11/04/2016

MPLC & FLASH CHROMATOGRAPHY Elsa Fitria Apriani

1506777133

MPLC

1
 11/04/2016

MEDIUM PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY

(MPLC)
MPLC mengatasi kekurangan
MPLC termasuk dalam dari low pressure liquid
kromatografi kolom chromatography (LPLC) yaitu
preparatif terbatasnya pemasukan
sampel

MPLC diperkenalkan pada

tahun 1970an sebagai teknik
yang efisien untuk
memisahkan senyawa
organik.

Secara garis besar, prinsip kerja antara LPLC, MPLC dan HPLC sama.
Perbedaan ketiganya didasarkan pada tekanan yang digunakan.

2
 11/04/2016

INSTRUMENTASI MPLC

Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak yang digunakan harus bersih dan inert.

Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan

gas) sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengganggu analisis.

3
 11/04/2016

Pompa

Kriteria untuk memilih pompa MPLC meliputi :

• Rentang laju alir yang digunakan
• Keberadaan peredam getaran
• Pengaturan tekanan dan gradien.
Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan dan bebas dari gangguan.
Ada 2 jenis pompa pada MPLC yaitu pompa dengan tekanan konstan dan pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan.

Tempat Injeksi Kolom

• Sampel disuntikkan secara langsung • Kolom merupakan tempat

ke dalam fase gerak yang mengalir
di bawah tekanan menuju kolom
dengan menggunakan alat
penyuntik.
terjadinya pemisahan.
• Hal-hal yang harus diperhatian
untuk mengoptimalkan pemisahan
antara lain jumlah sampel yang
akan dimurnikan, kemasan kolom,
panjang kolom dan diameter kolom.
• Peningkatan diameter kolom dapat
memungkinkan penginjeksian
sampel dalam jumlah besar, tetapi
ukuran partikel yang digunakan
harus kecil.
• Selain itu, meningkatnya panjang
kolom akan menghasilkan resolusi
yang lebih tinggi.

4
 11/04/2016

Detektor dan Rekorder Fraction Collector

• Pemantauan pemisahan MPLC • Pengumpulan fraksi dapat

dapat dilakukan dengan TLC dilakukan dengan
dari fraksi yang telah menghubungkan fraction
dikumpulkan. collector kepada kolom ataupun
• Detektor yang dapat digunakan detektor.
pada metode MPLC adalah • Volume fraksi yang dikumpulkan
detektor LC-UV. sangat bergantung pada
• Detektor LC-UV adalah detektor diameter kolom dan laju alir.
yang dirancang khusus untuk
pemisahan preparatif dengan
laju alir hingga 500 mL per
menit.
• Detektor lalu dihubungkan
dengan rekorder untuk
memungkinkan visualisasi dari
pemisahan kromatografi.

FASE DIAM

Fase diam yang paling sering digunakan karena

Pemilihan fase diam merupakan parameter
penting yang mempengaruhi kualitas pemisahan.
Faktor yang harus dipertimbangkan ketika
memilih fase diam antara lain: Ukuran partikel,
Panjang kolom, Tekanan, Jenis sampel dan Biaya
harganya yang cukup efisien adalah silika gel.
Selain menguntungkan dalam segi biaya, silika
gel juga memiliki keuntungan seperti banyaknya
pelarut yang dapat digunakan sebagai eluen,
mudah menguap dari fraksi dan elusi dengan
laju alir yang tinggi. Kelemahan utama dari silika
gel ini adalah kemungkinan terjadinya adsorpsi.

Ukuran partikel fase diam yang tersedia di pasaran sangat

bervariasi. Ukuran partikel kecil 5 – 10 m biasa digunakan
untuk tujuan analisis sedangkan untuk tujuan preparatif ukuran
fase diam yang digunakan dimulai dari 15 m dan pemisahan
optimal terjadi pada fase diam dengan ukuran 20 m.

5
 11/04/2016

METODE PENGEMASAN KOLOM

Dry Filling Slurry

Method

Dry Filling

• Pada metode kering,

kolom diisi dengan fase
diam kering diikuti dengan
penambahan fase gerak
hingga kolom benar-benar
basah. Pengemasan kolom
dilakukan dibawah
tekanan nitrogen sehingga
didapatkan kepadatan
yang tinggi.

6
 11/04/2016

Slurry Method

• Pada metode basah,

bubur (slurry) disiapkan
dengan cara
mencampurkan eluen
pada serbuk fase diam
dan dimasukkan ke
dalam kolom secara
hati-hati agar tidak
terbentuk gelembung
udara.

PENYIAPAN KOLOM
Sebelum diinjeksikan sampel, sangat dianjurkan untuk melakukan pengujian pemisahan
terhadap campuran standard.
Campuran standar yang biasa digunakan untuk pengujian kolom silika gel adalah
phthalic acid dimethyl-diethyl dan dibutyl esters.
Sedangkan campuran standard benzene dan naphthalene dapat digunakan untuk
kolom fase terbalik.
Biasanya fase diam dapat diregenerasi setelah dilakukan pemisahan kromatografi.
Silika gel dapat dicuci dengan metanol, etil asetat dan n-heksana secara berturut-
turut.
Namun setelah waktu tertentu, fase diam harus diganti dan kolom perlu dikemas ulang.

7
 11/04/2016

PEMILIHAN ELUEN ATAU FASE GERAK

Pemilihan eluen juga merupakan faktor penting dalam pengembangan dan
optimalisasi pemisahan MPLC.
Dua metode yang biasa digunakan untuk pemilihan pelarut adalah 1).
Optimalisasi dengan TLC atau 2). Transposisi dari kondisi HPLC kepada MPLC.
TLC dapat mempercepat pemilihan pelarut untuk MPLC dimana pelarut yang
digunakan pada TLC dialihkan pada teknik MPLC.
Berdasarkan polaritas fase gerak dan fase diam yang digunakan dikenal dua fase
dalam sistem MPLC yaitu fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak)
dan fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak).
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama
elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama
elusi). Elusi bergradien ini digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang
kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.

PERSIAPAN SAMPEL
Beberapa kriteria yang harus dipertimbangkan sebelum sampel diinjeksi antara lain:
Persiapan sampel, Jumlah dan volume sampel dan kelarutan sampel
Eluen yang digunakan harus dapat melarutkan sampel. Konsentrasi dari sampel juga
amat penting dimana jika konsentrasi sampel terlalu besar maka viskositas larutan
akan meningkat. Viskositas yang tinggi dapat menyebabkan terjadinya tailing pada
puncak kromatografi.
Proporsi campuran sampel umumnya terdiri dari 1 bagian sampel dicampur dengan
2 – 5 bagian fase diam. Sampel disiapkan kemudian diinjeksikan dan eluen
dilewatkan menuju kolom untuk terjadi pemisahan.

8
 11/04/2016

FLASH
CHROMATOGRAPHY

9
 11/04/2016

Flash Chromatography diperkenalkan Kromatografi flash pada dasarnya

pada tahun 1978 oleh Still, Khan dan mendorong tekanan udara menengah
Mitra 1.5 – 2.0 bar sehingga terjadi
pemisahan yang cepat.

Prinsipnya, eluen akan didorong oleh

tekanan udara ke dalam kolom kaca
pendek (15 cm) dengan diameter
dalam kolom yang besar (1 – 5 cm). Viskositas larutan juga tidak boleh
Kolom kaca dikemas dengan adsorbent terlalu tinggi agar laju alir tidak
dengan ukuran partikel yang telah rendah (laju alir sekitar 100 mL/menit).
ditentukan. Fase diam yang paling
sering digunakan adalah silika gel
dengan ukuran 40 – 63 m.

INSTRUMENTASI

Apparatus kromatografi flash terdiri

dari tiga komponen utama. Kolom
kaca (A) dengan panjang 30 - 40 cm.
Tekanan udara dimasukkan melalui T-
way stopcock (B) B29 atau B34.
Pelarut dimasukkan ke dalam kolom
dengan corong kaca (C) sehingga
pelarut tidak akan mengganggu
permukaan bahan kemasan.

10
 11/04/2016

FASE DIAM
Pemilihan adsorbent yang tepat penting untuk mendapatkan pemisahan yang baik. Fase diam
yang paling sering dipakai dalam kromatografi kolom adalah silika. Silika gel (SiO2) dan
alumina (Al2O3) adalah dua adsorben yang umum digunakan dalam kromatografi kolom.
Adsorben ini dijual dalam ukuran yang bervariasi. Ukuran partikel adsorben mempengaruhi
laju alir pelarut ke dalam kolom. Ukuran partikel yang kecil biasanya digunakan untuk Flash
Chromatography sedangkan ukuran partikel yang besar biasanya digunakan untuk
kromatografi gravitasi. Jumlah silika gel yang digunakan tergantung pada perbedaan Rf
dari senyawa yang akan dipisahkan dan jumlah sampel. Biasanya rasio yang digunakan
adalah 30:1 (silika gel : sampel). Beberapa jenis adsorben yang digunakan dalam flash
chromatography:
Silika
Florisil
Alumina
Silika fase terbalik

11
 11/04/2016

SOLVEN
Flash chromatography biasanya menggunakan campuran dua pelarut yang bersifat polar dan non polar.
Senyawa harus mempunyai nilai Rf TLC sekitar 0.15 – 0.20 pada sistem pelarut yang kita pilih. Sistem pelarut
biner dengan salah satu pelarut memiliki polaritas tinggi sering digunakan dalam teknik flash chromatography.
Satu-komponen sistem pelarut
Hidrokarbon: pentana, petroleum eter, heksana
Ether dan diklorometana (polaritas sangat mirip)
Etil asetat
Dua komponen sistem pelarut
Eter / Petroleum Ether, Ether / Hexane, dan Ether / Pentane
Etil Asetat / Hexane
Methanol / Dichloromethane

12
 11/04/2016

PENGEMASAN KOLOM
Pengemasan kolom silika gel, Metode basah (slurry method) lebih
mudah untuk dikerjakan dan memberikan kemasan yang lebih baik
daripada metode dry filling. Hal ini terutama berlaku untuk kolom
dengan diameter lebar (> 6 cm). Pertama-tama, diletakkan cotton
wool dibagian bawah kolom untuk mencegah keluarnya silika gel
dari kolom. Lalu diberi pasir kurang lebih 0.5 inchi. Setelah itu
dimasukkan silika gel menggunakan corong. Selanjutnya dibagian
atasnya diberi lagi pasir. Setelah itu, pelarut dimasukkan.
Pembuatan bubur silika gel-pelarut yang sangat encer membantu
meminimalkan pembentukan gelembung udara. Pelarut yang cukup
(sekitar 5 cm) ditempatkan di kolom (dengan kran tertutup) lalu
dimasukkan bubur silika. Setelah beberapa cm dari bubur telah
dimasukkan, stopcock kolom dibuka untuk mempercepat
sedimentasi. Tekanan dapat diterapkan pada kolom menggunakan
pompa. Bagian lain dari bubur ditambahkan dengan cara yang
sama sampai ketinggian yang diinginkan.

PERSIAPAN SAMPEL
Sampel dilarutkan dalam pelarut. Lalu dimasukkan ke dalam kolom. Hati-hati ketika
memasukkan agar permukaan bagian atas silika gel tidak rusak. Lalu stopcock kolom
dibuka dan tekanan diatur sehingga pelarut akan mendorong sampel dan meresap ke
dalam silika gel. Selanjutnya bilas kolom dengan sedikit mungkin pelarut untuk
memastikan tidak ada sampel yang tertinggal di dinding kolom. Kumpulkan fraksi
sampel Fraksi-fraksi yang didapat lalu di uji dengan TLC untuk melihat kandungan
senyawa yang didapat. Lebih baik menggunakan 1 plat silika untuk semua fraksi agar
terlihat jelas perbedaan masing-masing fraksi. Lalu fraksi yang memiliki spot yang
sama disatukan dan sampel tersebut lalu dipekatkan menggunakan rotary evaporator.
Selain identifikasi menggunakan TLC, dapat juga digunakan detektor UV dan ELSD
(Evaporating Light Scattering Detector)

13
 11/04/2016

ISOLASI PRODUK ALAM DENGAN MPLC DAN

FLASH CHROMATOGRAPHY

Claeson et al (1993)
mengisolasi dua seskuiterpen
dan tiga diarylheptanoid
sebagai antiinflamasi dari
Rimpang Curcuma
xanthorrhiza Roxb.
(Zingiberaceae)

14
 11/04/2016

Bahan tanaman diperkolasi pada suhu kamar secara berurutan

dengan heksana kloroform dan metanol. Ekstrak heksana dan
kloroform menunjukkan aktivitas antiinflamasi yang signifikan
terhadap tikus edema yang diinduksi karagenan. Ekstrak metanol
tidak menunjukkan adanya aktivitas antiinflamasi. Selanjutnya
ekstrak heksana dipisahkan dengan kromatografi flash dengan tiga
gradien berturut-turut menjadi tujuh fraksi (A – G). Fraksi C dan D
merupakan fraksi aktif bioassay. Hasil 1H-NMR dan TLC dari fraksi
D, E dan F praktis identik sehingga fraksi E dan F tidak perlu
dilakukan uji bioassay. Fraksi C lalu dipisahkan lebih lanjut dengan
kromatografi flash dengan gradien heksana – etil asetat sehingga
diperoleh lima fraksi (I – V). Fraksi I dipisahkan lebih lanjut dengan
MPLC (kombinasi elusi gradien dan isokratik heksana – etil asetat)
dan menghasilkan sesquiterpen germakron (Gambar 8.1) dan
Curzerene (Gambar 8.2). Fraksi II direkristalisasi setelah penguapan
pelarut dan menghasilkan Diarylheptanoid bentuk jarum berwarna
kuning (Gambar 8.3). Senyawa 3 ini menunjukkan aktivitas
antiinflamasi yang signifikan dalam uji bioassay. Fraksi IV dipisahkan
lebih lanjut dengan MPLC dengan gradien heksana – etil asetat
yang selanjutnya direkristalisasi sehingga dihasilkan senyawa 4 dan
5 (Gambar 8.4 dan Gambar 8.5). Kedua senyawa tersebut
menunjukkan aktivitas antiinflamasi yang signifikan.

15