UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE CORREGIDORA

ANALISIS FISICOQUIMICO Y MICROBIOLOGICO

PRACTICA 2.3. Análisis microbiológico del suelo
1. OBJETIVOS
1.1 Conocer técnicas y procedimientos utilizados para análisis e identificación
microorganismos del suelo agrícola.
1.2 Analizar y cuantificar bacterias por método de dilución en placa.
1.3 Analizar y cuantificar hogos por método de dilución en placa.

2 INTRODUCCIÓN
La vida microbiana tiene un rol esencial en la formación y el mantenimiento de la fertilidad
del suelo. El monitoreo de la abundancia, actividad y diversidad de los microorganismos
edáficos es de suma importancia en ecosistemas agrícolas a fin de evaluar el impacto de las
diferentes prácticas de manejo productivo. El análisis microbiológico del suelo estudia la
presencia, abundancia y actividad de las poblaciones microbianas y las interacciones entre
los microorganismos y entre ellos y las plantas. Por tal motivo, se debe recurrir al uso de
técnicas de laboratorio que respeten lo más fielmente posible las condiciones presentes en
el ambiente natural (Sharma et al., 2013).
La fertilidad del suelo es la capacidad de mantener el suministro de nutrientes, la vida
microbiana del suelo y la complejidad física estructural del suelo en el largo plazo. Para
conservar la fertilidad del suelo es preciso evitar pérdidas de suelo por erosión (protección),
rotación y diversificación de cultivos, mantenimiento de la materia orgánica y una alta
actividad biológica, protección del suelo y en el manejo de los cultivos (Chapin et al.,
2012).
Cuando se escucha hablar de bacterias y hongos, se suele pensar en los problemas que estas
causan en la salud humana, pero lo que muchas personas no saben es que hay una gran
cantidad de estos pequeños organismos que cumplen silenciosamente funciones en el
ambiente y favorecen nuestra calidad de vida. Es el caso de muchas de las bacterias y
hongos que se encuentran en los suelos y que ayudan a mantener su fertilidad (Sylvia et al.,
2005).

3. MARCO TEÓRICO

Describa los aspectos primordiales de la práctica.

4. METODOLOGÍA Y RESULTADOS
MATERIAL:
REACTIVOS:
MUESTRAS Y DILUCIONES
-Tubos de vidrio de 15 mL para cultivo con 9 mL de solución salina 0.85% estéril.
-Matraz Erlenmeyer con tapa con 99 mL de solución salina 0.85% estéril.
-Pipetas de 1 mL y de 0.2 mL, estériles.
-Vortex
-Balanza.
-Espátulas.
-Campana de flujo laminar o área estéril.
-Cajas petri con medio de cultivo-agar (Agar nutritivo/PDA).
-Varilla de vidrio.
-Muestra de suelo
-Incubadora
¨*SOLUCIONES Y REACTIVOS:
1) Solución salina 0.85% estéril. Adicionar 8.5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 1 L de
agua destilada.
2) Cajas petri con medio de cultivo PDA para el crecimiento
3) Etanol.
ANÁLISIS BACTERIAS
-Cajas petri
-Matraces o botellas de cultivo 1L
-Agua destilada
-Agar nutritivo. Disolver 15 g de agar nutritivo o lo que indique el envase del medio de
cultivo en 1L de agua destilada.
ANÁLISIS HONGOS:
-Cajas petri
-Matraces o botellas de cultlivo 1L
-Rosa de Bengala
-Estreptomicina

PREPARACIÓN DE MUESTRA Y DILUCIONES

1) En condiciones estériles (trabajar en campana de flujo laminar), adicionar 1 g del suelo
a una botella de dilución o matraz con tapa de rosca con 99 ml de solución salina isotónica
estéril (dilución 10-2). Dispersar el suelo y homogeneizar con agitación vigorosa en
vórtex.
2) Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solución salina estéril (dilución 10-3).
De ahí se hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones decimales hasta 10-10 o
las adecuadas, asegurándose de utilizar una punta o pipeta estéril diferente en cada paso.
Agitar de forma constante con vórtex en cada paso.
3) Tomar 0.1 ml de la dilución seleccionada y colocarla en el centro de la superficie del
medio de cultivo seleccionado para el crecimiento. Realizar esto por triplicado y con tres
diluciones próximas (ej. 10-3, 10-4 y 10-5) para asegurar la cuenta.
4) Extender la alícuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio previamente
esterilizada (inmersa en alcohol y pasándola por la flama del mechero permitiendo su
enfriamiento). Asegurar una distribución homogénea por toda la superficie del medio.

OJO: Cada muestra con su respectivo medio de cultivo (Agar nutritivo/ PDA)

BACTERIAS TOTALES POR DILUCIÓN EN PLACA

1) Preparar medio de cultivo con agar nutritivo en un matraz Erlenmeyer o botella de
cultivo.
2) Calentar hasta disolución total.
3) Esterilizar el medio de cultivo a 15 lb, 121°C durante 15 minutos.
4) Una vez esterilizado el medio de cultivo dejarlo enfriar a 50°C aproximadamente.
5) Vaciar el medio en cajas Petri en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.
6) Dejar enfriar y gelificar el medio.
7) Tomar las muestras de suelo y diluciones e inocular cada caja descrito previamente.
8) Después de tres días de incubación proceder al conteo de colonias.
9) Realizar una tinción de Gram a las diferentes colonias aisladas, observar al microscopio
a inmersión y describir su morfología microscópica.
10) Para el cálculo final de unidades formadoras de colonias (UFC) se debe considerar la
dilución con que se inoculó la caja, la cantidad de inóculo (0.1 ml) y la humedad de la
muestra.

HONGOS TOTALES POR DILUCIÓN EN PLACA

1) Preparar medio de cultivo para hongos totales utilizando PDA (39 g L-1 o lo indicado en
el frasco) y rosa de Bengala (50 mg L-1). Llevar a ebullición hasta disolución completa.
2) Esterilizar el medio en autoclave a 121°C (15lb) /15 minutos.
3) Una vez que el medio esté aproximadamente a 50°C, en condiciones estériles (en
campana de flujo laminar) ajustar su pH a 4.9 con ácido láctico estéril al 10% y adicionar
estreptomicina (48 mg L-1).
Nota: Para suprimir el crecimiento bacteriano algunas veces es deseable acidificar el
medio a pH 3.5. Esto se puede conseguir adicionando 1 ml de ácido láctico al 10% por
cada 100 ml del medio estéril y a 50°C. El medio no debe de ser calentado después de la
adición del ácido, ya que esto podría hidrolizar el agar alterando su propiedad gelificante.
Si no se requiere medio selectivo se sugiere el empleo de PDA sin la adición de ácido o
utilizar algún antibiótico como estreptomicina (Oxoid, 1995).
4) Mezclar bien antes de vaciar el medio en cajas de Petri, una vez vaciado en cajas
esperar a que gelifique.
5) Tomar las muestras de suelo y diluciones e inocular cada caja descrito previamente
6) Incubar las cajas invertidas a 30°C.
7) Después de cinco días de incubación proceder al conteo de colonias.
8) Realizar una tinción con hidróxido de potasio (Anexo1)
9) Para el cálculo final de unidades formadoras de colonias (UFC) se debe considerar la
dilución con que se inoculó la caja, la cantidad de inóculo (0.1 ml) y la humedad de la
muestra, reportando finalmente UFC/g suelo seco.
CALCULOS:
1) Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias.
2) Con la siguiente ecuación calcular las UFC/g s.s.
 UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH).
Donde: UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco.
NC = número de colonias en una caja.
FD = factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó la muestra con la
que se inocula la caja (10-2 a 10-10).
V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.
P = peso de la muestra húmeda = 1 g.
FH = factor de corrección de humedad (1-(%humedad/100)).

Comentarios y/o observaciones

Escriba los eventos relevantes que se presentaron durante el desarrollo que considere
importantes para la interpretación de los resultados obtenidos.

6. CONCLUSIONES
Escriba en las siguientes preguntas: ¿Se lograron los objetivos? ¿Si, no, porqué? Los
resultados coinciden con lo esperado? ¿Si, no, porque? ¿Qué factores influyeron en el éxito
logro o fracaso en el logro de los objetivos? ¿Qué sugiere modificar para mejorar los
resultados? ¿Qué aprendizaje logró y como lo puede aplicar en su vida profesional o en su
vida diaria? Para escribir estas conclusiones utilice todo el espacio que sea necesario.

7. CUESTIONARIO
a) Describe la morfología colonial y dibuja la morfología microscópica de lo que lograron
ver en tinción e investigar bibliografías que tipo de bacteria u hongo benigno o patógeno se
encontró en muestra de suelo, comparar e identificar.

Dibujos
b) ¿Por qué es importante la vida de microorganismos en tierras agricultoras?
c) ¿Qué función tienen los hongos en tierras agrícolas?
d) ¿Qué función tiene las bacterias en tierras agrícolas?
e) Menciona los microorganismos con mayor fijación de Nitrógeno en plantas, árboles
frutales, cultivos, etc.

8. BIBLIOGRAFIAS
-Sharma, S. B. et al. (2013) Phosphate solubilizing microbes: sustainable approach for
managing phosphorus. Ensayo de germinación de semillas de pasto Fuente: Lucía Lozano.
33 deficiency in agricultural soils. Springer Plus, 2. Recuperado de http://
www.springerplus.com/content/2/1/587
-Chapin, F. S. et al. (2012) Principles of terrestrial ecosystem ecology (2.a ed.). Nueva
York: Springer.
-Sylvia, D. M. et al (2005) Principles and applications of soil microbiology (2.a ed). Nueva
Jersey: Prentice Hall.

ANEXO 1

Observación microscópica con Hidróxido de potasio (KOH) al 40%

Principio

El KOH disuelve la queratina y aclara la preparación sin afectar la morfología de los

elementos fúngicos, permitiendo una mejor visualización de los mismos.

Preparación del reactivo

Hidróxido de potasio (lentejas) ------------------------------ 40 g *

Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml

Descripción de la técnica

Colocar una gota de KOH 40% en el centro de un portaobjetos limpio, ubicar la muestra en
el KOH y cubrir con cubreobjetos. Dejar digerir 10 min. El efecto aclarante se acelera
calentando la preparación suavemente a la llama hasta el desprendimiento de las primeras
burbujas.