2018
Biologista Me. Lívia Ferreira. S. Verzola - Laboratório de Patologia Molecular – SERPAT
e-mail: lfsverzola@hotmail.com.br
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Mais do que um complexo conjunto de técnicas que geram conflitos intelectuais, sociais e religiosos, a
manipulação genética cria condições para que nós possamos conhecer melhor não só o mundo e os seres que
nele vivem. Antes disso, ela nos permite viver mais próximos à nossa vaidade e nos remete ao questionamento
de nossas limitações.
A Biologia Molecular é o estudo da Biologia em nível molecular, com especial foco no estudo
da estrutura e função do material genético e seus produtos de expressão, as proteínas. Mais concretamente, a
Biologia Molecular investiga as interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação entre
DNA, RNA e Síntese Protéica. É um campo de estudo amplo, que abrange outras áreas da Biologia e da
Química, em especial, Genética e Bioquímica. Muito do trabalho feito no âmbito da Biologia Molecular
relaciona-se com a obtenção, identificação e caracterização de genes. No estudo da Microbiologia, diversas
técnicas de biologia molecular são utilizadas para o isolamento e caracterização de organismos patogênicos
(ou de seus genes), como vírus e bactérias.
Desde o início da década de 1970 foram desenvolvidas e/ou aperfeiçoadas diversas técnicas de
detecção ou diferenciação de ácidos nucléicos. A maioria dessas técnicas é realizada em função da variação da
temperatura e/ou do pH do meio onde os ácidos nucléicos se encontram. Considerando que a temperatura e o
pH estão relacionados com a capacidade do DNA em desfazer e refazer as pontes de hidrogênio, deve-se
então ter em mente que a hibridização dos ácidos nucléicos é a base fundamental da maioria das técnicas
moleculares como Western blot, Southern blot, Northen blot, ISH, FISH, PCR Convencional, PCR em Tempo
Real, Seqüenciamento, etc.
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OBTENÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS – EXTRAÇÃO
Princípio:
A obtenção de DNA e ou RNA para qualquer finalidade é sem dúvida uma etapa fundamental em
qualquer protocolo, pois a pureza e a integridade das moléculas de ácidos nucléicos certamente influenciarão
nos resultados finais dos experimentos para as quais se destinam.
Existem métodos clássicos, com pequenas variações, para a obtenção dos ácidos nucléicos a partir de
amostras biológicas em geral, e são aplicáveis em qualquer laboratório que disponha dos equipamentos e
reagentes necessários, como a técnica SALTING OUT. Outros métodos mais modernos são baseados no uso
de KITS INDUSTRIALIZADOS preparados com variados tipos de soluções salinas de diferentes
concentrações, tampões e colunas de troca iônica para a purificação de DNA ou RNA, são de modo geral mais
práticos e rápidos, porém todos seguem as mesmas etapas básicas:
Ruptura (físico e químico) das membranas celulares para liberação do material genético.
Desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos: DNA e proteínas.
Separação do DNA dos demais componentes celulares.
OBS.: Cada Kit de Extração Comercial possui seu próprio procedimento, mas com o mesmo
princípio. Sempre verificar o procedimento do Kit que você está utilizando para não errar na
técnica.
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PROTOCOLOS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE PATOLOGIA MOLECULAR
EQUIPAMENTOS UTILIZADOS
EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE MATERIAL PARAFINADO: KIT DNA ISOLATION FROM FFPE
SAMPLES – MACHEREY-NAGEL – MN
2. Incubar 3 minutos à 60°C (esta temperatura é de acordo com a temperatura de fusão da parafina).
Depois da centrifugação irá formar 2 fases no tubo da amostra. Retirar com a pipeta todo o
sobrenadante, manter somente a fase do fundo no tubo.
9. Adicionar 100ul do Decrosslink Buffer D-Link no tubo e vortexar. Centrifugar a 11.000 rpm por 30
segundos.
10. Adicionar 200ul de etanol (96-100%) no tubo e vortexar. Depois dar um Spin no tubo.
11. Pipetar todo o conteúdo do tubo na coluna com o tubo coletor e Centrifugar a 11.000 rpm por 30
segundos. Retirar todo o filtrado no tubo coletor e descartar.
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12. Adicionar 400ul de Buffer B5 na coluna e Centrifugar a 11.000 rpm por 30 segundos. Retirar todo o
filtrado no tubo coletor e descartar.
13. Novamente adicionar 400ul de Buffer B5 na coluna e Centrifugar a 11.000 rpm por 30 segundos.
Retirar todo o filtrado no tubo coletor e descartar.
14. Centrifugar somente a coluna com o tubo coletar por 1 minuto para retirar todo o etanol da amostra.
15. Eluir o DNA: Descartar o tubo coletor e colocar a coluna em um tubo tipo eppendorf. Adicionar 20ul
do Buffer BE diretamente na coluna de sílica e Centrifugar a 11.000 rpm por 30 segundos.
12. Adicionar de 20-100ul do tampão ATE, eluição, deixar 1 min. na temperatura ambiente e centrifugar a
14.000 rpm por 1 min.
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EXTRAÇÃO DE RNA A PARTIR DE TECIDO (MAT. BIOL.): KIT COMERCIAL SIGMA – RTN70
1. Antes de iniciar o experimento preparar a solução de lise. Manipular tudo no gelo (amostras/lisado).
Adicionar 2-mercaptoetanol ao volume de solução de lise que será utilizada no dia, usualmente 250 ou
500ul por preparação de RNA. Usar 10ul para cada 1ml de solução de lise.
TECIDO
Obs.: O lisado acima de 500ul deve ser divido em 2 colunas e processar separadamente.
3. Separar o tecido e colocar em um tubo próprio para homogenização. O volume do tampão de lise deve
ser suficiente para a amostra. Não deixar o tecido congelado, descongelar antes da ruptura na solução
de lise/2-ME e homogenizar sempre no gelo.
4. Pipetar o homogenato em uma coluna Gen Elute Filtration (azul inserido em um tubo de 2ml).
Centrifugar a velocidade de 12.000 – 16.000 g por 2 min. (a centrifuga já tem que estar refrigerada a
4°C). descartar a coluna de filtração.
6. Pipetar 700ul da mistura lisado/etanol na coluna Gen Elute Binding Column. Se o volume for maior
fazer em 2 etapas. Centrifugar na velocidade máxima por 15 seg.
7. Primeira lavagem: adicionar 500ul de Wash Solution 1 na coluna e centrifugar a velocidade máxima
por 15 seg.
8. Segunda lavagem: transferir a coluna para um novo tubo e pipetar 500ul do wash solution 2 na coluna
e centrifugar a velocidade máxima por 15 seg.
9. Terceira lavagem: pipetar 500ul do wash solution 2 na velocidade máxima por 2 min.
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11. Eluição do RNA: transferir a coluna para um novo tubo e pipetar 50ul da solução de eluição e
centrifugar na velocidade máxima por 1 min. Se é esperado uma concentração maior que 50ug de
RNA, repetir a eluição com 50ul extra da solução de eluição.
EXTRAÇÃO DE RNA PARTIR DE TECIDO (MAT. BIOL.): KIT COMERCIAL RNeasy MICRO KIT) –
QIAGEN
Procedimento:
1. Adicionar B-Mercaptoetanol ao tampão RLT. Adicionar 10ul de B-ME em 1ml de Buffer RLT.
2. Adicionar ETOH 4V no Buffer RPE
3. Adicionar 350ul Buffer RLT no tecido e homogeneizar por 30 seg.
4. Centrifugar a 14.000 rpm por 3 min. Transferir o sobrenadante para outro tubo, adicionar 350ul de
etanol 70% e transferir para uma coluna. Centrifugar a 8.000-10.000 rpm por 15 seg.
5. Adicionar 350ul de buffer RW1 a 10.000 rpm por 15 seg.
6. Adicionar 10ul de DNAse I a 70ul Buffer RDD e adicionar sobre a coluna e incube em banho maria a
20-30°C por 15 min.
7. Adicionar 350ul RW1 a 10.000 rpm por 15 seg.
8. Troque o tubo que sustenta a coluninha e adicione 500ul de Buffer RPE a coluna e centrifugue a
10.000 rpm por 15 seg.
9. Adicione 500ul de etanol 80% e centrifugue a 10.000 rpm por 2 min.
10. Centrifugue a 10.000 rpm por 2 min. para retirar o excesso de etanol.
11. Colocar a coluninha em um outro tubo coletor e adicionar 14ul de RNAse Free Water, centrifugar a
10.000 rpm por 2 min.
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EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE SANGUE TOTAL: KIT COMERCIAL GEN ELUTE – SIGMA
5. Ressuspender o pellet com 200ul de solução ressuspensão. Adicionar 20ul de proteinase K a amostra e
vortexar. Adicionar 20ul RNAse e incubar por 2 min. em temperatura ambiente.
LISE CELULAR
6. Adicionar 200 ul da solução de lise C na amostra vortexar. Uma mistura homogênea é essencial para
uma lise eficiente. Incubar a 55° C por 10 min.
PREPARO DA COLUNA
7. Adicionar 500ul da solução preparação da coluna para cada coluna e centrifugar 12.000 g por 1 min.
descartar o líquido.
8. Adicionar 200ul ETOH ao lisado, misturar vortexando 5-10 seg. uma solução homogênea é essencial.
9. Carregar o lisado – transferir o conteúdo do tubo para coluna tratada e centrifugar a 6.500 g por 1 min.
descartar o tubo coletor contendo o fluido e colocar a coluna em um outro tubo.
LAVAGENS
10. Adicionar 500ul wash solution na coluna e centrifugar a 6.500 g por 1 min. Descartar o liquido que
está no fundo do tubo coletor
11. Adicionar 500ul wash solution na coluna e centrifugar a 12.000 g por 3 min. Descartar o líquido que
está no fundo do tubo coletor. Colocar a coluna em um outro tubo coletor.
12. Adicionar 200ul de solução de eluição e centrifugar a 6.500 g por 1 min. para eluir o DNA.
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REAÇÃO EM CADEIA PELA AÇÃO DA POLIMERASE (PCR)
Princípio:
A reação em cadeia pela ação da polimerase, ou simplesmente PCR (do inglês polimerase chain
reaction), desenvolvida por Kary B. Mullis, é o ensaio mais sensível para a detecção de DNA. A técnica de
PCR é um método baseado na amplificação enzimática de um determinado segmento de DNA pela extensão
de oligonucleotídios (primers ou seqüências iniciadoras) que hibridizam com as fitas complementares de uma
seqüência – molde também conhecida como seqüência – alvo. Repetidos ciclos com sucessivas variações de
temperatura permitem a desnaturação do DNA molde, hibridização e extensão dos primers pela ação da DNA
polimerase. Ao decorrer de vários ciclos o segmento de DNA limitado pelos primers vai sendo amplificado,
de modo que passa a existir um acúmulo exponencial dessa região. Então se partirmos de uma única molécula
de DNA molde, após 30 ciclos de desnaturação, hibridização e extensão, será obtido cerca de 1,4 bilhão de
cópias da região limitada pelos primers.
EQUIPAMENTOS UTILIZADOS
Termociclador
Vórtex
Obs.: A quantidade a ser adicionada de cada reagente depende da concentração dos mesmos e da
marca dos reagentes que estão sendo utilizados. Observar o protocolo que acompanha os reagentes
para não errar a técnica.
Procedimento:
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(Protocolo para 1 paciente)
Princípio:
Trata-se de uma inovação que permite o acompanhamento do número de cópias feitas numa PCR.
Neste sistema, além dos primers, você utiliza uma sonda interna ao segmento a ser amplificado também é
hibridizado ao DNA molde. Essa sonda possui um marcador fluorescente que permanece protegido, sendo
liberado quando a sonda é destruída pela ação da enzima polimerase. Assim quando ocorre a extensão dos
primers, a polimerase passa pelo local onde a sonda está ligada, promovendo a sua desintegração. Esse evento
pode ser acompanhado pela liberação da fluorescência, que é captada pelo equipamento e processada no
computador. Esse é um teste que está sendo bastante utilizado para verificação de carga viral.
RT-PCR
Princípio:
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Observar como chegaram os primers, geralmente eles estão liofilizados e temos que reconstituí-los. Ler o
protocolo que acompanha os primers.
Primeiramente:
Recomenda-se que a diluição dos primers seja realizada em uma concentração > 10 uM. Geralmente o
mais utilizado é deixar os primers para estoque na concentração de 100 uM.
Procedimento:
OBS.: Verificar muito bem a H2O ultrapura ou TE se estão estéreis (sem contaminação), fazer uma
assepsia adequada na bancada, nas mãos (luvas) e de preferência diluir em uma Workstation ou Capela
(UV) para que não haja contaminação.
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Princípio:
A técnica apresenta basicamente um sistema de suporte (gel de agarose, por exemplo), uma cuba com
eletrodos, um tampão no qual está imerso o gel e os eletrodos nas extremidades da cuba. Você adiciona a
amostra em um dos poços do gel. A amostra deve estar corada ou o gel deve ter o corante como por exemplo o
brometo de etídio. Sob influência de um campo elétrico, moléculas carregadas e partículas migram em direção
ao pólo oposto. A carga e a massa das moléculas fazem com que elas migrem em velocidades diferentes e,
portanto, propiciam a separação destas. Como os ácidos nucléicos (DNA e RNA) possuem carga elétrica
negativa eles sempre migrarão em direção ao pólo positivo.
Equipamentos Utilizados:
Microodas
Fonte e Cuba de Eletroforese
Formas e Pentes para montagem do gel
Balança Analítica
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Procedimento:
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Princípio:
Equipamentos Utilizados:
Procedimento:
Vamos utilizar um equipamento de PCR em Tempo Real ( Marca: Life Technologie (modelo: 7500
FAST ou StepOnePlus) e um reagente – fluoróforo – chamado MeltDoctor (Life Technologie).
Para 1 amostra:
10uL – MeltDoctor
1,2 uL Primer Fowarde a 5uM
1,2 uL Primer Reverse a 5uM
4uL do DNA estudado a 5ng/uL
3,6uL de Água MiliQ
1- Colocar todos os reagentes em um tubo tipo eppendorf, menos o DNA , formando um MIX.
2- Colocar 16 ul do MIX em cada poço de uma placa (de acordo com a quantidade de amostra que
você possui) e por ultimo pipetar o DNA (amostra).
3- Dar um SPIN na placa.
4- Colocar a placa no aparelho e programar a corrida no software do computador.
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Princípio:
Essa técnica é usada para estudar os cromossomos de células em metáfase, mas seu principal
uso é nas células em interfase, quando anormalidades numéricas e algumas estruturais podem ser detectadas.
Essa propriedade é de grande valor em estudos sobre câncer, já que um grande número de células pode ser
verificado quanto a anormalidades clonais específicas que podem estar presentes somente em poucas células.
A citogenética em interfase também possui enorme potencial para diagnóstico pré-natal, sendo também um
instrumento valioso para o mapeamento gênico .
A técnica FISH envolve a preparação de sondas específicas de DNA, marcadas pela incorporação de
nucleotídeos quimicamente modificados que são diretamente fluorescentes (método direto) ou podem ser
detectados pela ligação a uma molécula fluorescente (método indireto), visualizados sob luz ultra-violeta. Tais
sondas de cadeias simples de DNA são hibridizadas com os cromossomos metafásicos como nas técnicas
habituais de citogenética, mas também diretamente com os cromossomos de células interfásicas. Após a
sondas viáveis para todos os cromossomos, DNAs satélites e muitos locos específicos envolvidos em doenças,
que podem ser obtidas em Kits pelos laboratórios de citogenética.
Equipamentos Utilizados:
Banho-Maria
Centrifuga
Vortex
Jarras de Coplin
Estufa
Termobrite e Timer
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Procedimento:
7- Digestão Enzimática com Pepsina (pronta para uso) por 8 minutos à temperatura ambiente ( este
tempo é variável em decorrência do tipo e tamanho do tecido)
11- Aplicação da sonda: Colocar 10ul da sonda e incubar no Hibridizador para Denaturação e
Hibridização (tempo e temperatura é variável dependendo da indicação do fornecedor da sonda.
Seguir a Bula da sonda).
12- Cobrir os cortes com lamínula e aplicar selante (Cola Fixogum) em volta e colocar as lâminas no
Termobrite e deixar 20 horas à 37°C (lembrando para verificar na Bula da Sonda)
13- No outro dia “tudo no escuro”: Pré aquecer a solução de 1,5M Ureia/0,1x SSC em banho-maria à
45°C
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