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Determinación Espectrofotométrica de la Constante de Michaelis-Menten

Calispa Christian; Calderón Gabriel2; Salgado Mario Paulo3; Sisalema Jessica4

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Escuela Politécnica Nacional, Facultad de Ingeniería Química y Agroindustria, Quito, Ecuador

Resumen: En el presente documento se informan de los resultados alcanzados en la determinación

espectrofotométrica de la constante de Michaelis-Menten y la velocidad máxima inicial, por medio de la reacción de
proteólisis de un sustrato específico. Para lo cual se utilizó la cinética enzimática, la misma que estudia la velocidad
de las reacciones cuando presentan enzimas como catalizadores. El modelo cinético enzimático de Michalis-Menten
está basado en la formación del complejo enzima-sustrato, con lo cual se explica la relación entre la velocidad inicial
y la concentración inicial del sustrato. Se prepararon soluciones de BApNA de diferentes concentraciones y una
solución de la enzima con una concentración especifica. Se realizó un blanco y luego, se colocó la alícuota de la
solución tampón, de sustrato y de enzima en la celda, y se colocó en el espectrofotómetro para medir la absorbancia.
Se obtuvo como resultado que gracias a que el sustrato BApNA se hidroliza formando un complejo coloreado que se
puede medir en un espectrofotómetro, sin el catalizador enzimático la absorbancia del sustrato permaneció constante
mientras que el aumentar el catalizador enzimático la absorbancia aumentó linealmente con respecto al tiempo.
Finalmente se comprobó que una enzima proteolítica permite aumentar la reacción de degradación de una proteína,
y la reacción de proteólisis estudiada en la experimentación no se ajustaba al modelo lineal propuesto por Lineweaver-
Burk debido a que la reacción no presenta un comportamiento Michaeliano con un valor R2 de 0,203 y con una
pendiente negativa.
Palabras clave: Catalizador enzimático, Constante de Michelis-Menten, Enzima proteolítica, D

1 1. INTRODUCCIÓN se podía explicar la relación entre la velocidad inicial y la

La cinética enzimática estudia la velocidad de reacciones en
las cuales intervienen enzimas como catalizadores, de esta
manera se puede determinar los mecanismos de reacción y la
especifidad de las enzimas. La velocidad de estas reacciones
se puede medir de manera sencilla tanto con la aparición de
productos o la desaparición de los reactivos, sin embargo,
existen muchos factores que afectan a dicha velocidad como:
el pH, la temperatura, presencia de cofactores, concentraciones
de enzima y sustrato. (González, 2007).
Al medir la concentración de los reactivos o productos en una
reacción enzimática se obtiene la curva de avance de reacción.
En la figura 1 se puede observar una cinética de reacción en
donde la velocidad con la cual aparece el producto va
disminuyendo debido a que con el paso del tiempo el sustrato
se consume. No obstante, este problema se puede evitar al
considerar la velocidad inicial v0, la cual se obtiene de la
pendiente de a tiempos cercanos a cero, ya que en estas
condiciones la concentración del sustrato se puede considerar
constante. (Halvor y Graham, 1980, p. 5).
concentración inicial de sustrato, a través de la idea de que las
reacciones se desarrollaban en dos etapas: una etapa de
formación del complejo enzima-sustrato (ES), y la segunda en
la cual el complejo libera la enzima y el producto, como se
indica en la ecuación 1. (Delgado, 2015).
[1]
La ecuación 1 se conoce como la ecuación cinética de
Michaelis-Menten, en donde 𝑘2 [𝐸]0 es la velocidad máxima
𝑘−1 +𝑘2
(𝑟𝑚á𝑥 ), y se conoce como la constante de Michaelis-
𝑘1
Menten (𝐾𝑀 ). (Izquierdo et al, 2004, p. 272).
𝑘 [𝐸] [𝑆]
𝑟2 = 𝑘−12 +𝑘20 [2]
+[𝑆]
𝑘1
En la figura 2 se puede observar una forma de linealizar la
ecuación cinética de Michaelis-Menten propuesta por
Lineweaver-Burk en donde se grafica el inverso de la
velocidad inicial versus el inverso de la concentración de
sustrato, y de la cual se puede obtener los valores de la
velocidad máxima y la constante 𝐾𝑀 . (Peña et al, 2004, p. 198).

Figura 1. Avance de la reacción enzimática. (González,

2007).
Para explicar el comportamiento cinético de las enzimas, Figura 2. Representación de Lineweaver-Burk. . (González,
Michaelis y Menten, en 1913, desarrollaron una teoría basada 2007).
en el concepto del complejo enzima-sustrato. Con esta teoría

christian.calispa@epn.edu.ec, gabriel.calderon@epn.edu.ec,
mario.salgado@epn.edu.ec, jessica.sisalema@epn.edu.ec
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2. METODOLOGÍA
Se preparó soluciones de BApNA de 3, 5, y 8 11 mg/mL y la
solución de la enzima con una concentración de 5 mg/mL. En
un espectrofotómetro UV-visible HITACHI U-1900 se midió
la absorbancia del blanco, para lo cual se colocó 1000 μL de
solución tampón y 200 μL del sustrato en la celda. Luego, se
colocó 900 μL de tampón, 200 μL de sustrato y 100 μL de
enzima en la celda, y se colocó en el espectrofotómetro para
medir la absorbancia. Para ambos procesos se tomó el valor de
absorbancia cada 15 segundos hasta completar 3 minutos.
Todo el proceso anterior se repitió para las distintas
concentraciones de sustrato BApNA.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La proteólisis es un proceso por el cual una proteína se degrada
para producir aminoácidos. Esta biodegradación es importante
dentro de los seres vivos pues permite mantener un equilibrio
entre la producción y eliminación de proteínas dentro de una
célula. Para agilitar este proceso existen enzimas denominadas
proteasas que reducen la energía de activación necesaria para
romper el enlace peptídico de la proteína (Rodríguez J, 2000,
p. 4). BAPNA es un sustrato sintético que se degrada por
enzimas proteolíticas (especialmente con la tripsina) como se
muestran en la figura 3.
Figura 3. Degradación de BAPNA (Sigma, 2006, p. 1)
Para la experimentación se utilizó un blanco que contenía
únicamente el sustrato y otro que contenía el sustrato y la
enzima. Los resultados obtenidos para la absorbancia en
función del tiempo para la muestra de 3[mg/L] se detallan en
la figura 4.
Figura 4. Absorbancia vs tiempo para 3 [mg/L] de BApNA
El sustrato BApNA se hidroliza formando un complejo
coloreado que se puede medir en un espectrofotómetro a una
longitud de onda de 400 nm. Como se puede observar en la
figura 2, sin actividad enzimática la absorbancia del sustrato
permaneció constante mientras que al agregar 3[mg/L] de
enzima la absorbancia aumentó linealmente con respecto al
tiempo. Este comportamiento fue similar para la absorbancia
con concentraciones de BApNA de 8 [mg/L] y 11 [mg/L].
Esto muestra que sin la enzima la proteólisis no se llevó a cabo.
Al agregar la enzima la hidrólisis empezó a formar el producto
coloreado. Se debe tener en cuenta que únicamente se
utilizaron los datos que seguían una tendencia lineal ya que a
tiempos mayores a un límite dado para cada concentración, la
absorbancia se mantuvo constante. Mediante regresión lineal
se obtuvo la ecuación de ajuste óptimo. La pendiente de esta
recta corresponde a la velocidad inicial de la reacción de
proteólisis tal como lo menciona Muller (2004).
Con los datos de velocidad inicial se calculó la actividad
proteolítica de las muestras. Este valor y la concentración de
sustrato se utilizaron para realizar la gráfica de la ecuación
linealizada de Michaelis y Menten por el método Lineweaver
– Burk la misma que se presenta en la figura 5.
1200
1000
800
y = -223.27x + 786.95
1/AB
600
R² = 0.203
400
200
0
0 1 2 3
1/[S]
Figura 5. Ecuación linealizada de Michaelis y Menten
La figura 3 muestra que la reacción de proteólisis estudiada no
sigue un comportamiento Michaeliano. Esto se puede observar
debido al bajo coeficiente de correlación lineal (R2) y en el
hecho de que la pendiente obtenida debería ser positiva ya que
es una relación entre KM y VMax, valores que nunca pueden ser
menores a cero (Teijón y Garrido, p.72, 2008). Este error pudo
ocurrir al momento de la toma de datos pues tal como lo
mencionan Chow y Peticolas (1948), al trabajar con enzimas
proteolíticas se ha observado que a mayor cantidad de sustrato
la actividad enzimática es mayor, algo que no ocurrió en la
presente experimentación. Se deberían realizar más pruebas
con diferentes concentraciones para reconocer al dato atípico
que causó esta incongruencia.
4. CONCLUSIONES
Se comprobó que una enzima proteolítica permite aumentar la
reacción de degradación de una proteína. Esto sucede sin
importar la cantidad de sustrato y enzima presente en el
sistema.
No se pudo obtener los valores de las constantes de la ecuación
de Michaelis y Menten ya que la reacción de proteólisis
estudiada en la experimentación no se ajustaba al modelo
lineal propuesto por Lineweaver – Burk. El error pudo surgir
en la toma de datos pues a mayor concentración de sustrato la
actividad enzimática debería haber sido mayor cosa que no
sucedió.
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REFERENCIAS

Chow y Peticolas. 1948. A rapid method for the determination

of proteolytic activities of enzyme preparations.
Recuperado de https://goo.gl/HiuknM Diciembre,
2017)
Delgado, F. (2015). Cinética Enzimática. Recuperado de:
https://goo.gl/zXvD8j (Diciembre, 2017).
Gonzalez, J. (2007). Cinética enzimática. Recuperado de:
https://goo.gl/Fg68ST (Diciembre, 2017).
Halvor y Graham. (1980). Cinética Enzimática. Barcelona,
España: Reverte.
Izquierdo, Cunill, Tejero, Iborra y Fité. (2004). Cinética de las
reacciones químicas. (1ra. ed.). Barcelona, España:
Universitat de Barcelona.
Muller W. 2004. Bioquímica. Fundamentos para medicina y
ciencias de la vida. Recuperado de
https://goo.gl/EvxS5h (Diciembre, 2017)
Peña, Arroyo, Gómez, Tapia y Gómez. (2004). Bioquímica.
(2da. ed.). México D.F., México: Limusa.
Rodríguez J. 2000. Proteólisis celular: intercambio proteico.
Recuperado de https://goo.gl/FbfVFK (Diciembre,
2017)
Sigma. 2006. Nα-Benzoyl-D,L-arginine 4-nitroanilide
hydrochloride. Recuperado de https://goo.gl/Qucqgn
(Diciembre, 2017)
Teijón y Garrido. 2008. Bioquímica estructural. Recuperado
de https://goo.gl/am2Gmg (Diciembre, 2017)