Anda di halaman 1dari 11

INDICE

ULTRACENTRIFUGACION .................................................................................... 3

DEFINICIÓN............................................................................................................ 3

LA ULTRACENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA ...................................................... 4

LA DISPERSIÓN DE LUZ DINÁMICA.- .............................................................. 5

TÉCNICAS .............................................................................................................. 5

CENTRIFUGACIÓN POR GRADIENTE DE EQUILIBRIO. ................................. 5

CENTRIFUGACIÓN POR GRADIENTE DE SACAROSA .................................. 7

TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN .............................................................................. 8

INSTRUCCIONES ................................................................................................... 9

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA.......................................................................... 11
ULTRACENTRIFUGACION

Consiste en someter una mezcla homogeneizada a una velocidad de rotación muy


alta, de forma que, a velocidades más lentas, sedimentan los componentes más
grandes, y a velocidades mayores, los componentes más pequeños. Es decir, que
aunque las masas de diferentes partículas sean muy similares, sedimentan en
tiempos distintos. El instrumento utilizado es la ultracentrífuga.

DEFINICIÓN
Técnica que se utiliza para separar los componentes de una solución según su
peso. El proceso consiste en someter la solución a un campo gravitatorio
suficientemente elevado haciendo girar la muestra a más de 100000 revoluciones
por minuto durante un tiempo prolongado para que los distintos componentes se
ordenen por capas.

La centrifugación diferencial es un procedimiento común en microbiología y


citología, usado para separar ciertos orgánulos de su respectiva célula para un
análisis posterior de partes específicas de las células. En el proceso, primero se
homogeniza una muestra de tejido para romper las membranas celulares y mezclar
los contenidos de las células. Luego, esta mezcla homogénea es sometida a
repetidas centrifugaciones, cada vez removiendo el precipitado, e incrementando la
fuerza centrífuga. Finalmente, la purificación debe ser hecha por la sedimentación
de equilibrio, y la capa deseada es extraída para un futuro análisis.

La separación está basada en el tamaño y la densidad, donde las partículas más


grandes y densas son precipitadas en centrifugaciones de poca fuerza. Por ejemplo,
las células completas no homogenizadas serán precipitadas en centrifugaciones
con poca fuerza y en cortos intervalos como 1,000g por 5 minutos. Los fragmentos
más pequeños de las células y los orgánulos permanecen en el líquido
sobrenadante y requieren más fuerza centrífuga y más tiempo para precipitarse. En
general, uno puede enriquecer (separar o concentrar) los siguientes componentes
de la célula, en orden de separación, con la presente aplicación:
 Células completas y núcleos;
 Mitocondria, lisosomas y peroxisomas;
 Microsomas (vesículas del retículo endoplasmático); y
 Ribosomas y citosoles.

LA ULTRACENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA
consiste en un conjunto de métodos (velocidad y equilibrio de sedimentación) que
permiten la determinación del tamaño, la forma global aproximada, y el grado de
homogeneidad de proteínas y otras macromoléculas biológicas en disolución. Estos
métodos están especialmente adaptados para la detección y la caracterización
cuantitativa de las interacciones (proporción de especies, estequiometría,
reversibilidad y afinidad) que dan lugar a la formación de complejos
macromoleculares, incluyendo las interacciones proteína-proteína, DNA-proteína y
receptor-ligando [Howlett et al. (2006) Curr. Opin. Chem. Biol. 10:430-436; Lebowitz
et al. (2002) Protein Sci. 11:2067-2079; Minton (2000) Exp. Mol. Med. 32:1-5; Rivas
et al. (1999) Methods 19:194-212].
La Dispersión de Luz Dinámica.-
proporciona información rápida y complementaria a la obtenida mediante
ultracentrifugación analítica, aportando dos grandes ventajas frente a otros
métodos analíticos: el bajo volumen de muestra requerido (15-45 µl) y la rapidez
en la obtención de los resultados (<10 min). La técnica permite conocer el grado
de polidispersidad de una muestra, determinar el coeficiente de difusión
traslacional de las especies macromoleculares en disolución y calcular su radio
hidrodinámico. Este equipo (modelo DynaPro MS/X, Wyatt Inc.) tiene un manejo
muy sencillo (cubeta) con un sistema de regulación de la temperatura por Peltier
(4-60ºC) y se puede utilizar para el análisis de diferentes tipos de macromoléculas
como proteínas, polisacáridos, nanopartículas y micelas lipídicas.

TÉCNICAS
Centrifugación por gradiente de equilibrio.
La centrifugación por gradiente de equilibrio, también conocida como centrifugación
por gradiente isopícnico es un tipo de centrifugación ampliamente utilizado en
bioquímica para separar moléculas basado en su punto isopícnico. El método
consiste en centrifugar preparaciones biológicas (u otras preparaciones) a altas
fuerzas g por largos periodos de tiempo en soluciones que contienen cantidades
variadas de una molécula viscosa. Por ejemplo, un gradiente de concentración por
etapas de 0.8Molaridad/1.2M de sacarosa usado en aislamiento por densidad
postsináptica o un gradiente lineal de sacarosa al 20-50% usado en la purificación
de vesículas cubiertas de clatrina (CCVs por sus siglas en inglés).

Sedimentación de equilibrio de densidades (Sedimentación Isopícnica)

La sedimentación isopícnica usa un gradiente de solución como cloruro de cesio o


sacarosa para separar partículas, basándose en sus diferentes densidades
(masa/volumen). Esta es usada como un proceso de purificación en la
centrifugación diferencial. Una solución es preparada con la porción de gradiente
con densidad más alta en el fondo. Después, las partículas a separar son añadidas
al gradiente y luego centrifugadas. Cada partícula es procesada (igualmente arriba
o abajo) hasta que alcance un ambiente de densidad comparable. Este gradiente
de densidad puede ser continuo o preparado paso a paso. Por ejemplo, cuando se
usa sacarosa para preparar gradientes de densidades, uno puede añadir
cuidadosamente una solución de sacarosa al 40% sobre una capa de solución de
sacarosa al 45%, y después, añadir otras capas con menor densidad, sobre las
anteriores. La muestra homogenizada de tejido, preparada en una solución
amortiguadora y centrifugada brevemente para remover el tejido y las células no
homogenizadas, forma una capa superior. Después de la centrifugación,
normalmente de 100,000g por una hora, uno puede observar discos de
componentes celulares que permanecen en el punto de cambio de densidad de una
capa a otra. Ajustando cuidadosamente las densidades de las capas para que
coincida con el tipo de célula, uno puede buscar componentes específicos de la
célula. El cloruro de cesio permite mayor precisión en la separación de partículas
con densidades similares. En efecto, con un gradiente de cloruro de cesio, las
partículas de ADN con isótopos pesados (13C o 15N, por ejemplo)pueden ser
separadas de partículas de ADN sin isótopos pesados.

La centrifugación isopícnica, también conocida como centrifugación por gradiente


de concentración o sedimentación de equilibrio, es una técnica usada para separar
moléculas en la base de la densidad flotante. (La palabra “isopícnica” significa “igual
densidad”). Generalmente, un gradiente de densidad “autogenerable”, es
establecido por la centrifugación isopícnica, y las moléculas analitas se concentran
como bandas donde la densidad de las moléculas iguala a la de la solución a su
alrededor. Para ilustrar el proceso, consideremos la división de ácidos nucleicos
como ADN. Para empezar el análisis, una mezcla de cloruro de cesio y ADN es
situada en la centrífuga por muchas horas a altas velocidades para generar una
fuerza de alrededor de 10^5g (gravedad de la Tierra). El cloruro de cesio es usado
porque a una concentración de 1.6 a 1.8 g/mL, es similar a la densidad del ADN.
Después de algún tiempo, se forma un gradiente de iones de cesio debido a dos
fuerzas opuestas: difusión y fuerza centrífuga. Las partículas en sedimentación
(iones de cesio) se sedimentaran lejos del rotor, y se concentrarán cerca del fondo
del tubo. La fuerza difusiva se presenta debido al gradiente de concentración de
cloruro decesio solvatado, y siempre es dirigida hacia el centro del rotor. El equilibrio
entre esas dos fuerzas genera un gradiente estable de densidad en la solución de
cloruro de cesio, que es más densa cerca del fondo del tubo y menos densa cerca
de la superficie.

Las moléculas de ADN serán separadas, basadas en las diferentes proporciones de


AT (pares de bases nitrogenadas de adenina y timina) respecto a GC (pares de
bases nitrogenadas de guanina y citosina). Un par AT tiene menor peso molecular
que un par GC, por lo tanto, para dos moléculas de ADN de igual tamaño, aquella
con mayor proporción de pares AT, tendrá una densidad menor, siendo los demás
factores iguales. Diferentes tipos de ácidos nucleicos también serán separados en
bandas, por ejemplo, el ARN es más denso que plásmidos de ADN superenrollado,
que es más denso que el ADN lineal cromosómico.

Centrifugación por gradiente de sacarosa


La centrifugación por gradiente de sacarosa es un tipo de centrifugación
comúnmente utilizado para purificar virus encapsulados (con densidades de 1.1-1.2
g/cm3), ribosomas, membranas, etc. Este método también se usa para purificar
exosomas. Existen dos métodos: centrifugación de equilibrio y centrifugación de no
equilibrio. Normalmente en centrifugación de equilibrio, un gradiente de densidad
de sacarosa se crea superponiendo cuidadosamente bajas concentraciones de
sacarosa sobre altas concentraciones en un tubo de centrifugación. Por ejemplo, un
gradiente de sacarosa puede consistir en capas extendiéndose desde un 70% hasta
un 20% de sacarosa en incrementos del 10% (aunque esto es muy variable
dependiendo de la muestra a ser purificada). La muestra que contiene las partículas
de interés es ubicada encima del gradiente y centrifugada a fuerzas que superan
los 150.000 g. Las partículas viajan a través del gradiente hasta el punto en el que
su densidad es igual a la de la sacarosa circundante. Esta fracción puede luego ser
removida y sometida a un análisis adicional. Luego de que sabemos entre cuales
capas se encuentra la fracción requerida, se puede utilizar un montaje simplificado
con estas dos capas únicamente. Una técnica similar es la centrifugación por
colchón de sacarosa, en la cual una mezcla de partículas es precipitada a través de
una capa de sacarosa al 20%, volviendo al reposo al interferir con la solución al
70%, esto permite concentrar las partículas de una muestra. A diferencia de la
centrifugación estándar, la cual en efecto acumula las partículas contra la parte
inferior del tubo, este método no genera estrés mecánico y por ende permite obtener
las partículas morfológicamente intactas. La centrifugación de no equilibrio es muy
similar a la de equilibrio, pero el experimento solo se lleva a cabo hasta un punto
particular. (Tales gradientes pueden llamarse “gradientes de velocidad”). A pesar de
que las partículas con mayor densidad y menor resistencia viajan una mayor
distancia desde la superficie del tubo, la ejecución se detiene antes de alcanzar el
equilibrio. La partícula deseada estará a una distancia fija (ojalá conocida) de la
superficie y tal banda del gradiente es recogida (en ocasiones llamada “fracción”).
Una vez termina la ejecución, la recolección de las partículas se puede realizar por
muchos métodos. Quizá la manera más fácil es eluir la solución de sacarosa
perforando la parte inferior del tubo y solamente se mantiene la parte que contiene
el material o la proteína deseada. También es posible succionar la sacarosa (con
cuidado para que no se mezclen las capas que se formaron en la centrifugación),
dividiendo el material succionado en “fracciones” sucesivas. Estas pueden ser
analizadas por cualquiera de los métodos mencionados para determinar la
distribución del material deseado, lo cual permite escoger la fracción que contiene
dicho material o molécula.

TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN
Centrifugación diferencial: Se basa en la diferencia en la densidad de las
moléculas.1 Esta diferencia debe ser grande para que sea observada al centrifugar.
Las partículas que posean densidades similares sedimentarán juntas. Este método
es inespecífico, por lo que se usa como centrifugación preparativa para separar
componentes en la mezcla (por ejemplo, para separar mitocondrias de núcleos y
membrana) pero no es útil para separar moléculas.

Centrifugación isopícnica: Partículas con el mismo coeficiente de sedimentación se


separan al usar medios de diferente densidad. Se usa para la separación de ADN
con mucha frecuencia.

Centrifugación zonal: Las partículas se separan por la diferencia en la velocidad de


sedimentación a causa de la diferencia de masa de cada una. La muestra se coloca
encima de un gradiente de densidad preformado. Por la fuerza centrífuga las
partículas sedimentan a distinta velocidad a través del gradiente de densidad según
su masa. Se debe tener en cuenta el tiempo de centrifugación ya que si se excede,
todas las moléculas podrían sedimentar en el fondo del tubo de ensayo.

Ultracentrifugación: Permite estudiar las características de sedimentación de


estructuras subcelulares (lisosomas, ribosomas y microsomas) y biomoléculas.
Utiliza rotores (fijos o de columpio) y sistemas de monitoreo. Existen diferentes
maneras de monitorear la sedimentación de las partículas en la ultracentrifugación,
el más común de ellos mediante luz ultravioleta o interferones.

INSTRUCCIONES
El Servicio de Ultracentrifugación Analítica y Dispersión de Luz ha establecido unas
tarifas ajustadas a cubrir mínimamente el uso del equipamiento y su mantenimiento,
que varían dependiendo de la Institución a la que pertenezca el usuario (CSIC,
universidades, centros de investigación ajenos al CSIC y empresas). Las tarifas
incluyen:

 El diseño experimental en los experimentos de Ultracentrifugación analítica.


 La adquisición de los datos.
 Ensamblaje, desmontado y limpieza de celdas de ultracentrifugación.
 Suministro de archivos con datos en crudo.
 Informe detallando la calidad de la muestra (heterogeneidad, grado de
asociación, etc.), coeficiente de sedimentación y masa molecular promedio
(sólo en el método de equilibrio de sedimentación).

El análisis en detalle, la interpretación de los resultados y la preparación de figuras


y texto para su publicación no están incluidas en el servicio, sino que, en caso
necesario, pueden incluirse en la categoría de “colaboración” cuyas condiciones
serán negociadas por adelantado entre el investigador principal del grupo usuario y
el personal del Servicio.
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

 Dr. Carlos Alfonso (carlosa@cib.csic.es). Tel.: 91 837 3112 ext. 4338.


 Correo electrónico del Serviciol: uanalitica@cib.csic.es Tel. 91 837 3112
ext. 4297.

http://www.bbri.org/rasmb/rasmb.html

http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm

http://www.jphilo.mailway.com/

http://www.malvern.com/

http://www.wyatt.com/theory/index.cfm

 Lebowitz, J; Lewis, SM y Schuck, P (2002). «Modern analytical


ultracentrifugation in protein science: A tutorial review». Protein Science 11.

https://es.wikipedia.org/wiki/Ultracentrifugadora

 Gerald Karp, Cell and molecular biology: Concepts and experiments, fourth
edition, 2005, Von Hoffman press
 Roger A. Davis and Jean E. Vance, Structure, assembly and secretion of
lipoproteins, 1996, Elsevier Science B. V.

https://es.wikipedia.org/wiki/Ultracentrifugaci%C3%B3n

 «Molécula» https://es.wikipedia.org/wiki/Centrifugaci%C3%B3n Wikipedia,


la enciclopedia libre. 25 de mayo de 2017. Consultado el 7 de junio de 2017.