Anda di halaman 1dari 5

INSTITUO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
“DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL”

BIOQUÍMICA GENERAL

AISLAMIENTO DEL DNA DE ORIGEN VEGETAL Y SU


CARACTERIZACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA, AISLAMIENTO DEL
DNA PLASMIDICO E IDENTIFICACIÓN DEL DNA Y RNA POR
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

AGUIRRE ALVARADO CHARMINA

GARCÍA NIETO JAIME ALAN


MARTINEZ GUTIERREZ JOHAN DANIEL
3FV1
SECCIÓN 3

1
INTRODUCCIÓN.

El acido desoxirribonucleico (DNA) es una molécula muy larga que contiene


muchos miles de desoxirribonucleótidos de cuatro clases distintas, unidos en una
secuencia que es característica para cada organismo y que consta, generalmente
de dos cadenas.
Las funciones del DNA consisten en almacenar la información genética completa,
necesaria para especificar la estructura de todas las proteínas y en cada una de
las clases de RNA del organismo, en programas, tanto el tiempo como en el
espacio, la actividad de un organismo a lo largo de su ciclo vital y finalmente, en
definir la individualidad de una organismo dado.

OBJETIVO.

 Aislar, purificar y caracterizar DNA de guayaba


 Aislar DNA plasmídico bacteriano, comprobando dicho aislamiento mediante
electroforesis en gel de agarosa
 Identificar las bases púricas por cromatografía en capa fina de DNA y RNA
Muestra Rf
RESULTADOS.
Adenina 0.4375

Guanina 0.3717

Citosina 0.3544

Uracilo 0.5696

Timina 0.6282

Citosina 0.3205

Guanina 0.4102
RNA
Adenina 0.4871

Uracilo 0.5769

Citosina 0.3376

Guanina 0.3896
DNA
Adenina 0.4805
Imagen #1: Cromatografía en capa fina
Timina 0.6233

Tabla de resultados de Rf de cromatografía


en capa fina
2
Espectro de absorción del DNA

0.35

0.3

0.25
Absorbancia

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 50 100 150 200 250 300 350
Longitud de onda (nm)

Para calcular concentración

𝐴𝑏𝑠
𝐶= (𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛)
22500

Para concentración de DNA

260𝑛𝑚
𝐶= (6) = 𝟎. 𝟎𝟔𝟗
22500

1A= 50μL de DNA


ANÁLISIS DE RESULTADOS.
0.515nm= x

X=25.75
Aislamiento de DNA de origen μL de DNA
vegetal:

Para poder aislar DNA de guayaba se trituro una muestra y se añadió 5 ml de solución
Tris/EDTA/NaCl la cual se*Nomograma anexo
utilizó para preparar las condiciones regulando el pH que
rompe la pared celular, también fungiendo como agente coagulante (quitando el cofactor y
tomando los iones Mg y protegiendo al DNA.

Posteriormente se agita y se añade 0.3 ml de amilasa que hidroliza enlaces α 1-4 que
degrada carbohidratos como almidón, fructosa, etc. Al dejar incubar, se agregó 5 ml de

3
SDS al 10% que disgrega las grasas en la membrana celular, esto para poder llegar al
núcleo. Al filtrar con la tela “magitel” se purifica el DNA de restos celulares de pared
celular, después al agregar cloroformo-alcohol isoamílico, se solubiliza el DNA y disuelve
compuestos no polares de lípidos filtrados, posteriormente se agita para retirar las
histonas del DNA lo que le confiere una carga (-). Al centrifugar obtenemos tres fases: el
DNA en agua, proteínas (que son las histonas) carbohidratos o lípidos que están en
cloroformo- alcohol isoamílico. Se recupera la fase acuosa donde está el DNA y se vierte
en un frasco que contiene alcohol del 96°, haciendo que flocule el DNA. Una vez
recuperado el DNA se disolvió y se hicieron dos diluciones (1:3,1:2) con solución de NaCl
para leer en espectrofotómetro determinando el espectro de absorción del DNA. Una vez
obtenido el espectro de absorción se cuantifica por tres diferentes métodos obteniendo
0.069 utilizando la absorbancia de 260 nm, 25.75 microlitros de DNA por el segundo
método y al último con el nomograma (que viene anexo al final).

DNA Plasmídico: Para este experimento se utilizó un crecimiento bacteriano el cual fue
centrifugado, se agregó 100µL de solución 1 (Glucosa-Tris-EDTA) el cual fungirá como
agente quelante, inhibiendo las enzimas presentes capturando los iones divalentes,
posteriormente se incubo en hielo y se añadió 200µL de la solución 2 (SDS 1%-NaOH
0.2M) la cual es necesaria para disgregar la pared y que así salga el contenido celular, se
invirtió el tubo 4 veces cuidadosamente para no romper nuestro DNA; se procedió a
agregar 150µL de la solución 3 (Acetato de potasio 5M), para inducir la precipitación de
las proteínas contenidas en la célula y que las cadenas de DNA se cerraran por completo,
una vez realizado este paso procedimos a centrifugar, donde el DNA genómico precipitara
por tener un mayor peso que el DNA plasmídico.

Al sobrenadante obtenido se le agrego 500µL de la solución 4 (isopropanol) para cambiar


la constante dieléctrica, lo cual hace que el DNA (presente en el sobrenadante) precipite,
posteriormente se centrifugo y agregamos 10µL de la solución 5 (regulador tris-EDTA) el
cual es un inhibidor de DNAsas.

Finalmente tomamos una muestra del DNA obtenido y se colocó en el pozo del gel de
agarosa, el cual forma una red con poros definidos por los cuales emigrara el DNA hacia
el cátodo debido a que este presenta carga negativa.

4
Cromatografía en capa fina: Se nos proporcionó pool de DNA y RNA, el cual se podía
interpretar que era una muestra de cada uno, por lo que en la cromatografía se reconocía
cada de uno de los ácidos nucleicos que los conforman. El DNA se caracteriza por la
presencia de la base nitrogenada Timina y en su forma más difundida se presenta como
una doble hélice en las que las bases nitrogenadas complementarias se disponen en el
interior de la cadena. Las cadenas complementarias presentan una dirección inversa y
determinan un hélice que da una vuelta completa cada 10 bases. El RNA presenta Uracilo
en lugar de Timina y está formado por una cadena simple de nucleotidos.

CONCLUSIÓN.

El DNA tiene un componente diferente como lo es la Timina, y el RNA tiene Uracilo.

Se logró aislar el DNA de guayaba obteniendo su espectro de absorción característico y la


concentración del mismo.

BIBLOGRAFIA.

Lehninger, DL Nelson, MM Cox, Principios de Bioquímica (2ª ed), Omega, 1995.


Mathews, C., van Holde, K.E. 2013. Bioquímica. 3ra ed. Pearson Addison Wesley