (PNT-ME-019): Añadir 2 mL de suplemento a 190 mL de medio, en el momento de

PNT - RE - 006
DE LA SULFAMETAZINA AL 0,2%
La SULFAMETAZINA AL 0,2% es un suplemento antimicrobiano selectivo que se añade
al medio BP para facilitar el recuento de estafilococos en alimentos.
2. Principios:
Este antibiótico limita el crecimiento de Proteus.
3. Preparación:
• Disolver cuidadosamente la sulfametazina en la disolución de hidróxido sódico, evitando
la formación de espuma.
• Añadir 90 mL de agua destilada.
• Esterilizar por filtración con filtro de membranas de 0,22 μ de tamaño de poro.
4. Composición:
Sulfametazina ......................................................................................................... 0,2 g.
Disolución de hidróxido sódico (0,1 mol/L) ........................................................... 10 mL.

6. Conservación:
| Disolución preparada ....................................................................... 1 mes a 3°C ± 2°C.
| BP (PNT-ME-019): Añadir 10 mL de disolución a 190 mL de medio, en el momento de

PNT - RE - 007
DEL SULFATO DE POLIMIXINA B AL 4%
El SULFATO DE POLIMIXINA B AL 4% es un suplemento selectivo utilizado en los me-
dios MYPA y PEMBA para el aislamiento y recuento de Bacillus cereus.
2. Principios:
Inhibe el crecimiento de la flora acompañante.
3. Preparación:
• Disolver cuidadosamente.
• Evitar la congelación.
4. Composición:
Polimixina B ...................................................................................................... 50.000 IU.

6. Conservación:
| Vial sin reconstituir ....................................... A 2°C-8°C, hasta la fecha de caducidad.
| Vial reconstituido .......................................... 1 mes a 2°C-8°C.
| MYPA (PNT-ME-022): Añadir 2 mL de suplemento a 180 mL de medio, en el momento
de preparar las placas.

PNT - RE - 008
DEL ROJO DE METILO
El ROJO DE METILO se utiliza como indicador de pH en la prueba del Rojo de Metilo de
los tests IMVIC.
2. Principios:
Las enterobacterias pueden fermentar la glucosa mediante 2 vias: la ácido-mixta y la 2,3,bu-
tanodiólica.
Así, después de la incubación en el medio predominan los productos ácidos si la vía es la
ácido-mixta, mientras que si es la 2,3,butanodiólica predominan los productos neutros.
Al añadir el indicador al medio, éste virará a rojo si el medio es ácido, mientras que cam-
biará a amarillo si no ha habido acidificación.
3. Preparación:
• Disolver 0,1 g de rojo de metilo en 300 mL de etanol absoluto.
• Añadir agua destilada hasta obtener un volumen de 500 mL.
4. Composición:
Rojo de metilo ...................................................................................................... 0,1 g.
Etanol ................................................................................................................... 300 mL.
Agua destilada ...................................................................................................... 200 mL.

| Control macroscópico: Líquido de color naranja-rojo.
| Control de eficacia: En RM-VP con Escherichia coli (positivo) y Enterobacter cloacae
(negativo).
6. Conservación:
A T ambiente.
| MR-VP (PNT-ME-023): Añadir 5 gotas de reactivo en un cultivo de unos 2-3 mL, que ha
estado incubado durante 24 h.

PNT - RE - 009
DE LA SOLUCIÓN DE α-NAFTOL
La solución de α-NAFTOL se utiliza junto con el KOH como indicador en la prueba de
Voges-Proskauer de la fermentación de la glucosa en los tests IMVIC.
2. Principios:
Las enterobacterias pueden fermentar la glucosa mediante 2 vias: la ácido-mixta y la 2,3, bu-
tanodiólica.
El α-naftol detecta los metabolitos que se forman en la vía 2,3, butanodiólica, haciendo que
la superficie del medio cambie a rojo, en condiciones aerobias.
Este viraje se manifiesta si el medio se encuentra en condiciones alcalinas; éste es el motivo
por el que añadimos también KOH.
3. Preparación:
• Disolver 5 g de α-naftol en 100 mL de etanol absoluto.
4. Composición:
α-naftol ................................................................................................................. 5 g.
Etanol .................................................................................................................... 100 mL.

| Control macroscópico: Líquido translúcido de color rosado.
| Control de eficacia: En RM-VP, junto con KOH, con Enterobacter cloacae (positivo) y
Escherichia coli (negativo).
6. Conservación:
A 4°C, resguardados de la luz, hasta que se vuelva de color marrón con precipitado.
| MR-VP (PNT-ME-023): Añadir 10 gotas de solución en un cultivo de unos 2-3 mL, que
ha estado incubado durante 24 h. Añadir el KOH y después el α-naftol; agitar y dejar re-
posar de 15 min a 2 h.
NOTA: Para acelerar el proceso, se puede:

Calentar suavemente el tubo con el medio.

Oxigenar el tubo.

Añadir cristales de creatina.


PNT - RE - 010
DE LA SOLUCIÓN DE KOH AL 40%
La solución de KOH AL 40% se utiliza junto con el α-naftol para alcalinizar el medio en la
prueba de Voges-Proskauer de la fermentación de la glucosa en los tests IMVIC.
2. Principios:
El KOH se añade al medio con la finalidad de aumentar su pH.
3. Preparación:
• Disolver 40 g de KOH en 100 mL de agua destilada.
4. Composición:
KOH ..................................................................................................................... 40 g.

| Control de eficacia: En RM-VP, junto con α-naftol, con Enterobacter cloacae (positivo)
y Escherichia coli (negativo).
6. Conservación:
A T ambiente.
| MR-VP (PNT-ME-023): Después de añadir el α-naftol, añadir 6 gotas de solución en un
cultivo de unos 2-3 mL, que ha estado incubado durante 24 h. Agitar y dejar reposar de 15
min a 2 h.
NOTA: Para acelerar el proceso, se puede:

Calentar suavemente el tubo con el medio.

Oxigenar el tubo.

Añadir cristales de creatina.


PNT - RE - 011
DEL REACTIVO DE NITRATOS
El REACTIVO DE NITRATOS se utiliza para identificar la enzima nitrato-reductasa.
2. Principios:
Los microorganismos que poseen el enzima reducen los nitratos a nitritos. Los nitritos, al
reaccionar con estos reactivos, producen un compuesto azoico de color rosa-rojo.
3. Preparación:
• Disolver 0,1 g de 5,2 ANSA en 100 mL de ácido acético (15% v/v).
• Disolver 0,4 g de ácido sulfamínico en 100 mL de ácido acético (15% v/v).
• Filtrar separadamente las dos soluciones en papel de filtro.
4. Composición:
Solución A: 5,2, ANSA ........................................................................................ 0,1 g.
Ácido acético (2,6 mol/L) ................................................................ 100 mL.
Solución B: Ácido sulfanílico .............................................................................. 0,4 g.
Ácido acético (2,6 mol/L) ................................................................ 100 mL.
5 Controles del reactivo preparado:

| Control macroscópico: Líquidos incoloros.
| Control de eficacia: En MN con Escherichia coli (positivo) y Acinetobacter sp. (negativo).
6. Conservación:
A 5°C, resguardados de la luz, mientras se conserven incoloros o rosa pálido.
| MN (PNT-ME-024): Añadir 0,2 mL de cada solución al cultivo incubado durante 24 h ±
2 h.
La reacción acostumbra a ser instantánea; si no hay cambio de color en 15 minutos, aña-
dir zinc en polvo. El zinc reduce los nitratos que quedan en el medio. Si la reacción con-
tinua siendo negativa significa que los nitratos se habían reducido directamente a N2. Una
reacción positiva con zinc indica que no había habido ningún tipo de reducción previa.
NOTA: En caso de no disponer de ANSA, utilizar:

Solución A: Ácido sulfanílico .............................................................. 0,8 g.
Ácido acético (5 mol/L) ................................................... 100 mL.
Solución B: α-naftol ............................................................................. 0,5 g.
Ácido acético (5 mol/L) ................................................... 100 mL.

PNT - RE - 012
DEL METABISULFITO SÓDICO AL 1,2%
El METABISULFITO SÓDICO AL 1,2% se utiliza como agente reductor e indicador.
2. Principios:
En el medio LS, la reducción del sulfito por parte de los clostridios en presencia del citrato
férrico da lugar a la formación de sulfuro de hierro, que forma un precipitado negro en el
fondo del tubo.
3. Preparación:
• Disolver 1,2 g de metabisulfito sódico en 100 mL de agua destilada.
• Esterilizar por filtración con filtro de membrana de 0,45 μ de tamaño de poro.
4. Composición:
Metabisulfito sódico ............................................................................................. 1,2 g.

| Control de eficacia: En LS con Clostridium perfringens.
6. Conservación:
A 4°C durante 24 h.
| LS (PNT-ME-029): Añadir 0,5 mL de reactivo en cada tubo con 10 mL de medio, en el
momento de utilizar.

PNT - RE - 013
DEL CITRATO FÉRRICO AMONIACAL AL 1%
El CITRATO FÉRRICO AMONIACAL AL 1% se utiliza como componente diferencial y
indicador.
2. Principios:
En el medio LS, la reducción del metabisulfito por parte de los clostridios en presencia del
citrato férrico da lugar a la formación de sulfuro de hierro, que forma un precipitado negro
en el fondo del tubo.
3. Preparación:
• Disolver 1 g de citrato de hierro en 100 mL de agua destilada.
4. Composición:
Citrato férrico amoniacal ...................................................................................... 1 g.

| Control macroscópico: Líquido de color ámbar.
| Control de eficacia: En LS con Clostridium perfringens.
6. Conservación:
A T ambiente durante 24 h.
| LS (PNT-ME-029): Añadir 0,5 mL de reactivo en cada tubo con 8 mL de medio, en el
momento de utilizar.
NOTA: En caso de no disponer de citrato férrico amoniacal, utilizar SULFATO DE

HIERRO.

PNT - RE - 014
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI se utiliza con el
medio para el enriquecimiento primario para la detección de Listeria monocytogenes en ali-
mentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de dos agentes antimicrobianos (el ácido nalixídico y la acri-
flavina) y un reactivo (el citrato férrico). El ácido nalixídico bloquea la replicación del
ADN de las bacterias sensibles a él, mientras que la acriflavina impide el crecimiento de bac-
terias Gram positivas.
Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así
el crecimiento de Listeria.
El citrato de hierro se utiliza para visualizar la esculetina, que es producida por Listeria a
partir de la esculina. En presencia de iones férricos, la esculetina forma precipitados negros,
que aparecen progresivamente. Asimismo, el hierro favorece el crecimiento de Listeria.
3. Preparación:
• Añadir asépticamente 5 mL de solución 1:1 de etanol y agua destilada estéril al vial con el
producto liofilizado.
4. Composición:
Ácido nalixídico ................................................................................................... 5 mg.
Clorhidrato de acriflavina .................................................................................... 6,25 mg.
Citrato de hierro (III) amoniacal .......................................................................... 250 mg.

| Control macroscópico: Líquido oscuro, que puede contener precipitado.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir ............................................ A 2°C-8°C, protegido de la luz,
| Vial reconstituido ............................................... 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.
| FRASER SEMI (PNT-ME-036): Añadir 2,25 mL de suplemento a 225 mL de medio, en-
friado a 25°C, en el momento de utilizar.

PNT - ME - 015 DEL SUPLEMENTO SELECTIVO PARA
EL CALDO FRASER COMPLETO
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER COMPLETO se utiliza
con el medio para el enriquecimiento secundario para la detección de Listeria monocytoge-
nes en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de dos agentes antimicrobianos (el ácido nalixídico y la acri-
flavina), en una concentración distinta a la del medio FRASER SEMI, y un reactivo (el ci-
trato férrico). El ácido nalixídico bloquea la replicación del ADN de las bacterias sensibles
a él, mientras que la acriflavina impide el crecimiento de bacterias Gram positivas.
El citrato de hierro se utiliza para visualizar la esculetina, que es producida por Listeria a
partir de la esculina. En presencia de iones férricos, la esculetina forma precipitados negros,
que aparecen progresivamente. Asimismo, el hierro favorece el crecimiento de Listeria.
3. Preparación:
4. Composición:
Ácido nalixídico ................................................................................................... 10 mg.
Clorhidrato de acriflavina ..................................................................................... 12,5 mg.
Citrato de hierro (III) amoniacal ........................................................................... 250 mg.

| Control macroscópico: Líquido oscuro, que puede contener precipitado.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir ............................................. A 2°C-8°C, protegido de la luz,
| Vial reconstituido ................................................ 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.
| FRASER COMPLETO (PNT-ME-037): Añadir 0,1 mL de suplemento en cada tubo con
10 mL de medio, enfriado a 25°C, en el momento de utilizar.

PNT - RE - 016
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD se utiliza para la detección y
recuento de Listeria en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de tres antibióticos (la colistina, el cefotetán y la fosfomicina),
un agente antifúngico (la cicloheximida) y un tinte antiséptico (la acriflavina).
3. Preparación:
4. Composición:
Cicloheximida ....................................................................................................... 200 mg.
Sulfato de colistina ................................................................................................ 10 mg.
Cefotetán ............................................................................................................... 1 mg.
Fosfomicina ........................................................................................................... 5 mg.
Acriflavina ............................................................................................................ 2,5 g.

| Control macroscópico: Solución fluorescente de color amarillo-verdoso.
6. Conservación:
| AGAR OXFORD (PNT-ME-038): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio, en el
momento de preparar las placas.

PNT - RE - 017
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM se utiliza con el medio
para la detección y recuento de Listeria en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de antibióticos (la polimixina y la ceftazidima) y un tinte an-
tiséptico (la acriflavina).
3. Preparación:
4. Composición:
Sulfato de polimixina B .......................................................................................... 5 mg.
Ceftazidima ............................................................................................................. 10 mg.
Acriflavina .............................................................................................................. 2,5 g.

| Control macroscópico: Solución transparente de color amarillo.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir ............................................. A 2°C-8°C, protegido de la luz,
| Vial reconstituido ................................................ 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.
| AGAR PALCAM (PNT-ME-039): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio, en el
momento de preparar las placas.

PNT - ME - 018 DE LA SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «A»
PARA EL CALDO DE PARK Y SANDERS
La SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «A» se añade al caldo de Park y Sanders para la de-
tección de Campylobacter termotolerantes en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de antibióticos (la vancomicina y el lactato de trimetoprima).
el crecimiento de Campylobacter.
3. Preparación:
• Disolver los componentes en 10 mL de solución 1:1 de etanol al 95% y agua destilada es-
téril.
4. Composición:
Vancomicina ........................................................................................................... 0,02 g.
Lactato de trimetoprima .......................................................................................... 0,02 g.
Etanol ...................................................................................................................... 5 mL.
Agua destilada ........................................................................................................ 5 mL.

| Control macroscópico: Solución transparente de color ámbar.
| Control de eficacia: En CALDO DE PARK Y SANDERS con Campylobacter sp.
6. Conservación: Utilizar inmediatamente.
| CALDO DE PARK Y SANDERS (PNT-ME-042): Añadir 10 mL de suplemento a 250 mL
de medio, en el momento de utilizar.

PNT - ME - 019 DE LA SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «B»
PARA EL CALDO DE PARK Y SANDERS
La SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «B» se añade al caldo de Park y Sanders en el enri-
quecimiento para la detección de Campylobacter termotolerantes en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de antibióticos (la vancomicina y la cicloheximida). Evita el
crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así el cre-
cimiento de Campylobacter.
3. Preparación:
• Disolver los componentes en 50 mL de solución 1:1 de acetona y agua destilada estéril.
4. Composición:
Cefoperazona ....................................................................................................... 0, 032 g.
Cicloheximida ...................................................................................................... 0,1 g.
Acetona ................................................................................................................ 25 mL.

| Control macroscópico: Solución transparente de color ámbar.
| Control de eficacia: En CALDO DE PARK Y SANDERS con Campylobacter sp.
6. Conservación: Utilizar inmediatamente.
| CALDO DE PARK Y SANDERS (PNT-ME-042): Añadir 12,5 mL de suplemento a
250 mL de medio, en el momento de utilizar.

PNT - RE - 020
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR DE KARMALI
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR DE KARMALI se utiliza con el medio
para el aislamiento selectivo de Campylobacter en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla inhibitoria compuesta por dos antibióticos (la vancomicina y la
cefoperazona). La cefoperazona amplía el espectro de acción de la vancomicina, de manera
que hay una mayor inhibición de las bacterias contaminantes.
3. Preparación:
4. Composición:
Vancomicina ............................................................................................................ 10 mg.
Cefoperazona ........................................................................................................... 16 mg.

| Control macroscópico: Solución de color blanco, ligeramente opalescente.
| Control de eficacia: En AGAR KARMALI con Campylobacter.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir .............................................. A 2°C-8°C, protegido de la luz,
hasta la fecha de caducidad
| Vial reconstituido ................................................. 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz
| AGAR KARMALI (PNT-ME-043): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio, en
el momento de preparar las placas.

PNT - RE - 021
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER se utiliza con el medio para
el aislamiento selectivo de Campylobacter en alimentos.
2. Principios:
El suplemento está formado por una mezcla de cinco agentes antimicrobianos. Esta combi-
nación permite el crecimiento de Campylobacter a 37°C, especialmente el de las cepas que
no crecen a 43°C.
La colistina del medio provoca la ruptura de las membranas celulares de las bacterias Gram
negativas, mientras que la cicloheximida inhibe el crecimiento de ciertos mohos.
3. Preparación:
4. Composición:
Bacitracina ........................................................................................................ 12.500 IU.
Sulfato de colistina ............................................................................................ 5.000 IU.
Cefazolina ......................................................................................................... 7,5 mg.
Novobiocina ...................................................................................................... 2,5 mg.
Cicloheximida ................................................................................................... 25 ml.

| Control macroscópico: Solución amarillenta, sin precipitado.
| Control de eficacia: En AGAR COLUMBIA SANGRE con Campylobacter.
6. Conservación:
| AGAR BUTZLER (PNT-ME-044): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio.

PNT - RE - 022
DEL REACTIVO DE KOVACS
El REACTIVO DE KOVACS se utiliza para la detección del indol, resultante de la degra-
dación del triptófano en el medio AT por parte de algunos microorganismos.
2. Principios:
Cuando el reactivo de Kovacs entra en contacto con el indol se desarrolla una coloración
rojo cereza característica, en forma de anillo, en la superficie del tubo (en la zona en contacto
con el oxígeno).
3. Preparación:
• Disolver 5 g de 4-dimetilamino-benzaldehído en 75 mL de alcohol isoamílico a 50°C -
55°C.
• Mantener el recipiente en un baño con agua helada.
• Añadir el ácido clorhídrico concentrado mientras se agita.
4. Composición:
Ácido 4-dimetilamino-benzaldehído ...................................................................... 5 g.
Alcohol isoamílico .................................................................................................. 75 mL.
Ácido clorhídrico 1,18-1,19 d ................................................................................. 25 mL.

| Control macroscópico: Líquido amarillo.
| Control de eficacia: Con Escherichia coli (positivo) y Salmonella Enteritidis (negativo).
| La producción de indol se inhibe por la presencia de nitritos.
6. Conservación:
A 4°C, resguardados de la luz.
| AT (PNT-ME-017): Añadir 0,5 mL de cada reactivo en cada tubo. Agitar para que el in-
dol entre en contacto con el reactivo y dejar actuar un máximo de 1 minuto.

PNT - RE - 023
DE LA SOLUCIÓN SALINA (SS)
La SOLUCIÓN SALINA (SS) se utiliza en pruebas bioquímicas y en la prueba de autoa-
glutinación para la investigación serológica de Salmonella.
2. Principios:
La solución salina es un diluyente no tóxico para los microorganismos.
3. Preparación:
• Disolver 8,5 g de cloruro sódico en 1 L de agua destilada.
4. Composición:
Cloruro sódico ........................................................................................................... 8,5 g.
Agua destilada ........................................................................................................... 1 L.

| Control de esterilidad: Incubar a 30°C durante 3 días.
| Control de eficacia: Sembrar Enterococcus y Salmonella. Si no se aprecia crecimiento
(turbidez), aislar en PCA.
6. Conservación:
3 meses a 4°C-6°C, realizando controles de esterilidad periódicamente y antes de cada
uso.
7. Utilización:
• Sero-aglutinación.
• Emulsión para API.

PNT - ME - 024 DEL REACTIVO PARA LA INVESTIGACIÓN
DE LA β-GALACTOSIDASA (ONPG)
El REACTIVO PARA LA INVESTIGACIÓN DE LA β-GALACTOSIDASA (ONPG) se
utiliza para detectar la presencia de la enzima β-galactosidasa.
2. Principios:
La β-galactosidasa es una enzima que desdobla la molécula de lactosa en galactosa y glu-
cosa. Cuando el ONPG entra en contacto con la enzima, ésta transforma el reactivo de or-
tofenil a ortofenol, que es de color amarillo.
Los microorganismos que no poseen esta enzima no pueden fermentar la lactosa.
3. Preparación:
• Disolver 80 mg de ONPG en 15 mL de agua destilada a 50°C - 55°C.
• Enfriar a T ambiente.
• Añadir 5 mL de solución tampón.
4. Composición:
ONPG ....................................................................................... 80 mg.
Solución tampón: Dihidrogenofosfato de sodio .................................................... 6,9 g.
Hidróxido sódico al 30% .......................................................... 45 mL.
Agua destilada .......................................................................... 3 mL.

| pH a 25°C (solución tampón): 7,00 ± 0,2.
| Control de eficacia: Con Escherichia coli (positivo, color amarillo) y Salmonella Enteri-
tidis (negativo, incoloro).
6. Conservación:
A 4°C, hasta que el reactivo se observe turbidez, realizando un control de esterilidad antes de
cada uso.
| SS (PNT-RE-23): Añadir 0,25 mL de cada reactivo en cada tubo. Realizar lecturas al cabo
de 1/2 h, 1 h, 2 h y 24 h.

PNT - RE - 025
DE LA SOLUCIÓN DE FENILALANINA AL 0,5% (FA)
La SOLUCIÓN DE FENILALANINA AL 0,5% (FA) se utiliza, junto con el cloruro férrico,
para detectar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa.
2. Principios:
Los microorganismos que poseen la enzima fenilalanina desaminasa pueden transformar la
fenilalanina en ácido fenilpirúvico (es decir, convertir aminoácidos en ácidos cetónicos) en
condiciones de aerobiosis.
Esta facultad se utiliza principalmente para diferenciar los géneros Salmonella y Proteus.
3. Preparación:
• Disolver 0,5 g de L-fenilalanina en 100 mL de agua destilada estéril.
• Transferir a un recipiente estéril.
4. Composición:
L-fenilalanina ........................................................................................................ 0,5 g.

| Control de eficacia: Con Proteus (positivo, color verde oscuro) y Salmonella (negativo, in-
coloro).
6. Conservación:
A 2°C-6°C, realizando controles de esterilidad periódicamente y antes de cada uso.
| SS (PNT-RE-23): Añadir 0,5 mL en cada tubo.

PNT - RE - 026
DE LA SOLUCIÓN DE CLORURO FÉRRICO AL 10%
La SOLUCIÓN DE CLORURO FÉRRICO AL 10% se utiliza, junto con la fenilalanina,
para detectar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa.
2. Principios:
Los microorganismos que poseen la enzima fenilalanina desaminasa pueden transformar, en
condiciones de aerobiosis, la fenilalanina en ácido fenilpirúvico. Este ácido, en contacto con
iones férricos, produce una coloración verde oscuro durante unos minutos.
3. Preparación:
• Disolver 10 g de cloruro férrico en 100 mL de agua destilada.
• Transferir a un frasco de 250 mL.
4. Composición:
Cloruro férrico ....................................................................................................... 10 g.

| Control macroscópico: Líquido de color crema oscuro.
| Control de eficacia: Con Proteus (positivo, color verde oscuro) y Salmonella (negativo, in-
coloro-amarillento).
6. Conservación:
A T ambiente, resguardado de la luz, realizando controles de esterilidad periódicamente y
antes de cada uso.
| SS (PNT-RE-23): Añadir 1-2 gotas de reactivo a cada tubo con 0,5 mL de SS y 0,5 mL de
FA, incubado durante 4 h a 37°C ± 1°C.
BIBLIOGRAFÍA GENERAL
BERGEY’S MANUAL (1994): Bergey’s manual of determinative bacteriology. Ninth edition.

Williams & Wilkins. USA.
CALVÍS, S. (1998): Redacción e introducción del Manual de Calidad y del Procedimiento Gene-
ral de Redacción y Gestión de la Documentación en el laboratorio de Microbiología de
aguas y Alimentos.
ENAC (1997): Guía para la acreditación de laboratorios que realizan análisis microbiológicos.
G-ENAC-04. Rev. 2.
SABATER, J.; VILUMARA, A. (1989): Buenas prácticas de laboratorio (GLP) y garantía de calidad
(Quality Assurance): Principios básicos. Ed. Díaz de Santos. Madrid.
245
NORMATIVA
• AFNOR NF V 08-050 (1992): Microbiologie alimentaire. Méthode de routine pour le dé-

nombrement des coliformes. Méthode par comptage des colonies obtenues à 30°C.
• AFNOR NF V 08-051 (1992): Microbiologie alimentaire. Méthode de routine pour le dé-
nombrement des microorganismes. Métode par comptage des colonies obtenues à 30°C.
• AFNOR NF V 08-052 (1993): Microbiologie alimentaire. Méthode de routine pour la recher-
che des Samonella.
• AFNOR NF V 08-053 (1993): Microbiologie alimentaire. Dénombrement des Escherichia coli
β-glucuronidase positive par comptage des colonies obtenues. Méthode de routine.
• AFNOR NF V 08-054 (1993): Microbiologie alimentaire. Dénombrement des Enterobacte-
riaceae par comptage des colonies. Méthode de routine.
• AFNOR NF V 08-055 (1993): Microbiologie alimentaire. Recherche de Listeria monocyto-
genes. Méthode de routine.
• AFNOR NF V 08-056 (1994): Microbiologie alimentaire. Dénombrement des Clostridium per-
fringens par comptage des colonies à 37°C.
• AFNOR NF V 08-057-1 (1994): Microbiologie alimentaire. Méthode de routine pour le dé-
nombrement des Staphylocoques à coagulase positive par comptage des colonies à 37°C.
Partie 1. Technique avec confirmation des colonies.
• AFNOR NF V 08-057-2 (1994): Microbiologie alimentaire. Méthode de routine pour le dé-
nombrement des Staphylocoques à coagulase positive par comptage des colonies à 37°C.
Partie 2. Technique sans confirmation des colonies.
• AFNOR XP V 08-058 (1995): Microbiologie alimentaire. Dénombrement de Bacillus cereus
par comptage des colonies à 30°C. Méthode de routine.
• AFNOR XP V 08-059 (1995): Microbiologie des aliments. Dénombrement des levures et moi-
sissures par comptage des colonies à 25°C. Méthode de routine.
• AFNOR XP V 08-102 (1997): Microbiologie des aliments. Règles générales pour le compta-
ge des colonies et pour l’expression des résultats. Cas du dénombrement sur milieu solide.
• EN 13401 (1999): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for enu-
meration of Clostridium perfringens. Colony-count techinique (ISO 7937:1997 modified).
• ISO 7954 (1988): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement des levures et
moisissures. Technique par comptage des colonies à 25°C.
• ISO 4831 (1991): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement des colifor-
mes. Technique du nombre le plus probable.
• ISO 4832 (1991): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement des colifor-
mes. Méthode par comptage des colonies.
• ISO 4833 (1991): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement des micro-or-
ganismes. Méthode par comptage des colonies obtenues à 30°C.
247
248 NORMATIVA
• ISO 8523 (1992): Microbiologie. Directives générales pour la recherche des Enterobacteria-
ceae avec pré-enriquissement.
• ISO 6579 (1993): Microbiologie. Directives générales concernant les méthodes de recherche
des Salmonella.
• ISO 7402 (1993): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement sans revivifica-
tion des Enterobacteriaceae. Techinque NPP el méthode par comptage des colonies.
• ISO 7251 (1994): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement d’Escherichia
coli présumés. Thecnique du nombre le plus probable.
• ISO 7932 (1994): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement de Bacillus ce-
reus. Méthode par comptage des colonies à 30°C.
• ISO 7218 (1996): Microbiologie des aliments. Règles générales pour les examens microbio-
logiques.
• ISO 10272 (1996): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for de-
tection of thermotolerant Campylobacter.
• ISO 11290-1 (1997): Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 1: Méthode de récherche.
• ISO 11290-2 (1998): Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 2: Méthode de dénombrement.
• ISO 6888-1 (1999): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal mehtod for
enumeration of coagulase positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species).
Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium.
• ISO 6888-2 (1999): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for
enumeration of coagulase positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species).
Part 1: Technique using Rabbit Plasma Fibrinogen agar medium.

Metodos de Analisis Microbiologicos de Alimentos Corrie A. Ribes M.

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INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. XIX

PROCEDIMIENTO GENERAL DE REDACCIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002) ......... 9

Tablas de resultados ........................................................................................................... 16

PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS ................ 61

PNT - AL - 003: Método horizontal para el recuento de microorganismos a 30°C (méto-

PNT - AL - 009: Método horizontal para el recuento sin revivificación de Enterobacte-

PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE

PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ............... 151

Relación de medios de cultivo y PNT - AL en el que aparecen ........................................ 153

PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS (PNT -

PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS .................................. 217

Relación de reactivos y medio al que se añaden ................................................................ 219

BIBLIOGRAFÍA GENERAL ......................................................................................... 245

NORMATIVA .................................................................................................................. 247

El presente libro va dirigido a los profesionales y estudiantes de Microbiología del sec-

sultados, en el apartado correspondiente de los PNT - AL (métodos) únicamente se ex-

Últimamente se está realizando la validación de los métodos ISO para el CEN

• Utilización de material de referencia.

Mediante las incertidumbres (material de referencia empleado, métodos y equipos,

Procedimiento general de redacción de métodos

Se aplica a todos los análisis realizados según los PNT - AL.

1. Recopilar la documentación existente (normas internacionales: ISO, EN, AFNOR,

Estos procedimientos constan de los siguientes apartados:

• Título del PNT.

5.1.1. Título del PNT

En este apartado deberá constar:

• Tipo de análisis que se realiza: recuento o investigación, especificando si se utiliza alguna

NOTA 1: Los nombres científicos de microorganismos, en latín, deben escribirse en cursi-

5.1.2. Tipo y número del PNT

NOTA 2: Este desdoblamiento se suele manifestar también en la norma original.

5.1.3. Norma en la que se basa

• Recuento de microorganismos 1: Número de microorganismos 1 encontrado por gramo o

5.3. Medios de cultivo

• Suplementos de medios de cultivo.

La denominación de estas sustancias es la que se les da en el laboratorio, aunque en algunos

• Medios de cultivo necesarios, señalando si se encuentran en tubos o en placas; en este caso

NOTA 5: En este apartado no se explica el modo operatorio de las pruebas de la oxidasa y

Debido a su extensión e importancia sobre el resultado del análisis, en algunos casos se ha

5.8. Expresión de resultados

Procedimiento de expresión de resultados

El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la expresión de resul-

Se aplica a todos los análisis realizados según los PNT - AL.

En general, para obtener el resultado de los recuentos de microorganismos en medio sólido, se

Para los métodos de rutina, la expresión utilizada es:

5.1. Caso general

• N: número de microorganismos por mililitro o por gramo.

Para el caso de recuento después de identificación:

• b: número de colonias que responden a los criterios de identificación.