ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRECT

ELISA Indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana,
hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya
merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal)
serta antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan
antibody yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi
konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada
permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan
plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan
menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari
suatu sampel yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau
kasein, ditambahkan dalam semua lubang platemikrotiter. Tahap ini dikenal
sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain
ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari
antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan
untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi
non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan
dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan
lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan
dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat
spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/
fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/
elektrokimia lainnya.
 (Gambar Mekanisme Indirect ELISA)

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim
yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian
utama dari metodeindirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik,
sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang platemikrotiter,
sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein
serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
a. Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena
ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara
antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody yang diinginkan
dengan antibody sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya
membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang
diinginkan dengan antibody spesifik tertaut enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :
a. Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di pasar.
b. Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan
enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah berbeda.
c. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa
epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.

Tujuan :
Untuk mengetahui cara pemeriksaan immunologi HCV

Dasar :
Hepatitis adalah suatu proses peradangan difus pada jaringan yang dapat disebabkan oleh
infeksi virus dan oleh reaksi toksik terhadap obat-obatan serta bahan-bahan kimia.
Penyakit Hepatitis C adalah penyakit hati yang disebabkan oleh virus Hepatitis C (HCV=
Hepatitis C virus). Virus Hepatitis C masuk ke sel hati, menggunakan mesin genetik dalam sel
 untuk menduplikasi virus Hepatitis C, kemudian menginfeksi banyak sel lainnya. Kebanyakan
orang yang menderita hepatitis C tidak ingat kapan dan cara mereka terinfeksi, dan juga tidak
merasa menderita penyakit ini. Mereka secara kebetulan terdiagnosis hepatitis C waktu
mengadakan general cek up, karena SGOT dan SGPT-nya sedikit meningkat. Mereka tidak
mempunyai gejala kelainan hepar. Apabila pada penderita hepatitis C timbul gejala, biasanya
ringan dan tidak spesifik. Gejala yang bisa timbul, seperti gejala flu, nafsu makan menurun, gatal-
gatal, agak kembung.

Hasil tes:
- Jika pada garis control terbentuk garis kontrol (C) dan terbentuk di garis tes → Hasil positif.
- Jika pada garis control terbentuk garis kontrol (C) dan tidak terbentuk di garis tes → Hasil negatif.
- Jika tidak terbentuk garis pada garis kontrol (C) tetapi terbentuk di garis tes atau Hasil Invalid

Alat dan bahan :

Alat :

1. Strip

2. Hand sconce

Bahan :

1. Serum pasien terinfeksi HCV

2. Serum pasien yang tidak terinfeksi HCV

Cara kerja :

Pembuatan serum :
1. Darah diambil
2. Diendapkan selama 15 menit
3. Lalu darah tersebut di sentrifuge
4. Didapat serum.

Pemeriksaan HCV :
1. Masukkan strip 1 ke dalam serum pasien tidak terinfeksi HCV dan Serum pasien terinfeksi HCV
2. Hasil dibaca setelah 5 – 10 menit

Hasil :
- Terbentuk garis control dan tidak terbentuk garis tes pada serum pasien yang tidak terinfeksi
Hepatitis C. Hasil Negatif (-)
- Terbentuk garis pada control dan garis tes pada serum pasien yang terinfeksi Hepatitis C. . Hasil
positif (+) .

Kesimpulan :

- Hasil negatif menunjukkan pasien tidak terinfeksi Hepatitis C

- Hasil positif pada menunjukkan pasien terinfeksi Hepatitis C