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“AÑO DEL BUEN SERVICIO AL CIUDADANO”

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA


FACULTAD DE INGENIERÍA
E. A. P. DE AGROINDUSTRIA

TEMA:
DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES DE
UN ALIMENTO POR ESPECTROFOTOMETRÍA (MÉTODO
DNS)
DOCENTE:
Ing. Toro Rodríguez Moisés Raúl
ALUMNO:
Sánchez García Frank
CICLO:
VI

Nuevo Chimbote- Perú 2017


I. INTRODUCCION
Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican
como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles
(reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son
altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros
agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente
reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azúcares se
oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que
se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.

Una de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la cantidad


de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la
misma. Esta técnica se llama Espectrofotometría. Se puede utilizar el
espectrofotómetro para determinar la longitud de onda de la radiación necesaria
para las determinaciones de la cantidad de azúcar en las muestras bajo estudio,
comparándola después con la radiación absorbida por un blanco.

Los azúcares reductores al poseer un grupo carbonilo libre formando un grupo


hemiacetal que le confiere la característica de poder reaccionar con otros
compuestos. La determinación de estos azúcares se realizó con el objeto de
obtener una curva de calibración aplicando la técnica de Miller o DNS (ácido
dinitrosalicílico), reactivo que tiene la capacidad de oxidar a los azúcares
reductores dando resultados colorimétricos que se pueden medir con una
longitud de onda de 540nm.

El presente informe desarrollara el procedimiento respectivo para la


determinación de azucares reductores a partir de una solución patrón de glucosa
de concentración 1g/L, que permitirá realizar y ajustar una curva de calibración,
y una solución desconocida; por el método del ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS).

II. OBJETIVOS

 Utilizar correctamente el método espectrofotométrico para azucares


 Preparar una curva patrón de glucosa con el 3,5-dinitrosalcílico (3,5 -
DNS)
III. MARCO TEORICO

Un azúcar reductor es todo azúcar con un grupo


carbonilo en su estructura, el cual puede
funcionar como aldehído o cetona según su
ubicación en dicha estructura. Se llaman
azúcares reductores porque poseen la
capacidad de reducir otros compuestos gracias
a la alta reactividad del doble enlace del
oxígeno. Respecto al grupo carbonilo, los
sacáridos se clasifican en aldosas (poseen un
grupo aldehído, el cual se ubica en uno de los
carbonos terminales de la molécula) o en
cetosas (poseen un grupo cetona, ubicado en
un carbono no terminal de la molécula). Los
monosacáridos son un gran ejemplo de
azúcares reductores.

Los monosacáridos y la mayoría de los disacáridos poseen poder reductor, que


deben al grupo carbonilo que tienen en su molécula. Este carácter reductor
puede ponerse de manifiesto por medio de una reacción redox llevada a cabo
entre ellos y el sulfato de Cobre (II). Las soluciones de esta sal tienen color azul.
Tras la reacción con el glúcido reductor se forma óxido de Cobre (I) de color rojo.

De este modo, el cambio de color indica que se ha producido la citada reacción


y que, por lo tanto, el glúcido presente es reductor.
Los azúcares o carbohidratos pueden ser monosacáridos, disacáridos,
trisacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

 Los monosacáridos reaccionan de acuerdo a los grupos hidroxilo y


carbonilo que poseen.
 Los disacáridos y los polisacáridos se pueden hidrolizar para producir
monosacáridos.

Los azúcares reductores provocan la alteración de las proteínas mediante la


reacción de glucosilación no enzimática también denominada reacción de
Maillard o glicación. La glucosa es el azúcar reductor más abundante en el
organismo.

Esto lleva a que éste sea el azúcar reductor generalmente considerado en las
reacciones de glucosilación no enzimática de interés biológico. Sin embargo,
cualquier azúcar que posea un grupo carbonilo libre puede reaccionar con los
grupos amino primarios de las proteínas para formar bases de Schiff.
Las moléculas de azúcar consiguen estabilizarse a través de un equilibrio entre
dicha forma abierta y por lo menos dos formas cerradas (anómeros cíclicos) en
las que el grupo carbonilo ha desaparecido.

En 1953, el grupo de Aaron Katchalsky, en el entonces recientemente creado


Instituto Weizmann de Israel, demostró que existe una correlación entre la
velocidad de la reacción de glicación y la proporción de la forma abierta de cada
azúcar. De hecho, los azúcares fosfato, que son azúcares reductores de gran
importancia en el interior celular, poseen mayor capacidad glucosilante que la
glucosa dada su mayor proporción de forma carbonílica (abierta).La sacarosa es
un disacárido que no posee carbonos anoméricos libres por lo que carece de
poder reductor y la reacción con el licor de Fehling es negativa .

METODO DNS:
El método DNS (técnica de miller) es una técnica colorimétrica que emplea ácido
3,5 dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra.
Determina las absorbancias por medio de un espectrofotómetro a 540nm.

Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante
una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática.
La curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas,
de la Absorbancia (eje de ordenadas: Y) frente a la Concentración (eje de
abscisas: X).

Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus


absorbancias, construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. La
concentración de una solución problema (desconocida), se averigua por
interpolación de la Absorbancia de la solución en la curva de calibración, o a
través de la ecuación de la recta (y = mx + b) donde:

 Absorbancia (y) = constante


 (m) = concentración
 X = absorbancia del blanco.

El DNS reacciona únicamente con los azúcares reductores. La sacarosa es un


disacárido no reductor, pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa
y fructosa que sí son reductores y reaccionan con el DNS generando un producto
coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por métodos
espectrofotométricos es proporcional a la concentración de sacarosa.
IV. MATERIALES Y MÉTODOS

A. MATERIALES Y EQUIPOS:

 Espectrofotómetro
 Fiolas de 1000 ml, 100 ml
 Pipetas Volumétricas de 1 ml, 5 ml y 10
ml
 Centriffugadora
 Fiolas 250 ml
 Micropipetas ESPECTROFOTOMETRO
 Tubos de ensayo
 Glucosa
 Mango
 Tartrato de Sodio y Potasio
 Hidróxido de Sodio
 Metabisulfito de Sodio
 Reactivo DNS MANGO

B. PREPARACIÓN DE LA SOLUCION MADRE:

 Para la solución madre, se pesó en la balanza analítica 5 mg de glucosa,


el cual se vació en un tubo de ensayo junto con 3ml de agua destilada.

C. PREPARACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES PARA LA CURVA


PATRÓN:

 De la solución madre se sacó 0.5, 2, 4, 6, 8 y 10 ml, vaciando cada una


de estas concentraciones en 5 fiolas de 100ml, para luego aforar cada
una de ellas con agua destilada.
 En 4 tubos de ensayo se coloca 1ml de las concentraciones en cada uno
de ellos, además se le agrega 1ml del colorante DNS a cada uno de los
tubos.
 Un vaso de precipitación con agua se pone a hervir, una vez este
hirviendo se coloca los 4 tubos de ensayo durante 5 minutos, para luego
dejarlos enfriar.
 Agregar 10ml de agua destilada a cada tubo una vez estén fríos.
 Se hace la respectiva lectura de estos a 540nm.
D. PREPARACION DE LAS MUESTRAS:
 Se saca 1ml tanto de la naranja y del mango, mediante filtración,
agregándolo en una fiola de 100ml y aforándolo con agua destilada.
 Se saca de la fiola 1ml de las muestra y se vacían en un tubo de ensayo
diferente cada uno de ellos, agregando además 1ml del colorante DNS.
 Se caliente junto con los otros tubos anteriores durante 5 minutos también.
 Una vez frías las muestras se les agrega 10ml de agua destilada.
 Se hace la respectiva lectura de estos a 540nm.

Fig. 3 Muestras concentradas Fig. 4 Muestras diluidas con agua

V. DATOS Y RESULTADOS.

A. Datos de concentraciones y lectura del espectrofotómetro.

Tabla N°1: Resultados de absorbancias a una lectura de 540 nm.

Concentraciones
Absorbancia (L1-L2)
(mg)
2 0.0038
4 0.011
6 0.0159
8 0.0221
10 0.0305
MANGO 0.4044
MANGO 0.0255
Grafico N°1: CURVA DE CALIBRACION

CONCENTRACION vs ABSROBANCIA
0.035

0.03
y = 0.0032x - 0.0027
CONCENTRACION

0.025
R² = 0.9926
0.02

0.015

0.01

0.005

0
0 2 4 6 8 10 12
ABSORBANCIA

 Con la curva obtenida se realizó una gráfica de tendencia lineal que se


ajusta a los datos, el R² obtenido la ecuación de la recta es de 0.9934
Teniendo en cuenta R² es mayor a 0.95 y los datos no tienen mucha
dispersión y por lo tanto son aceptables.

Ecuación de la Recta:

𝒚 = 𝟎. 𝟎𝟎𝟑𝟐𝒙 − 𝟎. 𝟎𝟎𝟐𝟕
Hallando las concentraciones del mango: Con factor de dilución (FD)
de 0.25 y 0.1

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 0.4044 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 0.0255


 Por tanto reemplazando en la  Por tanto reemplazando en la
formula general: formula general:

𝑦 = 0.0032𝑥 − 0.0027 𝑦 = 0.0032𝑥 − 0.0027

𝑦 + 0.0032 𝑦 + 0.0032
𝑥=( ) 𝐹𝐷 𝑥=( ) 𝐹𝐷
0.0027 0.0057

0.4044 + 0.0032 0.0255 + 0.0032


𝑥=( ) 0.25 𝑥=( ) 0.1
0.0027 0.0027

𝑚𝑔 𝑚𝑔
𝑥 = 31.38 ⁄𝑚𝑙 𝑥 = 0.713 ⁄𝑚𝑙
VI. DISCUSION

 De acuerdo a los resultados de la Tabla N°01, y la curva de calibración


de las concentraciones (2, 4, 6, 8 y 10), como se muestra en la Grafica
N°02, observamos que el R² tiene un valor de R²=0.9934, lo cual significa
que se hizo una realización correcta en la práctica. Ya que es muy
importante que el R² sea mayor a 0.95 para verificar la validación de la
práctica en los azucares reductores.

 También pudimos apreciar durante la realización de la prueba para la


determinación de azucares reductores en el mango arrojaba la prueba
positiva de un color rojo – marrón en la coloración esto se debe a la
reacción del DNS con la glucosa provocando dicho cambio de color, lo
cual indica el mango tiene gran contenido de azucares.

 El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácido


dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una
muestra, seguido de la determinación espectrofotométrica a 540nm de los
azúcares reductores. Se pudo comprobar que la espectrofotometría es un
método de análisis óptico más adecuado para la determinación de una
concentración en una muestra. Dicho de otro modo es un instrumento que
permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución
que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una
cantidad conocida de la misma sustancia en este caso la glucosa.

VII. CONCLUSIONES

 Con la realización de esta práctica se pudo determinar un método


cuantitativo (DNS) para conocer la concentración de azúcar en muestras
desconocidas, elaborando primero una curva patrón, con concentraciones
conocidas, en donde obtendremos una ecuación pro ajuste de la recta, el
cual nos servirá para encontrar la concentración de la muestra
desconocida, reemplazando la absorbancia de este en la curva patrón.

 La realización de una curva patrón es básico en cualquier análisis, dado


que con esta curva se identifica la cantidad de analito que contenga la
muestra, realizando una solución con esta muestra y llevándolo al
espectrofotómetro, el cual nos dará su absorbancia, reemplazando este
dato en la ecuación que nos da la línea de tendencia en la curva patrón.
 Concluimos que el mango contiene gran cantidad de azucares reductores,
lo cual se obtuvo reemplazando la absorbancia que nos dio el
espectrofotómetro de la muestra en la ecuación general.

VIII. BIBLIOGRAFÍA

 A.O.A.C. 1975. Methods of Analysis of Official Analytical Chemist, Ed. 12


Washington.
 ASTIASARAN, I; LASHERAS, B; ARIÑO, A; MARTINEZ,
A.2003.Alimentos y Nutrición en la Práctica Sanitaria. Díaz de Santos.
España.
 BADUI, S. 1996. Química de alimentos. Editorial Alambra , México
 NIELSEN S. 2003. Análisis de los alimentos. Manual de laboratorio.
Editorial Acribia Zaragoza. Tercera edición. España
 PANTASTICO, E. 1984. Fisiología de la postre colección, manejo y
utilización de frutas y hortalizas tropicales y subtropicales. Editorial
Continental, S.A., México.
 HART, L.; FISHER, H. 1991. Análisis Moderno de los Alimentos. 2da
reimpresión. Editorial Acribia. Zaragoza, España.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los métodos que determinan cualitativamente los azucares


reductores? Descríbelos

 La reacción o prueba de Benedict identifica azúcares reductores (aquellos


que tienen su OH anomérico libre), como la lactosa, la glucosa. En
soluciones alcalinas, pueden reducir el Cu2+ que tiene color azul a Cu+, que
precipita de la solución alcalina como Cu2O de color rojo-naranja. El
fundamento de esta reacción radica en que en un medio alcalino, el ion
cúprico (otorgado por el sulfato cúprico) es capaz de reducirse por efecto del
grupo Aldehído del azúcar (CHO) a su forma de Cu+. Este nuevo ion se
observa como un precipitado rojo ladrillo correspondiente al óxido cuproso
(Cu2O). y todo esto porque consta de Sulfato cúprico; Citrato de sodio;
Carbonato anhidro de sodio..
 Esta ración dio positiva para la lactosa y glucosa porque en el medio alcalino
facilita que el azúcar esté de forma lineal, puesto que el azúcar en solución
forma un anillo de piranósico o furanósico. Una vez que el azúcar está lineal,
su grupo aldehído que tiene un oh libre que puede reaccionar con el ion
cúprico en solución; en la sacarosa, no dan positivo puesto que sus OH
anoméricos están siendo utilizados en el enlace glucosídico. En resumen, se
habla de azúcares reductores cuando tienen su OH anomérico libre, y éstos
son los que dan positivo en la prueba de Benedict.

 La prueba de Barfoed sirve para distinguir monosacáridos reductores de


disacáridos reductores, basándose en la velocidad de reacción; en los
monosacáridos la formación del óxido cuproso es más rápido que en los
disacáridos. Este reactivo se compone de una solución de 0.33 molar de
acetato de cobre neutro en una solución de 1% de ácido acético. En la
prueba de barfoed la reacción es positiva para la galactosa y ribosa, porque
al utilizar acetato cúprico y ácido acético con lo que solo los monosacáridos
son capaces de reducir el cobre, formando así un precipitado rojo ladrillo, en
tanto que el almidón es un disacárido que tienen menor poder de reductor al
tener comprometido uno de sus carbonos anoméricos en el establecimiento
del enlace glicosídico, no reaccionan y por lo tanto dan un resultado negativo.

 Reacción de Seliwanoff: Los carbohidratos se clasifican como cetosas o


aldosas. Vale decir, que las cetosas en el carbono 2 tienen una función
cetona, que en presencia de un ácido fuerte producen rápidamente
derivados furfúricos que reaccionan con un difenol llamado resorcina que
está contenido en el reactivo de Seliwanoff. La fluctos da positiva porque
pertenece al grupo cetona y como Esta prueba es específica para cetosas y
se basa en la conversión de la cetosa en 5-hidro- metil-furfural y su posterior
condensación con resorcinol formando así complejos coloreados rojo o
rosado.

 Reacción de molish: En la reacción de Molish, el agregado de ácido


sulfúrico concentrado a a la leche provoca la deshidratación del glúcido en
la interface, para dar un anillo de furfural o hidroximetilfurfural que reacciona
con alfa-naftol, para dar un producto de color púrpura. La presencia de
carbohidratos en nuestra muestra se pone de manifiesto por la reacción de
Molisch, Basada en la acción hidrolizante y deshidratante del ácido sulfúrico
sobre los hidratos de carbono. En dicha reacción el ácido sulfúrico cataliza
la hidrólisis de los enlaces glucosídicos de la muestra y la deshidratación a
furfural (en las pentosas) o hidroximetilfurfural (en las hexosas). Estos
furfurales se condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch (reacción
de Molisch) dando un producto coloreado.
 Prueba de Bial es una prueba química para la presencia de pentosas. Los
componentes incluyen orcinol, ácido hidroclórico, y cloruro férrico. Que En
presencia de una pentosa, el pentosoma será deshidratado para formar
furfural. La solución dará muestra azulada.

2. Explique porque la sacarosa y el almidón no son reductores.

La sacarosa: no presenta poder reductor


porque la unión glucosídica se establece entre
el carbono 1 de la glucosa y el carbono 2 de la
fructosa, con lo cual se estabilizan las
estructuras cíclicas, pues se constituye un
acetal y no queda ningún hemiacetal capaz de
dar una cadena abierta por hidrólisis.

El almidón: se considera un azúcar no reductor


porque a pesar de que tiene carbonos
anoméricos libres capaces de oxidarse, hay muy
pocos en comparación a la cantidad de unidades
de monosacáridos que componen el almidón. Es
decir, solo los de los extremos de la larga cadena
que compone al almidón, puede oxidarse y
calculando que una cadena de almidón (que a su
vez tiene ramificaciones) tiene más de 10000
residuos de monosacáridos, entonces se
concluye que si bien el almidón puede oxidarse, su poder de reductor es
prácticamente nulo debido al muy bajo rendimiento y que la cantidad de carbonos
libres son muy pocos, conociéndose esto como un azúcar no reductor.

3. ¿Qué función cumple el blanco en la medición de la absorbancia?

Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia


de una sustancia de concentración desconocida con la de una solución de la
misma sustancia cuya concentración se conoce y a la cual se denomina solución
patrón o estándar. La absorbancia de una solución es la resultante de la
absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros
componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa
longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe
descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer
siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos
aquel que se desea medir.